本發(fā)明涉及生物，具體地，涉及一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

1、細(xì)菌體內(nèi)存在“限制-修飾”系統(tǒng)，即自身的dna被甲基轉(zhuǎn)移酶修飾，從而避免所產(chǎn)生的限制性內(nèi)切酶對(duì)自身dna片段的切割，達(dá)到抵御外來噬菌體侵染的目的。因此在原核表達(dá)體系中單一的重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶，會(huì)使宿主因基因組dna被切割而死亡。而甲基轉(zhuǎn)移酶在識(shí)別序列上的特異性修飾可防止限制性內(nèi)切酶的切割。限制-修飾基因常緊密連鎖，細(xì)菌通過調(diào)控兩者的表達(dá)，胞內(nèi)相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)與其配對(duì)限制性內(nèi)切酶識(shí)別的相同特定序列進(jìn)行甲基化修飾，并使修飾的dna具有抵抗其限制性內(nèi)切酶切割的特性，保護(hù)宿主dna，降解未被甲基化的外源dna。

2、pvui是一種ii型限制性內(nèi)切酶，來源于普通變形桿菌（proteus?vulgaris），其識(shí)別序列為5'-cgatcg-3'，廣泛應(yīng)用于基因工程研究。傳統(tǒng)的制備方法是從細(xì)菌中直接分離純化pvui限制性內(nèi)切酶，制備周期長、產(chǎn)量低，而且提取出的pvui限制性內(nèi)切酶的活性和穩(wěn)定性不高。

3、在ep0374771a1中僅構(gòu)建了pvui限制性內(nèi)切酶基因重組表達(dá)質(zhì)粒去做表達(dá)，沒有構(gòu)建甲基化保護(hù)酶質(zhì)粒，然，單獨(dú)表達(dá)的pvui會(huì)使宿主因基因組dna被切割而死亡，故而，表達(dá)菌株不能大規(guī)模復(fù)制。因此，尋找合適的pvui甲基化修飾酶對(duì)pvui識(shí)別的dna序列進(jìn)行甲基化保護(hù)在pvui限制性內(nèi)切酶表達(dá)中尤為關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在克服上述缺陷，提供了一種能夠用于限制性內(nèi)切酶pvui表達(dá)時(shí)對(duì)其識(shí)別序列進(jìn)行甲基化保護(hù)的甲基轉(zhuǎn)移酶m.xorii，m.xorii識(shí)別并甲基化pvui的識(shí)別序列5'-cgatcg-3'，因此能夠?qū)ο拗菩詢?nèi)切酶pvui的識(shí)別序列進(jìn)行甲基化修飾，從而避免表達(dá)的限制性內(nèi)切酶pvui切割宿主dna導(dǎo)致宿主不能正常生長。

2、本發(fā)明提供了一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征在于：包含采用甲基轉(zhuǎn)移酶m.xorii對(duì)pvui識(shí)別序列進(jìn)行甲基化保護(hù)的步驟。

3、關(guān)于甲基化保護(hù)的方案可選自：m.xorii甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)pvui識(shí)別序列進(jìn)行甲基化保護(hù)，或者選用其他甲基轉(zhuǎn)移酶如m.afa22mi等均可實(shí)現(xiàn)上述目的。

4、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征還在于：采用含有限制性內(nèi)切酶目的基因的表達(dá)質(zhì)粒，與含有甲基化轉(zhuǎn)移基因的甲基化保護(hù)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行。

5、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征還在于，具體的生產(chǎn)方法如下所示：

6、s1.構(gòu)建pacyc184-m.xorii甲基化保護(hù)酶質(zhì)粒；

7、s2.構(gòu)建pbad-pvui表達(dá)質(zhì)粒；

8、s3.將構(gòu)建成功的pbad-pvui表達(dá)質(zhì)粒與pacyc184-m.xorii甲基化保護(hù)酶質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，篩選出的陽性克隆即為pvui表達(dá)菌株；

9、s4.誘導(dǎo)表達(dá)限制性內(nèi)切酶pvui；

10、s5.純化限制性內(nèi)切酶pvui。

11、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征還在于：上述構(gòu)建pacyc184-m.xorii甲基化保護(hù)酶質(zhì)粒的具體方法為將m.xorii進(jìn)行dna序列大腸桿菌密碼子優(yōu)化,合成引物擴(kuò)增pcr產(chǎn)物無縫克隆到用xbai/kpni酶切好的pacyc184載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建pacyc184-m.xorii甲基化保護(hù)質(zhì)粒。

12、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征還在于：上述構(gòu)建pbad-pvui表達(dá)質(zhì)粒的具體方法為在pvui氨基酸序列c端添加標(biāo)簽，進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化，合成引物擴(kuò)增pcr產(chǎn)物無縫克隆到用bamhi/bsai酶切好的pbad載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建pbad-pvui表達(dá)質(zhì)粒。

13、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征還在于：上述將構(gòu)建成功的pbad-pvui表達(dá)質(zhì)粒與pacyc184-m.xorii甲基化保護(hù)酶質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，篩選出的陽性克隆即為pvui表達(dá)菌株的具體方法為將構(gòu)建成功的pbad-pvui表達(dá)質(zhì)粒與pacyc184-m.xorii甲基化保護(hù)酶質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂布于卡那霉素和氯霉素雙抗lb平板上篩選陽性克隆，陽性克隆含有pbad-pvui和pacyc184-m.xorii兩種質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，這兩種質(zhì)粒均測(cè)序正確，測(cè)序正確的陽性克隆即為pvui的表達(dá)菌株。

14、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征還在于：上述誘導(dǎo)表達(dá)限制性內(nèi)切酶pvui的具體方法為將構(gòu)建好的pvui表達(dá)菌株用無菌的lb液體培養(yǎng)基稀釋后，取稀釋后的菌液涂布于卡那霉素和氯霉素雙抗lb平板，37℃過夜培養(yǎng)；在平板上挑取單克隆接種于含卡那霉素和氯霉素的lb液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至菌液濃度od600不小于0.8；將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到含卡那霉素和氯霉素的lb液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床，培養(yǎng)至菌液濃度od600?不小于?1.2；加入誘導(dǎo)劑，于37℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。

15、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征還在于：上述純化限制性內(nèi)切酶pvui的具體方法為將pvui表達(dá)菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌體經(jīng)高壓裂解、離心、柱層析處理后得到純化的蛋白。

16、本發(fā)明的作用和效果：

17、本發(fā)明提供的一種全新的用于限制性內(nèi)切酶pvui表達(dá)的甲基化保護(hù)方法，采用甲基轉(zhuǎn)移酶m.xorii對(duì)pvui識(shí)別序列進(jìn)行甲基化保護(hù)，成功構(gòu)建了pvui識(shí)別序列甲基化保護(hù)陽性菌株，避免了表達(dá)的限制性內(nèi)切酶pvui切割宿主dna，該甲基化保護(hù)陽性菌株能夠成功應(yīng)用于限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)。利用“限制-修飾”系統(tǒng)可大規(guī)模制備pvui限制性內(nèi)切酶。

18、正常限制性內(nèi)切酶的表達(dá)，需要同時(shí)構(gòu)建一種含有限制性內(nèi)切酶目的基因的表達(dá)質(zhì)粒，一種含有甲基化轉(zhuǎn)移基因的甲基化保護(hù)質(zhì)粒，分別構(gòu)建成功后，先將含有甲基化轉(zhuǎn)移基因的甲基化保護(hù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化er2566感受態(tài)細(xì)胞，再制備成含有甲基化轉(zhuǎn)移基因的甲基化保護(hù)質(zhì)粒的er2566感受態(tài)細(xì)胞，最后將含有限制性內(nèi)切酶目的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有甲基化轉(zhuǎn)移基因的甲基化保護(hù)質(zhì)粒的er2566感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)限制性內(nèi)切酶。

19、但是，在本發(fā)明的研究中發(fā)現(xiàn)，共同轉(zhuǎn)化方法同樣適用于本發(fā)明的生產(chǎn)工藝，在本發(fā)明的工藝中，先分別構(gòu)建成功pacyc184-m.xorii甲基化保護(hù)酶質(zhì)粒和pbad-pvui表達(dá)質(zhì)粒，再將pbad-pvui表達(dá)質(zhì)粒與pacyc184-m.xorii甲基化保護(hù)酶質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化er2566感受態(tài)細(xì)胞，無需先單獨(dú)用pacyc184-m.xorii甲基化保護(hù)酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)化er2566后再制備er2566+pacyc184-m.xorii感受態(tài)細(xì)胞的繁瑣步驟，簡化了共同轉(zhuǎn)化的流程。

技術(shù)特征：

1.一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征在于：包含采用甲基轉(zhuǎn)移酶m.xorii對(duì)pvui識(shí)別序列進(jìn)行甲基化保護(hù)的步驟。

2.如權(quán)利要求1所述的一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征在于：

3.如權(quán)利要求1所述的一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征在于，具體的生產(chǎn)方法如下所示：

4.如權(quán)利要求3所述的一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征在于：

5.如權(quán)利要求3所述的一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征在于：

6.如權(quán)利要求3所述的一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征在于：

7.如權(quán)利要求3所述的一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征在于：

8.如權(quán)利要求3所述的一種限制性內(nèi)切酶pvui的生產(chǎn)方法，其特征在于：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種限制性內(nèi)切酶PvuI的生產(chǎn)方法，其特征在于：包含采用甲基轉(zhuǎn)移酶M.XorII對(duì)PvuI識(shí)別序列進(jìn)行甲基化保護(hù)的步驟。該方法采用甲基轉(zhuǎn)移酶M.XorII對(duì)PvuI識(shí)別序列進(jìn)行甲基化保護(hù)，成功構(gòu)建了PvuI識(shí)別序列甲基化保護(hù)陽性菌株，避免了表達(dá)的限制性內(nèi)切酶PvuI切割宿主DNA，該甲基化保護(hù)陽性菌株能夠成功應(yīng)用于限制性內(nèi)切酶PvuI的生產(chǎn)。利用“限制?修飾”系統(tǒng)可大規(guī)模制備PvuI限制性內(nèi)切酶。

技術(shù)研發(fā)人員：寧光武,王繼宏,程若東,王剛
受保護(hù)的技術(shù)使用者：愷佧生物科技（上海）有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19