本發(fā)明涉及腫瘤檢測，具體為通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法。

背景技術(shù)：

1、肺癌從最初病變發(fā)展成癌浸潤轉(zhuǎn)移需要5-10年時間，早期發(fā)現(xiàn)不僅治療效果好，其醫(yī)療開支也低。但一旦突破這個階段，隨著病程變長，病變速度加快，治療費用高，效果很差。因此，早期診斷和治療是應對肺癌的最佳方法。由于肺癌早期沒有特異性的臨床表現(xiàn)，雖然有許多腫瘤早期信號出現(xiàn)，但是缺乏高敏感性和特異性的早期診斷技術(shù)，大多數(shù)患者確診時已經(jīng)是癌癥晚期，如常見的磨玻璃為主的肺結(jié)節(jié)，它們的良惡性判斷最主要就是基于胸部ct影像的表現(xiàn)，但是很難給予鑒別，最終診斷往往是在中晚期。

2、腫瘤的早期診斷通常取決于兩個關(guān)鍵因素：檢查指標的高靈敏度和無創(chuàng)、簡便的檢測方法。隨著科技的快速發(fā)展，腫瘤標志物已經(jīng)發(fā)展成為腫瘤診斷和治療的新領(lǐng)域、新的挑戰(zhàn)和希望。腫瘤標志物可在體液或組織中檢測，可反映腫瘤的存在、分化程度、預后估計和治療效果。

3、人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動著血液細胞，體細胞和血液細胞破裂降解后，釋放胞漿中的內(nèi)含物，包括蛋白質(zhì)、外泌體、rna及攜帶有各種遺傳信息的dna片段即cfdna(cellfree?dna)。該類dna片段含有例如突變、缺失、插入、重排、拷貝數(shù)異常、甲基化等異常情況，特別是來自腫瘤基因組的ctdna(circulating?tumordna，循環(huán)腫瘤細胞dna)片段。ctdna由于獲取過程侵犯性低、可多次獲得、還可以觀察動態(tài)變化等被作為液體活檢的重要的檢測樣品。

4、公開號為cn117512115a的發(fā)明公開了一種通過基因甲基化信號預放大提高檢測腫瘤靈敏率的方法，該方法為用亞硫酸氫鹽將樣品cfdna中非甲基化cpg位點進行轉(zhuǎn)化，之后用外側(cè)引物進行第一輪多道pcr擴增，pcr擴增產(chǎn)物純化后，用內(nèi)側(cè)引物和探針進行第二輪pcr擴增，之后計算各個靶基因的dct(△ct)值，判斷樣品為陽性還是陰性。

5、如上述發(fā)明所示，現(xiàn)有的提高檢測腫瘤靈敏率的方法將基因甲基化信號前置放大，以此來提高檢測準確率和靈敏度，但是這種方式在甲基化信號放大不明顯時，不能提高檢測準確率和靈敏度，影響檢測的效率。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法，解決了現(xiàn)有的問題。

2、為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法，包括以下步驟：

3、步驟一：對待檢測組織dna樣本進行修飾處理，得到轉(zhuǎn)化后的dna；

4、步驟二：使用內(nèi)側(cè)引物對，采用多重pcr法對轉(zhuǎn)化后dna進行第一輪擴增，使得擴增的產(chǎn)物序列分別為dna轉(zhuǎn)化的正鏈和負鏈；

5、步驟三：對獲得的第一輪擴增產(chǎn)物進行純化，去除非特異性擴增的小片段dna和二聚體；

6、步驟四：使用外側(cè)引物對純化后的產(chǎn)物進行二次擴增，擴增后進行二次純化；

7、步驟五：將二次擴增后的產(chǎn)物、特異性檢測引物和特異性探針進行rt-pcr反應

8、步驟六：測量腫瘤組織dna甲基化標準品的ct值。

9、優(yōu)選的，所述亞硫酸氫鹽、重亞硫酸氫鹽或肼鹽修飾均可應用于步驟一中的修飾處理，用于將dna樣品中非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，而5’甲基化的胞嘧啶不變，從而區(qū)分甲基化或非甲基化基因片段。

10、優(yōu)選的，所述內(nèi)側(cè)引物包括針對s2的甲基化的dna的正、負鏈分別設(shè)計而成的兩對引物，每對內(nèi)側(cè)引物的5’端使用與外側(cè)引物的3’端互補的20～25個堿基，3’端使用根據(jù)目標靶點外側(cè)的序列所設(shè)計的特異性引物序列。

11、優(yōu)選的，通過所述內(nèi)側(cè)引物的擴增方法為：將所有內(nèi)側(cè)引物放入一個引物池中，在同一個反應體系內(nèi)進行第一輪擴增，同時完成多個靶點基因的擴增。

12、優(yōu)選的，所述外側(cè)引物包括外側(cè)引物f和外側(cè)引物r，所述外側(cè)引物f與illuminamultiplexing?pcr?primer?1.0引物相同，所述外側(cè)引物r采用截斷了3’端的illumina?rnapcr?primer引物。

13、優(yōu)選的，所述特異性pcr檢測引物的序列如下：

14、s-m-f(序列表中序列1)：gatagttaggtaattttcgtttcg；

15、s-m-r(序列表中序列2)：ccttctaacccgacttaaacgacg；

16、a-m-f(序列表中序列3)：gggtggtgatggaggaggtt；

17、a-m-r(序列表中序列4)：taaccaccacccaacacacaat。

18、優(yōu)選的，所述特異性探針的序列如下：

19、s-m-p(序列表中序列5)：fam-gtacgaccccgatcg-mgb；

20、a-m-p(序列表中序列6)：vic-tggattgtgaatttgtg-mgb。

21、優(yōu)選的，所述rt-pcr反應的反應方法，包括以下步驟：

22、s1：在95℃下保持3分鐘；

23、s2：降溫至58℃，保持20秒；

24、s3：升溫至72℃，保持30秒；

25、s4：將步驟s2和步驟s3進行50次循環(huán)；

26、s5：在72℃下保持1分鐘。

27、有益效果

28、本發(fā)明提供了通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法。

29、與現(xiàn)有技術(shù)相比具備以下有益效果：

30、1、該通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法，通過多重pcr技術(shù)和巢式pcr技術(shù)相結(jié)合，除了可以定性的檢測樣本是否出現(xiàn)甲基化，同時可以對甲基化的程度進行定量檢測，不僅能夠?qū)⒒蚣谆盘柗糯?，而且其所需要的檢測樣本起始量超低，測序成本較低，可檢出極其微量的甲基化dna，從而使得早期篩查成為可能。

31、2、該通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法，通過合理選擇特異性的引物，可以進一步增加檢測的靈敏度和特異性，使其能夠檢測到很低的基因甲基化狀態(tài)，同時可排除非cpg區(qū)域甲基化對檢測的影響，剔除低轉(zhuǎn)化片段的干擾，提高檢出率。

技術(shù)特征：

1.通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法，其特征在于：所述亞硫酸氫鹽、重亞硫酸氫鹽或肼鹽修飾均可應用于步驟一中的修飾處理，用于將dna樣品中非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，而5’甲基化的胞嘧啶不變，從而區(qū)分甲基化或非甲基化基因片段。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法，其特征在于：所述內(nèi)側(cè)引物包括針對s2的甲基化的dna的正、負鏈分別設(shè)計而成的兩對引物，每對內(nèi)側(cè)引物的5’端使用與外側(cè)引物的3’端互補的20～25個堿基，3’端使用根據(jù)目標靶點外側(cè)的序列所設(shè)計的特異性引物序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法，其特征在于：通過所述內(nèi)側(cè)引物的擴增方法為：將所有內(nèi)側(cè)引物放入一個引物池中，在同一個反應體系內(nèi)進行第一輪擴增，同時完成多個靶點基因的擴增。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法，其特征在于：所述外側(cè)引物包括外側(cè)引物f和外側(cè)引物r，所述外側(cè)引物f與illuminamultiplexing?pcr?primer?1.0引物相同，所述外側(cè)引物r采用截斷了3’端的illumina?rnapcr?primer引物。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法，其特征在于：所述特異性pcr檢測引物的序列如下：

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法，其特征在于：所述特異性探針的序列如下：

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法，其特征在于：所述rt-pcr反應的反應方法，包括以下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法，本發(fā)明涉及腫瘤檢測技術(shù)領(lǐng)域。該通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法，包括六個步驟，通過多重PCR技術(shù)和巢式PCR技術(shù)相結(jié)合，除了可以定性的檢測樣本是否出現(xiàn)甲基化，同時可以對甲基化的程度進行定量檢測，不僅能夠?qū)⒒蚣谆盘柗糯?，而且其所需要的檢測樣本起始量超低，測序成本較低，可檢出極其微量的甲基化DNA，從而使得早期篩查成為可能，通過合理選擇特異性的引物，可以進一步增加檢測的靈敏度和特異性，使其能夠檢測到很低的基因甲基化狀態(tài)，同時可排除非CpG區(qū)域甲基化對檢測的影響，剔除低轉(zhuǎn)化片段的干擾，提高檢出率。

技術(shù)研發(fā)人員：王楊,馮磊,孟明耀,匡野,郭洋帆,李琳
受保護的技術(shù)使用者：昆明市延安醫(yī)院（昆明市干部療養(yǎng)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19