本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種穩(wěn)轉(zhuǎn)trpa1離子通道的細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和在可降解材料遷出物神經(jīng)疼痛篩查中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、trpa1(transient?receptor?potential?a1)，又稱(chēng)為anktm1，是一種存在于各種組織和器官中的非選擇性陽(yáng)離子通道（story?gm,?a?trp-like?channel?expressed?innociceptive?neurons,?is?activated?by?cold?temperatures.?cell.?2003），它主要表達(dá)于感覺(jué)神經(jīng)元中，如肺、皮膚和大腦中的初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元，以及肽能神經(jīng)元，尤其是哺乳動(dòng)物背根神經(jīng)節(jié)(drg)、三叉神經(jīng)節(jié)(tg)、結(jié)節(jié)神經(jīng)節(jié)(ng)和頸靜脈神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元。此外，trpa1也存在于一些非神經(jīng)元細(xì)胞和組織中，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。trpa1的激活與疼痛調(diào)節(jié)以及炎癥物質(zhì)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。trpa1還與某些非神經(jīng)元區(qū)域的超敏和過(guò)度興奮有關(guān)，并在哮喘、神經(jīng)病理性疼痛、慢性瘙癢、偏頭痛、胃腸運(yùn)動(dòng)障礙、焦慮和認(rèn)知功能障礙的病理生理學(xué)中發(fā)揮重要作用。

2、普通塑料在發(fā)生環(huán)境泄漏后有巨大的環(huán)境污染問(wèn)題，通過(guò)可降解塑料在自然環(huán)境中的可降解性，可以將該類(lèi)環(huán)境污染的影響盡可能降低。但不可避免的，可降解材料在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)使用到增塑劑、擴(kuò)鏈劑等，相關(guān)物質(zhì)的遷出是否會(huì)引起神經(jīng)疼痛目前不得而知。現(xiàn)有的疼痛篩查主要基于動(dòng)物方法進(jìn)行，且鮮有方法針對(duì)可降解材料中的各種可遷出成分進(jìn)行神經(jīng)疼痛的篩查。

3、美國(guó)專(zhuān)利us20150052624a1，通過(guò)在大鼠中編輯與疼痛相關(guān)的基因，從而構(gòu)建大鼠疼痛模型，建模耗時(shí)長(zhǎng)且模型之間個(gè)體差異較大，無(wú)法很好的滿(mǎn)足對(duì)可降解材料中的各種可遷出成分進(jìn)行神經(jīng)疼痛的篩查這一目的。因此，目前迫切需要一種能夠快速準(zhǔn)確進(jìn)行神經(jīng)疼痛篩查的體外替代測(cè)試方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)轉(zhuǎn)trpa1離子通道的細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和在可降解材料遷出物神經(jīng)疼痛篩查中的應(yīng)用。

2、一方面，本發(fā)明提供了一種基于trpa1離子通道的用于可降解材料遷出物神經(jīng)疼痛篩查的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株模型。

3、具體地，所述的trpa1離子通道的編碼基因通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染整合到宿主細(xì)胞染色體上實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)。

4、優(yōu)選地，所述trpa1為人源序列，相對(duì)分子質(zhì)量約為127kda。

5、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述trpa1序列ncbi編號(hào)為：np_015628.2。

6、在本發(fā)明的某些具體實(shí)施例中，所述trpa1的編碼序列ncbi編號(hào)為：nm_007332.3。

7、具體地，所述慢病毒的表達(dá)載體包括但不限于：plvx、plenti?cas9或pcslenti。

8、在本發(fā)明的某些具體實(shí)施例中，上述慢病毒表達(dá)載體購(gòu)買(mǎi)自和元生物。

9、在本發(fā)明的某些具體實(shí)施例中，所述慢病毒的表達(dá)載體為pcslenti。

10、具體地，所述目標(biāo)細(xì)胞包括但不限于：hek293、sh-sy5y或hacat。

11、優(yōu)選地，所述目標(biāo)細(xì)胞為hek293。

12、另一方面，本發(fā)明提供了上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株模型的制備方法。

13、具體地，所述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株模型的構(gòu)建方法包括以下步驟：

14、（1）細(xì)胞培養(yǎng)；

15、（2）質(zhì)粒載體構(gòu)建；

16、（3）病毒包被、收毒；

17、（4）慢病毒滴度的測(cè)試；

18、（5）穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選；

19、（6）穩(wěn)轉(zhuǎn)株功能驗(yàn)證。

20、具體地，步驟（2）中，所述質(zhì)粒載體包括trpa1編碼序列。

21、優(yōu)選地，所述trpa1編碼序列為人源序列，ncbi編號(hào)為：nm_007332.3。

22、具體地，所述質(zhì)粒載體同時(shí)帶有egfp標(biāo)簽及flag標(biāo)簽。

23、具體地，步驟（4）中，所述慢病毒滴度測(cè)試方法包括：熒光計(jì)數(shù)法、qpcr、rt-pcr、流式細(xì)胞術(shù)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒。

24、優(yōu)選地，所述慢病毒滴度測(cè)試方法為：rt-pcr。

25、具體地，步驟（5）中，所述穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選為藥物篩選，所述藥物包括：嘌呤霉素。

26、具體地，步驟（6）中，所述穩(wěn)轉(zhuǎn)株功能驗(yàn)證包括以下步驟：

27、1）提取膜蛋白，檢測(cè)表達(dá)量；

28、2）進(jìn)行苯基三氯化錫和/或三丁基氯化錫細(xì)胞毒性篩查。

29、進(jìn)一步具體地，步驟1）中，檢測(cè)表達(dá)量的方法包括：免疫印跡試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)或免疫組織化學(xué)法。

30、在本發(fā)明的模型具體實(shí)施例中，步驟1）中，檢測(cè)表達(dá)量的方法為免疫印跡試驗(yàn)。

31、再一方面，本發(fā)明提供了上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株模型在可降解材料遷出物神經(jīng)疼痛篩查中的應(yīng)用。

32、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

33、本方法首次構(gòu)建了一種基于trpa1離子通道的用于可降解材料遷出物神經(jīng)疼痛篩查的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株模型，不僅能夠通過(guò)體外測(cè)試進(jìn)行神經(jīng)疼痛篩查，還能夠?qū)G色環(huán)保可降解材料的生物安全性進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估。

技術(shù)特征：

1.一種基于trpa1離子通道的用于可降解材料遷出物神經(jīng)疼痛篩查的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株模型，其特征在于，所述的trpa1離子通道的編碼基因通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染整合到宿主細(xì)胞染色體上實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株模型，其特征在于，所述慢病毒的表達(dá)載體包括：plvx、plenti?cas9或pcslenti。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株模型，其特征在于，所述宿主細(xì)胞包括：hek293、sh-sy5y或hacat。

4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（2）中，所述質(zhì)粒載體同時(shí)帶有egfp標(biāo)簽及flag標(biāo)簽。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（2）中，所述trpa1編碼序列為人源序列，ncbi編號(hào)為：nm_007332.3。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（4）中，所述慢病毒滴度測(cè)試方法包括：熒光計(jì)數(shù)法、qpcr、rt-pcr、流式細(xì)胞術(shù)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（5）中，所述穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選為藥物篩選，所述藥物包括：嘌呤霉素。

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（6）中，所述穩(wěn)轉(zhuǎn)株功能驗(yàn)證包括以下步驟：

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟1）中，檢測(cè)表達(dá)量的方法包括：免疫印跡試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)或免疫組織化學(xué)法。

11.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株模型在可降解材料遷出物神經(jīng)疼痛篩查中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種穩(wěn)轉(zhuǎn)TRPA1離子通道的細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和在可降解材料遷出物神經(jīng)疼痛篩查中的應(yīng)用，涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，所述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株模型為穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TRPA1離子通道的細(xì)胞，可以長(zhǎng)期凍存復(fù)蘇，且保持高表達(dá)狀態(tài)，有利于進(jìn)行可降解材料中遷出物的神經(jīng)疼痛物質(zhì)的篩選，并給出客觀(guān)的相對(duì)值。

技術(shù)研發(fā)人員：程樹(shù)軍,暢俊壯,薄瑞紅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州市華代生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17