本發(fā)明涉及生物工程，具體涉及一種雷帕霉素制備方法。

背景技術(shù)：

1、雷帕霉素是目前世界上最有前途的新型強(qiáng)效免疫抑制劑，其分子結(jié)構(gòu)類似于fk506，是又一種親免疫蛋白結(jié)合劑，可用于器官移植抗排斥作用，它的免疫抑制作用比環(huán)孢菌素強(qiáng)數(shù)十倍，是腎毒性最低的免疫抑制劑，還可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等自身免疫性疾病。1999年9月美國fda正式批準(zhǔn)雷帕霉素作為腎移植的抗排斥藥物投放市場，同時(shí)由cordis公司研發(fā)的以雷帕霉素作為涂層藥物的血管支架cypher已于2002年相繼在歐洲、美國和日本上市。在抗腫瘤方面fda分別在2007、2008、2010和2011批準(zhǔn)其用于腎細(xì)胞癌、套細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性硬化癥和胰腺癌的治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2、杭州中美華東醫(yī)藥股份有限公司已經(jīng)投入工業(yè)化生產(chǎn)(中國專利cn200810019207.8)，在10噸、50噸發(fā)酵罐上培養(yǎng)吸水鏈霉菌發(fā)酵能力在?600mg/l左右。張薇等在《雷帕菌素高產(chǎn)菌株的推理選育與發(fā)酵新工藝研究》?(2009年浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文)一文中公開了菌種選育和培養(yǎng)條件優(yōu)化，在20噸發(fā)酵罐中發(fā)酵能力為700mg/l。

3、姜衛(wèi)紅在《一種提高鏈霉菌雷帕霉素產(chǎn)量的方法》(中國專利?cncn202010084526)專利中，雷帕霉素生產(chǎn)菌中參與三羧酸循環(huán)、脂肪酸合成或芳香族氨基酸合成途徑的一些目標(biāo)基因與該生產(chǎn)菌的雷帕霉素產(chǎn)量密切相關(guān)，通過構(gòu)建質(zhì)粒，將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入雷帕鏈霉菌下調(diào)雷帕霉素生產(chǎn)菌中目標(biāo)基因表達(dá)，優(yōu)化了重組表達(dá)體系以及表達(dá)菌株，設(shè)計(jì)了有效的重組表達(dá)構(gòu)建物，使雷帕霉素表達(dá)量達(dá)到550mg/l、800mg/l、750mg/l。采用生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量提高確實(shí)是一種好的方法，需要專門的設(shè)備和專門的技術(shù)人員，但是對(duì)不具備生物技術(shù)條件的企業(yè)不具有實(shí)施可行性，同時(shí)眾所周知，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性并不太好。

4、趙志全《培養(yǎng)吸水鏈霉菌生產(chǎn)雷帕霉素發(fā)酵液的方法》(中國專利cn201010540111)通過培養(yǎng)基的選擇及培養(yǎng)條件的控制，尤其轉(zhuǎn)速的控制，獲得較高濃度雷帕霉素的發(fā)酵液，在100l發(fā)酵罐中雷帕霉素效價(jià)達(dá)到900mg/l左右。相比基因工程技術(shù)和菌種誘變技術(shù)，通過控制發(fā)酵過程提高雷帕霉素的產(chǎn)量，更具有實(shí)操性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決以上問題，本申請(qǐng)實(shí)施例提供一種雷帕霉素制備方法，通過控制培養(yǎng)基中磷酸根離子濃度、培養(yǎng)基初始ph、在發(fā)酵過程中的特定時(shí)段進(jìn)行發(fā)酵參數(shù)的控制等非常簡單的手段，顯著提升了雷帕霉素發(fā)酵產(chǎn)量和純度，使生產(chǎn)成本大大降低。

2、為了達(dá)到上述目的，本申請(qǐng)實(shí)施例采用的技術(shù)方案如下：

3、第一方面，本申請(qǐng)實(shí)施例提供一種雷帕霉素制備方法，基于發(fā)酵溫度控制將雷帕霉素菌種通過四個(gè)發(fā)酵階段處理得到雷帕霉素發(fā)酵液，對(duì)所述雷帕霉素發(fā)酵液進(jìn)行分離提取，得到雷帕霉素；所述發(fā)酵階段包括第一發(fā)酵階段、第二發(fā)酵階段、第三發(fā)酵階段和第四發(fā)酵階段；所述第一發(fā)酵階段的發(fā)酵溫度為26～30℃，此時(shí)發(fā)酵液ph值為初始ph，所述第二發(fā)酵階段的發(fā)酵溫度為20～24℃，此時(shí)發(fā)酵液ph值降低0.5-1個(gè)ph單位，所述第三發(fā)酵階段的發(fā)酵溫度為25～27℃，此時(shí)發(fā)酵液ph值維持不變，所述第四發(fā)酵階段的發(fā)酵溫度為27～29℃，發(fā)酵液ph值逐漸上升至7.2-7.5。

4、進(jìn)一步的，四個(gè)所述發(fā)酵階段的發(fā)酵環(huán)境為含磷酸鹽發(fā)酵培養(yǎng)基。

5、進(jìn)一步的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的磷酸根離子濃度在0.005%～0.05%。

6、進(jìn)一步的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始ph為6.2-8.0。

7、進(jìn)一步的，四個(gè)所述發(fā)酵階段的溶氧含量大于等于60%。

8、進(jìn)一步的，所述第一發(fā)酵階段的結(jié)束標(biāo)志為：發(fā)酵液中所述雷帕霉素菌濃為10%，出現(xiàn)尺寸小于0.1mm的菌粒。

9、進(jìn)一步的，所述第二發(fā)酵階段的結(jié)束標(biāo)志為：發(fā)酵液中所述雷帕霉素菌濃為20%~25%，菌粒尺寸發(fā)展之0.5mm及以上。

10、進(jìn)一步的，所述第三發(fā)酵階段的結(jié)束標(biāo)志為：發(fā)酵液中所述雷帕霉素菌濃為30%~35%，發(fā)酵液中所述雷帕霉素菌濃基于所述第二發(fā)酵階段進(jìn)行增加10%。

11、進(jìn)一步的，所述第四發(fā)酵階段的結(jié)束標(biāo)志為：菌濃維持于所述第二發(fā)酵階段。

12、本申請(qǐng)實(shí)施例提供的技術(shù)方案中，通過對(duì)雷帕霉素的發(fā)酵過程四個(gè)階段的控制，對(duì)所述雷帕霉素發(fā)酵液進(jìn)行分離提取，得到雷帕霉素。顯著提升了雷帕霉素發(fā)酵產(chǎn)量和純度，使生產(chǎn)成本大大降低。

技術(shù)特征：

1.一種雷帕霉素制備方法，其特征在于，基于發(fā)酵溫度控制將雷帕霉素菌種通過四個(gè)發(fā)酵階段處理得到雷帕霉素發(fā)酵液，對(duì)所述雷帕霉素發(fā)酵液進(jìn)行分離提取，得到雷帕霉素；所述發(fā)酵階段包括第一發(fā)酵階段、第二發(fā)酵階段、第三發(fā)酵階段和第四發(fā)酵階段；所述第一發(fā)酵階段的發(fā)酵溫度為26～30℃，此時(shí)發(fā)酵液ph值為初始ph，所述第二發(fā)酵階段的發(fā)酵溫度為20～24℃，此時(shí)發(fā)酵液ph值降低0.5-1個(gè)ph單位，所述第三發(fā)酵階段的發(fā)酵溫度為25～27℃，此時(shí)發(fā)酵液ph值維持不變，所述第四發(fā)酵階段的發(fā)酵溫度為27～29℃，發(fā)酵液ph值逐漸上升至7.2-7.5；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始ph為6.2-8.0。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雷帕霉素制備方法，其特征在于，四個(gè)所述發(fā)酵階段的發(fā)酵環(huán)境為含磷酸鹽發(fā)酵培養(yǎng)基。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雷帕霉素制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的磷酸根離子濃度在0.005%～0.05%。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雷帕霉素制備方法，其特征在于，四個(gè)所述發(fā)酵階段的溶氧含量大于等于60%。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雷帕霉素制備方法，其特征在于，所述第一發(fā)酵階段的結(jié)束標(biāo)志為：發(fā)酵液中所述雷帕霉素菌濃為10%，出現(xiàn)尺寸小于0.1mm的菌粒。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雷帕霉素制備方法，其特征在于，所述第二發(fā)酵階段的結(jié)束標(biāo)志為：發(fā)酵液中所述雷帕霉素菌濃為20%~25%，菌粒尺寸發(fā)展之0.5mm及以上。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雷帕霉素制備方法，其特征在于，所述第三發(fā)酵階段的結(jié)束標(biāo)志為：發(fā)酵液中所述雷帕霉素菌濃為30%~35%，發(fā)酵液中所述雷帕霉素菌濃基于所述第二發(fā)酵階段進(jìn)行增加10%。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雷帕霉素制備方法，其特征在于，所述第四發(fā)酵階段的結(jié)束標(biāo)志為：菌濃維持于所述第二發(fā)酵階段。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雷帕霉素制備方法。制備方法基于發(fā)酵溫度控制將雷帕霉素通過四個(gè)發(fā)酵階段處理得到雷帕霉素發(fā)酵液，對(duì)所述雷帕霉素發(fā)酵液進(jìn)行分離提取，得到雷帕霉素。本申請(qǐng)實(shí)施例提供的技術(shù)方案中，通過對(duì)雷帕霉素的發(fā)酵過程通過四個(gè)階段的控制，對(duì)所述雷帕霉素發(fā)酵液進(jìn)行分離提取，得到雷帕霉素。顯著提升了雷帕霉素發(fā)酵產(chǎn)量和純度，使生產(chǎn)成本大大降低。

技術(shù)研發(fā)人員：蔡勤,白苗苗,田嘉偉,董定芳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：國藥集團(tuán)川抗制藥有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10