本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用酶合成麥角硫因的方法。

背景技術(shù)：

1、麥角硫因是一種天然的具有抗氧化作用的氨基酸，廣泛用于食品，化妝品以及醫(yī)藥領(lǐng)域。

2、目前麥角硫因的合成方法有三種分別是提取法、化學(xué)合成法、生物法。提取法利用天然蘑菇發(fā)酵的方法合成麥角硫因，但該方法產(chǎn)量低難提取成本高，難以滿足市場需求?；瘜W(xué)法合成麥角硫應(yīng)則面臨者合成路線冗長，工藝復(fù)雜操作困難等問題。生物法主要利用工程菌發(fā)酵獲取麥角硫因，生產(chǎn)成本低，但是存在生產(chǎn)周期長，產(chǎn)量較低，難以大規(guī)模生產(chǎn)等問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提出一種利用酶合成麥角硫因的方法。

2、為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：

3、一種共表達酶，所述的共表達酶由融合標(biāo)簽與egtb酶融合表達后得到。egtb酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

4、進一步，所述的融合標(biāo)簽為flag。

5、本發(fā)明還提供了一種所述的共表達酶在合成麥角硫因中的應(yīng)用。

6、所述的共表達酶由包括如下步驟的方法制成：

7、步驟1是擴增融合標(biāo)簽和表達egtb酶的重組載體；

8、步驟2是將融合標(biāo)簽組裝到表達egtb酶的重組載體上，并轉(zhuǎn)化到宿主細胞中，然后經(jīng)篩選、搖瓶表達后即得到所述的共表達酶。

9、進一步，所述的步驟2中的組裝步驟使用同源重組酶進行組裝。

10、進一步，所述的步驟2中的宿主細胞為大腸桿菌。

11、本發(fā)明還提供了一種利用酶合成麥角硫因的方法，包括如下步驟：

12、步驟1是以組氨酸甜菜堿為底物，l-半胱氨酸、l-抗壞血酸、七水合硫酸亞鐵、三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽為輔因子，調(diào)節(jié)溶液的ph值，加入所述的共表達酶進行催化反應(yīng)，反應(yīng)完成后得到麥角硫因粗品；

13、步驟2是在所述的麥角硫因粗品中加入硫醇類還原劑與plp，在加熱條件下反應(yīng)，反應(yīng)完成后即得所述的麥角硫因產(chǎn)物。

14、進一步，所述的步驟1中的組氨酸甜菜堿、l-半胱氨酸、l-抗壞血酸、七水合硫酸亞鐵與三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽的摩爾比為1：1-2：0.1-0.5：0.01-0.2：0.1-0.5。

15、優(yōu)選的，所述的步驟1中的組氨酸甜菜堿、l-半胱氨酸、l-抗壞血酸、七水合硫酸亞鐵與三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽的摩爾比為1：1-1.5：0.1-0.25：0.01-0.1：0.1-0.25。

16、更優(yōu)選的，所述的步驟1中的組氨酸甜菜堿、l-半胱氨酸、l-抗壞血酸、七水合硫酸亞鐵與三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽的摩爾比為1：1.25：0.15：0.05：0.15。

17、進一步，所述的步驟1中的組氨酸甜菜堿與共表達酶的質(zhì)量比為1:1-4。

18、優(yōu)選的，所述的步驟1中的組氨酸甜菜堿與共表達酶的質(zhì)量比為1:1-3。

19、更優(yōu)選的，所述的步驟1中的組氨酸甜菜堿與共表達酶的質(zhì)量比為1:2。

20、進一步，所述的步驟1中的調(diào)節(jié)溶液的ph值步驟中溶液的ph值為4.5-5.5；所述的步驟1中的催化反應(yīng)的溫度為20-30℃，時間為2-5小時。

21、優(yōu)選的，所述的步驟1中的調(diào)節(jié)溶液的ph值步驟中溶液的ph值為5-5.5；所述的步驟1中的催化反應(yīng)的溫度為25℃，時間為3.5-4.5小時。

22、更優(yōu)選的，所述的步驟1中的調(diào)節(jié)溶液的ph值步驟中溶液的ph值為5.0。

23、進一步，所述的步驟1中的組氨酸甜菜堿與所述的步驟2中的硫醇類還原劑、plp的摩爾比為1：1-5：0.1-0.5。

24、進一步，所述的步驟2中的硫醇類還原劑為β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇或三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽中的至少一種。

25、優(yōu)選的，所述的步驟1中的組氨酸甜菜堿與所述的步驟2中的硫醇類還原劑、plp的摩爾比為1：1-3：0.1-0.25。

26、更優(yōu)選的，所述的步驟1中的組氨酸甜菜堿與所述的步驟2中的硫醇類還原劑、plp的摩爾比為1：1-2：0.15。

27、進一步，所述的步驟2中的加熱步驟的溫度為30-50℃，時間以為2-10小時。

28、優(yōu)選的，所述的步驟2中的加熱步驟的溫度為37℃，時間以為5-10小時。

29、更優(yōu)選的，所述的步驟2中的加熱步驟的溫度為37℃，時間以為6小時。

30、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢：

31、本發(fā)明所述的利用酶合成麥角硫因的方法將egtb酶序列構(gòu)建到表達載體上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進行異源表達，并通過特定的融合標(biāo)簽與egtb酶融合表達，顯著提高了egtb酶的酶活，從而提高了底物的轉(zhuǎn)化率。

技術(shù)特征：

1.一種共表達酶，其特征在于：所述的共表達酶由融合標(biāo)簽與egtb酶融合表達后得到。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共表達酶，其特征在于：所述的融合標(biāo)簽為flag。

3.權(quán)利要求1或2所述的共表達酶在合成麥角硫因中的應(yīng)用。

4.一種利用酶合成麥角硫因的方法，其特征在于：包括如下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用酶合成麥角硫因的方法，其特征在于：所述的步驟1中的組氨酸甜菜堿、l-半胱氨酸、l-抗壞血酸、七水合硫酸亞鐵與三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽共表達酶的摩爾比為1：1-2：0.1-0.5：0.01-0.2：0.1-0.5。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用酶合成麥角硫因的方法，其特征在于：所述的步驟1中的組氨酸甜菜堿與共表達酶的質(zhì)量比為1:1-4。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用酶合成麥角硫因的方法，其特征在于：所述的步驟1中的調(diào)節(jié)溶液的ph值步驟中溶液的ph值為4.5-5.5；所述的步驟1中的催化反應(yīng)的溫度為20-30℃，時間為2-5小時。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用酶合成麥角硫因的方法，其特征在于：所述的步驟1中的組氨酸甜菜堿與所述的步驟2中的硫醇類還原劑、plp的摩爾比為1：1-5：0.1-0.5。

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用酶合成麥角硫因的方法，其特征在于：所述的步驟2中的硫醇類還原劑為β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇或三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽中的至少一種。

10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用酶合成麥角硫因的方法，其特征在于：所述的步驟2中的加熱步驟的溫度為30-50℃，時間以為2-10小時。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種利用酶合成麥角硫因的方法，包括如下步驟：步驟1是以組氨酸甜菜堿為底物，L?半胱氨酸、L?抗壞血酸、七水合硫酸亞鐵、三（2?羧乙基）膦鹽酸鹽為輔因子，調(diào)節(jié)溶液的pH值，加入所述的共表達酶進行催化反應(yīng)，反應(yīng)完成后得到麥角硫因粗品；步驟2是在所述的麥角硫因粗品中加入硫醇類還原劑與PLP，在加熱條件下反應(yīng)，反應(yīng)完成后即得所述的麥角硫因產(chǎn)物。本發(fā)明所述的利用酶合成麥角硫因的方法將EGTB酶序列構(gòu)建到表達載體上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進行異源表達，并通過特定的融合標(biāo)簽與EGTB酶融合表達，提高EGTB酶的酶活，從而提高了底物的轉(zhuǎn)化率。

技術(shù)研發(fā)人員：楊智
受保護的技術(shù)使用者：云合（天津）生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/12