本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，特別是涉及一種nk細(xì)胞的培養(yǎng)基和制備方法。

背景技術(shù)：

1、nk細(xì)胞是一類對腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)力殺傷作用且mhc非依賴的淋巴細(xì)胞，其對腫瘤細(xì)胞的識別主要依賴于其表面活化性受體和抑制性受體的相互交叉調(diào)控。當(dāng)識別腫瘤細(xì)胞之后，nk細(xì)胞通過釋放殺傷介質(zhì)穿孔素和顆粒酶使靶細(xì)胞凋亡、表達(dá)膜tnf家族分子誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡和抗體依賴的細(xì)胞毒作用等多種途徑殺傷腫瘤細(xì)胞。通過car修飾nk細(xì)胞有望增強(qiáng)其靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的能力并研制出具有強(qiáng)大抗腫瘤作用的效應(yīng)細(xì)胞。

2、市面上最常用的將car基因穩(wěn)定整合至細(xì)胞的方法使采用慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法，目前國內(nèi)外已經(jīng)上市的car?t細(xì)胞藥物中將car基因整合入t細(xì)胞基因組的方法均是采用慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄的方法，但是慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒的在nk細(xì)胞上的感染效率很低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種nk細(xì)胞的培養(yǎng)基和制備方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)nk細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，以完全培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)，所述完全培養(yǎng)基包括如下組分：體積分?jǐn)?shù)85~98%的淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，體積分?jǐn)?shù)2~15%的免疫細(xì)胞血清替代物（sr），終濃度為180~220?iu/ml的?il-2。

3、本發(fā)明還提供所述完全培養(yǎng)基在培養(yǎng)nk細(xì)胞或制備慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑中的用途。

4、本發(fā)明還提供一種nk細(xì)胞的培養(yǎng)方法，所述制備方法包括使用所述完全培養(yǎng)基培養(yǎng)nk細(xì)胞。

5、本發(fā)明還提供一種慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)nk細(xì)胞的方法，所述方法包括如下步驟：將慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒加入至前述培養(yǎng)方法獲得的nk細(xì)胞中，并加入促轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑，培養(yǎng)后獲得已轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的nk細(xì)胞。

6、如上所述，本發(fā)明的nk細(xì)胞的培養(yǎng)基和制備方法，具有以下有益效果：培養(yǎng)基配方結(jié)合促轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑對慢病毒感染nk細(xì)胞的效率有著很大的提高，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，相較于car陽性率較低的培養(yǎng)基配方，最高的培養(yǎng)基配方的car陽性率提高3-4倍，擴(kuò)增倍數(shù)高、nk細(xì)胞純度高、car陽性率顯著增加，大大降低成本，該方法簡單、高效、有利于規(guī)?；a(chǎn)。

技術(shù)特征：

1.如下所述的完全培養(yǎng)基在培養(yǎng)nk細(xì)胞或制備慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑中的用途：以完全培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)，所述完全培養(yǎng)基包括如下組分：體積分?jǐn)?shù)85~98%的淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，體積分?jǐn)?shù)2~15%的免疫細(xì)胞血清替代物，終濃度為100~500?iu/ml的白介素，所述淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基為上海倍諳基生物科技有限公司生產(chǎn)的貨號為fg0103801或rg0101302的hipp-t009?淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述白介素選自終濃度為180~220?iu/ml的il-2。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述完全培養(yǎng)基選自如下任一配方：

4.一種nk細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法包括將il21-41bbl-k562滋養(yǎng)細(xì)胞與nk細(xì)胞共同培養(yǎng)，以活化nk細(xì)胞，再使用如下所述的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)nk細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)，所述完全培養(yǎng)基包括如下組分：體積分?jǐn)?shù)85~98%的淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，體積分?jǐn)?shù)2~15%的免疫細(xì)胞血清替代物，終濃度為100~500?iu/ml的白介素，所述淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基為上海倍諳基生物科技有限公司生產(chǎn)的貨號為fg0103801或rg0101302的hipp-t009?淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述白介素選自終濃度為180~220iu/ml的il-2，或，所述完全培養(yǎng)基選自如下任一配方：

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述il21-41bbl-k562滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量相對于nk細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量是過量的。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，還包括如下特征中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)：

8.一種慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)nk細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：將慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒加入至權(quán)利要求4-7任一所述的培養(yǎng)方法獲得的nk細(xì)胞中，并加入促轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑，培養(yǎng)后獲得已轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的nk細(xì)胞。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述促轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑的使用終濃度為?5-10μg/ml。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)導(dǎo)后培養(yǎng)?7~15天，和/或，轉(zhuǎn)導(dǎo)期間補(bǔ)加完全培養(yǎng)基。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，特別是涉及一種NK細(xì)胞的培養(yǎng)基和制備方法，以培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)，所述培養(yǎng)基包括如下組分：體積分?jǐn)?shù)85~98%的淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，體積分?jǐn)?shù)2~15%的免疫細(xì)胞血清替代物，終濃度為100~500?IU/ml的白介素。培養(yǎng)基配方結(jié)合促轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑對慢病毒感染NK細(xì)胞的效率有著很大的提高，擴(kuò)增倍數(shù)高、NK細(xì)胞純度高、CAR陽性率顯著增加，大大降低成本，該方法簡單、高效、有利于規(guī)?；a(chǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：趙振軍,栗紅建,張丹,趙圓,李朝暉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江蘇譜新生物醫(yī)藥有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10