本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種用于細(xì)胞檢測mirna155和fen1的熒光傳感器及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、瓣狀核酸內(nèi)切酶-1(flap?endonuclease-,fen1)是一種能特異性剪切雙鏈dna5`-端單鏈突出分支鏈的核酸內(nèi)切酶，其剪切特異性基于獨特的dna分支結(jié)構(gòu)而不依賴序列。fen1廣泛分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，具有穩(wěn)定的剪切活性，在岡崎片段的成熟和堿基切除修復(fù)中有著不可替代的作用。在增生活躍的組織中觀察到fen1的表達(dá)升高，在乳腺癌、肺癌和胃癌的腫瘤細(xì)胞中也有fen1表達(dá)的上調(diào)，提示了fen1在腫瘤發(fā)生中的重要作用。當(dāng)前大多fen1的檢測方法不能檢測活的單細(xì)胞中fen1的表達(dá)水平，僅能檢測腫瘤細(xì)胞裂解液中的fen1活性，而細(xì)胞內(nèi)原位成像的檢測方法多為利用fen1剪切帶有熒光基團的報告探針產(chǎn)生信號，缺少信號放大的步驟，如何更靈敏地反映單個腫瘤細(xì)胞中fen1的表達(dá)水平還有待更進一步的探索。

2、微小rna(micro?rna,mirna)是一類在細(xì)胞生長發(fā)育的遺傳調(diào)節(jié)中有著重要調(diào)節(jié)作用的非編碼小rna。mirna在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，成熟后通過堿基互補配對結(jié)合到相應(yīng)的mrna位點上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。多種mirna與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過檢測mirna的表達(dá)水平可以將腫瘤組織與正常組織區(qū)分開來。在多種mirna序列中，mirna155在許多腫瘤中過表達(dá)，通過抑制細(xì)胞凋亡途徑，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，在乳腺癌，結(jié)腸癌，甲狀腺癌，肺癌等多種實體腫瘤中表達(dá)升高，提示預(yù)后不良。在單細(xì)胞水平檢測mirna155在活細(xì)胞中的表達(dá)水平，對于腫瘤細(xì)胞的區(qū)分和篩選有著重要意義。

3、隨著納米材料和dna編碼技術(shù)的應(yīng)用，在細(xì)胞內(nèi)原位檢測mirna或fen1取得了重大進展。在細(xì)胞內(nèi)檢測fen1可通過納米材料負(fù)載dna探針，經(jīng)過fen1的剪切而產(chǎn)生熒光信號或觸發(fā)后續(xù)的信號放大反應(yīng)。因mirna在細(xì)胞中的表達(dá)量很低，在細(xì)胞內(nèi)原位檢測mirna需要設(shè)計一系列的信號放大策略，常見的等溫擴增方法如滾環(huán)擴增(rolling?circleamplification,rca)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated?isothermal?amplification，lamp)和重組酶聚合酶擴增(recombinase?polymerase?amplification,rpa)等，可實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)微量核酸分子的檢測。雖然目前在mirna或fen1的單獨檢測中取得了顯著的進展，但這些方法大多需要繁瑣的納米材料合成和修飾，或需要多種酶的參與，而且不能在細(xì)胞內(nèi)同步檢測mirna和fen1。而在細(xì)胞內(nèi)同步檢測兩種生物分子的方法中，已有同步檢測mirna和端粒酶的方法，而端粒酶和fen1的酶活性并不相同，這些方法不能滿足mirna和fen1的同步檢測。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于以上所述的技術(shù)，我們設(shè)計了一種雙靶標(biāo)級聯(lián)的檢測方案，在mirna155和fen1同時存在時，由mirna155打開dna發(fā)夾1，再與dna發(fā)夾2結(jié)合后由fen1剪切，去除5`-端分支后形成帶有pam序列的dna雙鏈，激活cas12a并通過反式切割報告探針產(chǎn)生顯著的熒光信號輸出。此方案通過mirna155和fen1的邏輯門控策略，可實現(xiàn)對兩種生物分子更特異的檢測，cas12a的加入保證了穩(wěn)定的信號輸出，有望為區(qū)分腫瘤組織和正常組織，以及探索兩種生物分子的相互作用提供新的思路。

2、與目前的mirna或fen1檢測方法相比，本發(fā)明的益處在于：

3、本方法與細(xì)胞外檢測mirna或fen1的方法相比，可實現(xiàn)細(xì)胞環(huán)境的靶標(biāo)檢測，不破壞細(xì)胞的完整性，能提供更全面直觀的腫瘤細(xì)胞信息。

4、本方法與細(xì)胞內(nèi)單獨檢測mirna或fen1的方法相比，可實現(xiàn)二者的同步檢測。通過mirna啟動dna探針的組裝，形成fen1的剪切產(chǎn)物，再通過crispr/cas12a系統(tǒng)進行信號放大。mirna和fen1的同步檢測，可反應(yīng)更全面的腫瘤信息，提高腫瘤細(xì)胞篩選的特異性，在研究mirna和fen1的相互作用中有著一定的應(yīng)用價值。

技術(shù)特征：

1.一種雙靶標(biāo)級聯(lián)門控激活的crispr/cas12a系統(tǒng)檢測microrna155和fen1，其特征在于，所述的兩個dna發(fā)夾的識別組裝和酶切，通過酶切產(chǎn)物激活cas12a產(chǎn)生熒光信號；dna發(fā)夾1包括mirna155的識別部分、dna發(fā)夾2的隱藏立足點和部分cas12a激活鏈，dna發(fā)夾2包括與dna發(fā)夾1隱藏立足點結(jié)合部分和部分cas12a激活鏈。

2.如權(quán)利要求1所述的級聯(lián)門控激活的crispr/cas12a系統(tǒng)，其特征在于，所述dna發(fā)夾1的核苷酸序列如表1hp1所示。

3.如權(quán)利要求1所述的級聯(lián)門控激活的crispr/cas12a系統(tǒng)，其特征在于，所述dna發(fā)夾2的核苷酸序列如表1hp2所示。

4.如權(quán)利要求1所述的級聯(lián)門控激活的crispr/cas12a系統(tǒng)的制備方法，其特征在與，所述制備方法包括：將dna分別退火后備用，在緩沖體系中加入t4連接酶，加入退火后的dna發(fā)夾，將cas12a與crrna混合孵育后加入上述反應(yīng)體系，加入f-q報告探針，即得所述的級聯(lián)門控激活的crispr/cas12a系統(tǒng)。

5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，退火的溫度為95℃，退火時間為5min。

6.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，孵育溫度為37℃。

7.一種熒光檢測方法，采用權(quán)利要求1所述的一種級聯(lián)門控激活的crispr/cas12a系統(tǒng)和/或權(quán)利要求4所制備得到的熒光體系。

8.如權(quán)利要求6所述的熒光檢測方法，其特征在于，所述測定方法包括：將比色皿用無水乙醇浸泡，再用depc處理水清洗，設(shè)置參數(shù)包括激發(fā)波長、檢測發(fā)射波長、電壓、狹縫、掃描速率等，比色皿中加入depc處理水，進行調(diào)零，將反應(yīng)液加入比色皿中，點擊檢測獲得熒光信號數(shù)值。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明為一種級聯(lián)門控激活的CRISPR/Cas12a系統(tǒng)用于miRNA155和FEN1的同步檢測，該系統(tǒng)包括兩個DNA發(fā)夾的識別組裝和酶切，通過酶切產(chǎn)物激活Cas12a產(chǎn)生熒光信號。DNA發(fā)夾1包括miRNA155的識別部分、DNA發(fā)夾2的隱藏立足點和部分Cas12a激活鏈，DNA發(fā)夾2包括與DNA發(fā)夾1隱藏立足點結(jié)合部分和部分Cas12a激活鏈。本申請中，兩個DNA發(fā)夾在miRNA155的催化下結(jié)合，組裝稱為FEN1酶切底物，可級聯(lián)門控激活CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，僅在兩種靶標(biāo)都存在時產(chǎn)生信號，完成對兩種靶標(biāo)的特異性同步檢測。

技術(shù)研發(fā)人員：顏玉蓉,賈恒軻,吳海平
受保護的技術(shù)使用者：重慶醫(yī)科大學(xué)國際體外診斷研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19