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      一種活性及耐鹽性改良的β-葡萄糖苷酶突變體D126T及其應(yīng)用

      文檔序號(hào):40360603發(fā)布日期:2024-12-18 13:41閱讀:14來(lái)源:國(guó)知局
      一種活性及耐鹽性改良的β-葡萄糖苷酶突變體D126T及其應(yīng)用

      本發(fā)明涉及基因工程,具體涉及一種活性及耐鹽性改良的β-葡萄糖苷酶突變體及其制備方法和用途。


      背景技術(shù):

      1、纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分,是自然界中豐富的可再生資源,對(duì)其利用有著重要的意義。纖維素在一定條件下被纖維素酶水解成單糖和寡糖,單糖可以通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)各種產(chǎn)品,如飼料、燃料、化工原料、食品、藥品等。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱(chēng),它不是單體酶,而是起協(xié)同作用的多組分酶系,是一種復(fù)合酶,主要由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶(β-d-glucosidase,ec3.2.1.21)等組成。β-葡萄糖苷酶是纖維素水解單糖的關(guān)鍵成員,能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-d-糖苷鍵,釋放葡萄糖。

      2、在纖維素酶組分中β-葡萄糖苷酶含量少、活力低,成為纖維素酶解的瓶頸,目前β-葡萄糖苷酶已經(jīng)得到很大程度的開(kāi)發(fā)與利用,但還是缺少一些優(yōu)質(zhì)高效的β-葡萄糖苷酶,或者降低酶的生產(chǎn)成本。因此,通過(guò)基因重組技術(shù)構(gòu)建工程菌,分泌表達(dá)高活性的β-葡萄糖苷酶對(duì)纖維素有效降解具有重要意義。

      3、高活性的酶具有更快的催化速率。鹽廣泛存在于大自然和各種生產(chǎn)實(shí)踐中,包括食品腌制、制革等,在食品及海產(chǎn)品加工過(guò)程中,利用耐鹽酶可以改善加工產(chǎn)品品質(zhì);氯化鈉具有很好的防腐作用,可在生產(chǎn)過(guò)程中抑制雜菌微生物的生長(zhǎng),防治產(chǎn)品污染,但鹽存在的環(huán)境會(huì)抑制酶的活性及轉(zhuǎn)化效率等,如含鹽環(huán)境的食品加工及防腐、污水處理、飼料及醫(yī)藥等領(lǐng)域中,因此高活性的耐鹽酶可以更好的應(yīng)用于高鹽環(huán)境領(lǐng)域,能大大節(jié)約成本,提高生產(chǎn)效率。


      技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

      1、本發(fā)明的目的是提供一種活性及耐鹽性改良的β-葡萄糖苷酶突變體d126t,改善了現(xiàn)有β-葡萄糖苷酶的理化性質(zhì),豐富了β-葡萄糖苷酶資源庫(kù),在β-葡萄糖苷酶的實(shí)際使用中具有應(yīng)用價(jià)值。

      2、為了達(dá)到上述目的,本發(fā)明提供了一種β-葡萄糖苷酶突變體d126t,該突變體d126t具有如seq?id?no.1所示的氨基酸序列。

      3、本發(fā)明還提供了一種β-葡萄糖苷酶突變體d126t的編碼基因,該編碼基因d126t具有如seq?id?no.2所示的核苷酸序列。

      4、本發(fā)明還提供了一種包含上述編碼基因d126t的重組表達(dá)載體,該重組表達(dá)載體選自原核表達(dá)載體。優(yōu)選pet-28a(+)。

      5、本發(fā)明還提供了一種包含所述的編碼基因d126t的重組表達(dá)菌,該重組表達(dá)菌選自大腸桿菌,優(yōu)選bl21(de3)。

      6、本發(fā)明的另一目的是提供一種所述的活性及耐鹽性改良的β-葡萄糖苷酶突變體d126t在食品、飼料、污水處理、制革及醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用。

      7、本發(fā)明提供的活性及耐鹽性改良的β-葡萄糖苷酶突變體d126t,解決了野生酶比活低、耐鹽性差特性等問(wèn)題,具有以下優(yōu)點(diǎn):

      8、本發(fā)明提供了一種活性及耐鹽性改良的β-葡萄糖苷酶突變體,與野生酶相比,本發(fā)明的突變體d126t的活性及耐鹽性得到改良。純化的野生酶bglpcc1、突變酶d126t的最適ph分別為4.5、5.0,最適溫度分別為45℃、37℃。在正常不加鹽反應(yīng)體系中突變體d126t的酶比活力比野生酶bglpcc1提高8u/mg,是野生酶bglpcc1的1.8倍;在10.0mm和50.0mm的mncl2、mgcl2、licl、cacl2、bacl2、zncl2、mgso4、coso4、niso4金屬鹽中,突變體d126t的酶比活力比野生酶bglpcc1的酶比活力分別高0.6~36u/mg和0.8~42u/mg;在0.5m最適nacl中,突變體d126t酶比活力達(dá)93.5u/mg,比野生酶提高約70u/mg,是野生酶bglpcc1的3.7倍;在0.7m~3m的中高濃度nacl中,突變體d126t酶比活力比野生酶bglpcc1提高21~61u/mg;在0.5m最適kcl中,突變體d126t酶比活力達(dá)81.5u/mg,比野生酶提高約51u/mg,是野生酶bglpcc1的2.6倍;在0.7m~3m的中高濃度kcl中,突變體d126t酶比活力比野生酶bglpcc1提高14~48u/mg。本發(fā)明的突變?chǔ)?葡萄糖苷酶d126t可應(yīng)用于含鹽環(huán)境下的食品加工和飼料添加劑、污水處理、制革及藥品制作等生物技術(shù)領(lǐng)域,可以一定程度上減少污染,降低成本,提高生產(chǎn)效率。



      技術(shù)特征:

      1.一種活性及耐鹽性改良的β-葡萄糖苷酶突變體d126t,其特征在于,該突變體d126t的氨基酸序列由重組野生β-葡萄糖苷酶bglpcc1第126位的天冬氨酸突變?yōu)樘K氨酸獲得,其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

      2.如權(quán)利要求1所述β-葡萄糖苷酶突變體d126t的編碼基因d126t,其特征在于,所述d126t編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

      3.包含如權(quán)利要求2所述編碼基因d126t的重組表達(dá)載體。

      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體,其特征在于,所述重組表達(dá)載體采用pet-28a(+)。

      5.包含如權(quán)利要求2所述編碼基因d126t的重組表達(dá)菌。

      6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)菌,其特征在于,所述重組表達(dá)菌選自bl21(de3)。

      7.如權(quán)利要求1所述的β-葡萄糖苷酶突變體d126t在食品加工及防腐、污水處理、制革、飼料及醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。


      技術(shù)總結(jié)
      本發(fā)明公開(kāi)了一種活性及耐鹽性改良的β?葡萄糖苷酶突變體D126T,該突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示,與氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示的重組野生酶相比,該突變體在低濃度10.0mM、50.0mM的金屬鹽中的活性以及在0.1M~3.0M的NaCl、KCl中的酶活性得到改良。該突變體的活性可以被低濃度金屬鹽與NaCl、KCl不同程度激活,在0.5M最適NaCl條件下突變體D126T酶比活提高至93.5U/mg,與不加鹽的對(duì)照組相比,比活提高約4.3倍;且該突變體的酶比活和野生酶相比相比顯著提高。該D126T能在含鹽環(huán)境的生物技術(shù)領(lǐng)域具有更好的應(yīng)用性。

      技術(shù)研發(fā)人員:周峻沛,邵梓涵,張蕊,黃遵錫,吳倩,楊樂(lè)
      受保護(hù)的技術(shù)使用者:云南師范大學(xué)
      技術(shù)研發(fā)日:
      技術(shù)公布日:2024/12/17
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