本公開涉及分子生物學(xué)中的品種培育鑒定，具體來(lái)說(shuō)是一種鑒定橡膠樹品種‘云研614’的分子標(biāo)記、引物、試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、橡膠樹（hevea?brasiliensis）作為全球重要的天然橡膠來(lái)源，其種植和產(chǎn)量對(duì)經(jīng)濟(jì)和工業(yè)發(fā)展具有重大影響。云南省作為中國(guó)橡膠樹種植面積、單產(chǎn)和總產(chǎn)都居全國(guó)第一的省份，選育并種植適應(yīng)性強(qiáng)的橡膠樹品種，對(duì)于推動(dòng)我國(guó)橡膠產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展具有不可替代的重要性。特別是在高產(chǎn)、抗寒、抗白粉病等關(guān)鍵性狀的品種培育與種植策略上，更是顯得尤為關(guān)鍵。

2、橡膠樹‘云研614’品種是云南省熱帶作物科學(xué)研究所自主培養(yǎng)的橡膠樹新品種，已于2022年10月申請(qǐng)了植物新品種權(quán)，其申請(qǐng)?zhí)枮椋?0221005624。該品種具有速生、抗寒、抗旱的優(yōu)良性狀，在景洪種植8年離地1m處平均莖圍62cm以上?！蒲?14’的速生性和抗寒性在德宏、臨滄、西雙版納、紅河等地得到試種驗(yàn)證，而且都獲得良好的產(chǎn)量水平。適合種植于重寒區(qū)和中寒區(qū)，在水肥條件充足而氣候溫涼的環(huán)境表現(xiàn)最好。

3、現(xiàn)推廣種植的橡膠樹品種，其遺傳基礎(chǔ)狹窄，加之品種間表型性狀高度相似，傳統(tǒng)的橡膠樹品種鑒定方法主要依賴于形態(tài)學(xué)特征和生理生化指標(biāo)，這些基于表型的鑒定方法容易受到環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致鑒定結(jié)果的不穩(wěn)定性。橡膠樹‘云研614’的表型和其他橡膠樹品種及其相似，從外觀上較難區(qū)分，辨認(rèn)錯(cuò)誤時(shí)有發(fā)生，進(jìn)而引發(fā)品種混雜現(xiàn)象。授權(quán)公布號(hào)為cn?118064428?b的專利公開了一種構(gòu)建橡膠樹dna指紋圖譜的mnp分子標(biāo)記，可以利用600對(duì)mnp引物擴(kuò)增橡膠樹品種的dna指紋圖譜，但對(duì)于單個(gè)品種的鑒定標(biāo)記未明確指出，且該方法需要進(jìn)行高通量測(cè)序才能分析各個(gè)品種的差異，成本相對(duì)較高。

4、因此，開發(fā)周期短、成本低、操作簡(jiǎn)單、針對(duì)橡膠樹單個(gè)品種鑒定的新方法，對(duì)于解決橡膠樹品種混雜，提高橡膠樹產(chǎn)量，保證天然橡膠可持續(xù)發(fā)展意義重大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種鑒定橡膠樹品種‘云研614’的分子標(biāo)記、引物、試劑盒及應(yīng)用。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種鑒定橡膠樹品種‘云研614’的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記的物理位置位于cm021236_1染色體11867535～11867651位堿基；該分子標(biāo)記包括以下4個(gè)堿基多態(tài)性，具體為：

3、第11867552位堿基，堿基為c或a；

4、第11867562位堿基，堿基為t或c；

5、第11867604位堿基，堿基為a或堿基缺失（記為“-”）；

6、第11867626位堿基，堿基為t或c。

7、進(jìn)一步的，所述分子標(biāo)記的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

8、本發(fā)明的第二目的是提供一種用于擴(kuò)增橡膠樹品種‘云研614’分子標(biāo)記的引物對(duì)，所述引物對(duì)序列如seq?id?no.2～3所示。

9、本發(fā)明的第三目的是提供一種用于橡膠樹品種‘云研614’鑒定的試劑盒，所述試劑盒包含用于擴(kuò)增橡膠樹品種‘云研614’分子標(biāo)記的引物對(duì)。

10、本發(fā)明的第四目的是一種鑒定橡膠樹品種‘云研614’的方法，步驟包括：

11、（1）采用植物總dna提取試劑盒提取所有待測(cè)橡膠樹樣本的總dna；

12、（2）以提取的基因組dna為模板，分別利用如seq?id?no.2～3所示引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

13、（3）擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)sanger測(cè)序，獲得測(cè)序數(shù)據(jù)，確定每個(gè)個(gè)體中4個(gè)位點(diǎn)的基因型，4個(gè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因型為aa、cc、-、cc，序列如seq?id?no.5所示，則為‘云研614’品種；否則，則表明待測(cè)橡膠樹樣品為非‘云研614’品種。

14、進(jìn)一步的，所述pcr擴(kuò)增體系為20?μl，包括：50ng/μl?dna模板0.5μl、10×pcrbuffer?2μl、25mm?mgcl2?2μl、10mm?dntps?0.5μl、5u/μl?taq?dna聚合酶0.2μl、10μm上游引物0.5μl、10μm下游引物0.5μl和ddh2o?13.8μl；

15、反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；最后72℃延伸7min。

16、本發(fā)明提供的分子標(biāo)記、引物對(duì)或試劑盒可用于橡膠樹品種：云研614和ian873的區(qū)分與鑒定。

17、本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明提供了一種針對(duì)橡膠樹品種‘云研614’的分子標(biāo)記引物和試劑盒，該技術(shù)能夠特異性地識(shí)別并放大‘云研614’品種的dna序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)其準(zhǔn)確鑒定，有助于提高品種鑒定的準(zhǔn)確性，優(yōu)化品種選擇和區(qū)域適宜性評(píng)估，從而為橡膠樹的種植和育種提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)橡膠產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本發(fā)明分子標(biāo)記、引物對(duì)或試劑盒可用于橡膠樹品種‘云研614’和‘ian873’的區(qū)分與鑒定，操作簡(jiǎn)便，適合大規(guī)模應(yīng)用。

技術(shù)特征：

1.鑒定橡膠樹品種‘云研614’的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記的物理位置位于cm021236_1染色體11867535～11867651位堿基；該分子標(biāo)記包括以下4個(gè)堿基多態(tài)性，具體為：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記的核苷酸序列如seq?idno.5所示。

3.用于擴(kuò)增橡膠樹品種‘云研614’分子標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)序列如seq?id?no.2～3所示。

4.一種用于橡膠樹品種‘云研614’鑒定的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求3所述的引物對(duì)。

5.一種橡膠樹品種‘云研614’的鑒定方法，其特征在于，步驟包括：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述鑒定方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增體系為20?μl，包括：50ng/μl?dna模板0.5μl、10×pcr?buffer?2μl、25mm?mgcl2?2μl、10mm?dntps?0.5μl、5u/μl?taqdna聚合酶0.2μl、10μm上游引物0.5μl、10μm下游引物0.5μl和ddh2o?13.8μl；

7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述分子標(biāo)記或權(quán)利要求3所述引物對(duì)或權(quán)利要求4所述試劑盒在鑒定橡膠樹品種中的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述分子標(biāo)記或權(quán)利要求3所述引物對(duì)或權(quán)利要求4所述試劑盒在鑒定橡膠樹品種中的應(yīng)用，其特征在于，所述橡膠樹品種為：云研614和ian873。

技術(shù)總結(jié)
本公開涉及分子生物學(xué)中的品種培育鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種鑒定橡膠樹品種‘云研614’的分子標(biāo)記、引物、試劑盒及應(yīng)用，所述分子標(biāo)記定位于1號(hào)染色體11867535～11867651位堿基，核苷酸序列如SEQ?ID?No.5所示。本發(fā)明提供了一種針對(duì)橡膠樹品種‘云研614’的分子標(biāo)記引物和試劑盒，該技術(shù)能夠特異性地識(shí)別并放大‘云研614’品種的DNA序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)其準(zhǔn)確鑒定，有助于提高品種鑒定的準(zhǔn)確性，優(yōu)化品種選擇和區(qū)域適宜性評(píng)估，從而為橡膠樹的種植和育種提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)橡膠產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本發(fā)明分子標(biāo)記、引物對(duì)或試劑盒可用于橡膠樹品種‘云研614’和‘IAN873’的區(qū)分與鑒定，操作簡(jiǎn)便，適合大規(guī)模應(yīng)用。

技術(shù)研發(fā)人員：毛常麗,吳裕,張鳳良,牛迎鳳,柳覲,李小琴,楊湉,趙祺,錢蕭然
受保護(hù)的技術(shù)使用者：云南省熱帶作物科學(xué)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10