本發(fā)明屬于生物，具體設(shè)計一種檢測麻風桿菌的引物探針組合、試劑盒及方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、麻風（leprosy），亦稱漢森病，是由麻風桿菌感染引起的慢性傳染性疾病，主要通過呼吸道與未經(jīng)治療的麻風患者頻繁密切接觸傳播。主要侵犯皮膚及周圍神經(jīng)，若不及時診治，可能導致進行性和永久性殘疾。

2、麻風臨床表現(xiàn)多樣，可模擬皮膚科中多種疾病，初步診斷主要通過皮膚皮損病變、感覺喪失、毛發(fā)脫落、肢體殘疾等癥狀觀察，缺乏特異性表現(xiàn)，組織液抗酸染色和組織病理檢查作為診斷金標準，靈敏度低、耗時、操作難度高，而血清學檢測對于少菌型麻風靈敏度低，且與其他分枝桿菌存在交叉反應(yīng)，不能實現(xiàn)麻風的早期、準確診斷。

3、自1981?年多藥治療方案推行以來，麻風在世界范圍內(nèi)得到了有效控制，麻風患病率及新發(fā)病例數(shù)顯著下降，2013年至2022年期間，全球新發(fā)病例數(shù)下降了19.3%，到2019年下降了6%，但在部分麻風流行區(qū)域發(fā)病率仍然較高。世界衛(wèi)生組織在《2021-2030年全球麻風戰(zhàn)略》中呼吁實現(xiàn)零麻風目標(零疾病、零殘疾、零污名和歧視)，目標是到2030年全球麻風新發(fā)病例減少70%。要達到這個目標，實現(xiàn)麻風患者早期診斷，及早治療顯得尤為重要。

4、隨著核酸檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)已開發(fā)出多種針對麻風桿菌不同靶基因的普通pcr、qpcr及巢式pcr等核酸檢測技術(shù)，qpcr因其靈敏度、特異性高廣泛應(yīng)用于麻風桿菌檢測，但其反應(yīng)時間相對較長，需依賴熱循環(huán)儀、專業(yè)pcr實驗室及專業(yè)人員操作，限制了其在麻風診斷及篩查中的應(yīng)用。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是一種新的dna擴增技術(shù)，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，在鏈置換dna聚合酶(bst?dna?polymerase)的作用下，60℃～65℃恒溫擴增，15～60分鐘左右即可實現(xiàn)109～1010倍的核酸擴增，還可以通過引入兩條環(huán)引物加快反應(yīng)，提高反應(yīng)速度，縮短檢測時間，提高檢測效率，操作簡單，對儀器設(shè)備要求低，結(jié)果判讀簡單，適合基層快速診斷，但是非特異性擴增問題限制了lamp在微生物檢測中的應(yīng)用。雖然現(xiàn)在已建立了幾種麻風桿菌的lamp檢測，但主要以染料法及ph敏感指示劑作為觀察結(jié)果，可能出現(xiàn)非特異性擴增導致假陽性。因此，基于qpcr技術(shù)反應(yīng)時間相對較長，對熱循環(huán)儀器的依賴性、專業(yè)人員及專業(yè)實驗室的需求性，傳統(tǒng)lamp可能存在的假陽性問題，亟需研究出一套麻風桿菌檢測用引物探針組合，以實現(xiàn)麻風桿菌的早期、即時、快速、準確檢測。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明正是為了解決上述問題缺陷，提供一種檢測麻風桿菌引物探針組合、試劑盒、方法和應(yīng)用。本發(fā)明旨在針對麻風桿菌的rlep基因，設(shè)計特定的lamp引物及探針，并以此為基礎(chǔ)建立一種高保真dna聚合酶介導的探針法lamp（hifi-lamp）檢測技術(shù)。此技術(shù)旨在提高麻風桿菌檢測的靈敏度和特異性，同時縮短反應(yīng)時間，為麻風病的早期、快速、準確、即時檢測提供有效方案。

2、本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)。

3、檢測麻風桿菌引物探針組合，所述引物探針組合包括：上游外引物f3、下游外引物b3、上游內(nèi)引物fip、下游內(nèi)引物bip；

4、上游外引物f3：gcggggtttttgttggtg；

5、下游外引物b3：tcctcacactcacgcctg；

6、上游內(nèi)引物fip：cgcgctaatcgtgtccactgc-ggctgactgcctgctttc；

7、下游內(nèi)引物bip：gtcggtggtggatgctgctt-cgatatcgccttcagcacag；

8、上游外引物f3如seq?id?no.1所示；

9、下游外引物b3如seq?id?no.2所示；

10、上游內(nèi)引物fip如seq?id?no.3所示；

11、下游內(nèi)引物如bip如seq?id?no.4所示。

12、進一步為，本發(fā)明所述引物探針組合包括：上游環(huán)狀引物lf：aaagcacacgaagcctcatc、下游環(huán)狀引物lb:?tgttgatgatgccaggggc；

13、上游環(huán)狀引物lf如seq?id?no.5所示；

14、下游環(huán)狀引物lb如?seq?id?no.6所示。

15、進一步為，本發(fā)明所述引物探針組合包括：熒光探針hfman-probe:bhq2-tgttgatgatgccaggggc-cy5，熒光探針hfman-probe?如seq?id?no.7所示。

16、一種試劑盒，所述試劑盒包括上述的引物和熒光探針。

17、本發(fā)明保護所述引物探針組合在特異性檢測麻風桿菌中的應(yīng)用。

18、本發(fā)明檢測麻風桿菌應(yīng)用的方法，包括在64℃下進行50min的hifi-lamp檢測方法，包括使用高保真dna聚合酶和上述引物探針組合，以檢測麻風桿菌。

19、所述的方法的檢測結(jié)果的判定方法：通過實時熒光檢測系統(tǒng)監(jiān)測hifi-lamp反應(yīng)結(jié)果，30分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯“s”型曲線則判定為陽性。

20、本發(fā)明的有益效果為，

21、1）高靈敏度與特異性：通過設(shè)計針對麻風桿菌rlep的lamp引物及探針，結(jié)合高保真dna聚合酶，hifi-lamp技術(shù)顯著提高了檢測的靈敏度和特異性，有效解決了傳統(tǒng)lamp檢測中存在的非特異性擴增導致的假陽性問題。

22、2）快速檢測：hifi-lamp技術(shù)可在30分鐘內(nèi)完成檢測，相較于qpcr技術(shù)，反應(yīng)時間更短，且檢測結(jié)果準確。

23、3）簡便易用：該技術(shù)不依賴特定的熱循環(huán)儀器、專業(yè)的pcr實驗室及專業(yè)操作人員，適用于基層和即時檢測場景。

24、4）應(yīng)用意義：本發(fā)明的hifi-lamp檢測技術(shù)為麻風病的診斷提供了一種有效可靠的方案，有助于麻風病的早期發(fā)現(xiàn)和及時治療，進而為全球麻風的消除作出貢獻。

25、下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明做進一步解釋。

技術(shù)特征：

1.檢測麻風桿菌引物探針組合，其特征在于，所述引物探針組合包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，所述引物探針組合包括：上游環(huán)狀引物lf、下游環(huán)狀引物lb；

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，所述引物探針組合包括：熒光探針hfman-probe；

4.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1、權(quán)利要求2所述的引物和權(quán)利要求3所述的熒光探針。

5.如權(quán)利要求1或2或3所述的引物探針組合在特異性檢測麻風桿菌中的應(yīng)用。

6.如權(quán)利要求5所述的檢測麻風桿菌應(yīng)用的方法，其特征在于，在64℃下進行50min的hifi-lamp檢測方法，包括使用高保真dna聚合酶和上述引物探針組合，以檢測麻風桿菌。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，檢測結(jié)果的判定方法：通過實時熒光檢測系統(tǒng)監(jiān)測hifi-lamp反應(yīng)結(jié)果，30分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯“s”型曲線則判定為陽性。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及檢測麻風桿菌引物探針組合、試劑盒、方法和應(yīng)用，包括六條引物和熒光探針組合。使用本發(fā)明的六條引物和熒光探針組合在檢測麻風桿菌時，具有高靈敏度、特異性的優(yōu)點，且有效解決了傳統(tǒng)LAMP檢測中存在的非特異性擴增導致的假陽性問題。此外，本發(fā)明可在30分鐘內(nèi)完成檢測，反應(yīng)時間更短，且檢測結(jié)果準確。本發(fā)明的HiFi?LAMP檢測技術(shù)為麻風病的診斷提供了一種有效可靠的方案，有助于麻風病的早期發(fā)現(xiàn)和及時治療，進而為全球麻風的消除作出貢獻。

技術(shù)研發(fā)人員：李玉葉,王正芳
受保護的技術(shù)使用者：昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（云南省皮膚病醫(yī)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19