本發(fā)明屬于再生醫(yī)學(xué)和藥物載體，尤其涉及一種納米化牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞囊泡及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下，骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。骨質(zhì)疏松癥及骨折的醫(yī)療和護理，需要投入大量的人力、物力和財力，造成沉重的家庭和社會負(fù)擔(dān)。因此探索并開發(fā)緩解包括骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的骨流失的有效治療方法十分必要。

2、在過去的幾十年里，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal?stem?cells，mscs）因其強大的自我更新、多向分化、免疫調(diào)節(jié)能力，以及不存在倫理爭議等優(yōu)點成為再生醫(yī)學(xué)的主要種子細(xì)胞。其中，牙源性mscs又因易獲得，阻生智齒、正畸拔除的前磨牙、脫落乳牙等醫(yī)療丟棄組織均為其重要來源，具有無醫(yī)源性創(chuàng)傷的優(yōu)勢而備受關(guān)注。然而，mscs的局部和全身應(yīng)用存在局限性和副作用，例如，mscs體內(nèi)轉(zhuǎn)運到靶組織的效率有限，可導(dǎo)致肺栓塞和腫瘤形成的風(fēng)險增加等，這些導(dǎo)致其臨床轉(zhuǎn)化受到阻礙。因此，迫切需要開發(fā)mscs的替代產(chǎn)品，既保留mscs的有益特性，又減輕其不良影響。

3、由mscs分泌的細(xì)胞外囊泡（evs）是mscs旁分泌途徑的一部分，可以繼承親本細(xì)胞的特性的同時避免干細(xì)胞療法的缺陷，并且可以高效遞送內(nèi)源性蛋白質(zhì)、核酸以及外源性藥物到目標(biāo)組織或細(xì)胞發(fā)揮治療作用。然而傳統(tǒng)的細(xì)胞外囊泡制備方法存在制備過程繁瑣、產(chǎn)量有限、制備的細(xì)胞外囊泡純度較低等一個或者多個技術(shù)問題。

4、因此，非常有必要提供一種納米化牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞囊泡及其制備方法和應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的一個或者多個技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種納米化牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞囊泡及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明獲得的囊泡產(chǎn)量高、純度高，具有高效的骨組織靶向性，能夠延長藥物的體內(nèi)循環(huán)時間，增強骨再生能力。

2、本發(fā)明在第一方面提供了一種納米化牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞囊泡的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：

3、（1）獲得牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞；

4、（2）往牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞中加入化學(xué)囊泡刺激劑后置于co2恒溫培養(yǎng)箱中進行刺激，得到牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞巨型質(zhì)膜囊泡溶液；所述化學(xué)囊泡刺激劑包含緩沖液、二硫蘇糖醇水溶液和多聚甲醛溶液，所述緩沖液包含氯化鈉8.5~9g/l、二氯化鈣0.2~0.24g/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.3~2.4g/l和去離子水；

5、（3）將牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞巨型質(zhì)膜囊泡溶液使用脂質(zhì)體擠出器過聚碳酸酯膜反復(fù)擠出，得到粒徑不大于200nm的納米化牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞囊泡。

6、優(yōu)選地，在步驟（1）中，所述牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得方法為：將牙周膜組織或牙髓組織進行消化與離心，棄上清，然后加入含有胎牛血清和青霉素-鏈霉素的α-mem培養(yǎng)基并混合均勻，再經(jīng)co2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至原代干細(xì)胞達(dá)到80%~90%融合后，用胰蛋白酶-edta消化液消化并按照1:2或1:3的比例培養(yǎng)擴增至p4~p6代，獲得牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞。

7、優(yōu)選地，所述α-mem培養(yǎng)基中含有胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)為10~20%，所述α-mem培養(yǎng)基中含有青霉素-鏈霉素的體積分?jǐn)?shù)為0.8~1.2%；所述co2恒溫培養(yǎng)箱中含有co2的體積分?jǐn)?shù)為5%，所述co2恒溫培養(yǎng)箱的溫度為37℃，濕度為100%；和/或所述胰蛋白酶-edta消化液為含有0.25wt%的胰蛋白酶和0.1wt%的edta的消化液。

8、優(yōu)選地，在步驟（2）中：所述二硫蘇糖醇水溶液的濃度為150~160mg/ml；所述多聚甲醛溶液為4%多聚甲醛固定液；和/或所述緩沖液、所述二硫蘇糖醇水溶液和所述多聚甲醛溶液的體積比為1000：（1.5~2.5）：（16~20）。

9、優(yōu)選地，在步驟（2）中：所述二硫蘇糖醇水溶液的濃度為154mg/ml；所述緩沖液、所述二硫蘇糖醇水溶液和所述多聚甲醛溶液的體積比為1000:2:18；和/或所述緩沖液包含氯化鈉8.75g/l、二氯化鈣0.22g/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38g/l和去離子水。

10、優(yōu)選地，在步驟（2）中：所述co2恒溫培養(yǎng)箱中含有co2的體積分?jǐn)?shù)為5%，所述co2恒溫培養(yǎng)箱的溫度為37℃，濕度為100%；所述刺激的時間為18~30h；和/或所述化學(xué)囊泡刺激劑的加入量為每平方厘米的牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞加入18~25微升的化學(xué)囊泡刺激劑；和/或所述牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞巨型質(zhì)膜囊泡溶液中的牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞巨型質(zhì)膜囊泡的粒徑為5~28μm，牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞巨型質(zhì)膜囊泡的濃度為6.0×106~6.7×106個/ml。

11、優(yōu)選地，在步驟（3）中：反復(fù)擠出的次數(shù)為8~12次；和/或所述聚碳酸酯膜為孔徑為200nm的聚碳酸酯膜。

12、優(yōu)選地，在步驟（3）中：在使用脂質(zhì)體擠出器過聚碳酸酯膜反復(fù)擠出之前，先將牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞巨型質(zhì)膜囊泡溶液與dpp4抑制劑進行混合。

13、本發(fā)明在第二方面提供了由本發(fā)明在第一方面的制備方法制得的納米化牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞囊泡。

14、本發(fā)明在第三方面提供了由本發(fā)明在第一方面所述的制備方法制得的納米化牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞囊泡在骨組織修復(fù)材料中的應(yīng)用。

15、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比至少具有如下有益效果：

16、（1）本發(fā)明通過化學(xué)囊泡刺激劑從牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞中生成和分離出牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞巨型質(zhì)膜囊泡，再經(jīng)聚碳酸酯膜反復(fù)擠出，得到了具有納米尺寸的牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞囊泡，本發(fā)明方法相比于從細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取細(xì)胞外囊泡的傳統(tǒng)方法，可以獲得更高產(chǎn)量和更高純度的囊泡，本發(fā)明采用的化學(xué)囊泡刺激劑包含的多聚甲醛溶液能夠誘導(dǎo)細(xì)胞膜中蛋白質(zhì)的非特異性交聯(lián)，包含的二硫蘇糖醇能夠作為小分子還原劑切割硫酯鍵，促進細(xì)胞膜發(fā)泡形成牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞巨型質(zhì)膜囊泡gpmv并脫落到上清中；同時，所述化學(xué)囊泡刺激劑包含的緩沖液中具有鈣離子ca2+，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在ca2+存在的條件下，細(xì)胞暴露于多聚甲醛溶液和二硫蘇糖醇溶液中，可以使得連續(xù)的ca2+流入，有利于促進細(xì)胞質(zhì)膜起泡，本發(fā)明中采用的化學(xué)囊泡刺激劑可以使得本發(fā)明生產(chǎn)的牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞巨型質(zhì)膜囊泡gpmv不包含細(xì)胞骨架或核物質(zhì)，而直接對細(xì)胞膜進行擠出或裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞膜，不可避免的會受到細(xì)胞器或核物質(zhì)的污染，因此相比于其他細(xì)胞膜囊泡的生產(chǎn)方法，本發(fā)明方法產(chǎn)生了更為純凈的細(xì)胞膜囊泡。

17、（2）本發(fā)明制得的納米化牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞囊泡具有類似mscs的同源靶向性，靶向骨組織，在體內(nèi)轉(zhuǎn)運到靶組織的效率高，并且能夠延長藥物的體內(nèi)循環(huán)時間，實現(xiàn)藥物在骨組織中的靶向遞送和緩釋，從而增強骨再生能力。

技術(shù)特征：

1.一種納米化牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞囊泡的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟（1）中，所述牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得方法為：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟（2）中：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，在步驟（2）中：

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟（2）中：

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟（3）中：

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟（3）中：

9.由權(quán)利要求1至8中任一項所述的制備方法制得的納米化牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞囊泡。

10.由權(quán)利要求1至8中任一項所述的制備方法制得的納米化牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞囊泡在骨組織修復(fù)材料中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種納米化牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞囊泡及其制備方法和應(yīng)用，屬于再生醫(yī)學(xué)和藥物載體技術(shù)領(lǐng)域。所述方法為：獲得牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞；加入化學(xué)囊泡刺激劑后置于CO<subgt;2</subgt;恒溫培養(yǎng)箱中進行刺激，得到牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞巨型質(zhì)膜囊泡溶液；使用脂質(zhì)體擠出器過聚碳酸酯膜反復(fù)擠出，得到粒徑≤200nm的納米化牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞囊泡；化學(xué)囊泡刺激劑包含緩沖液、二硫蘇糖醇水溶液和多聚甲醛溶液，緩沖液包含氯化鈉8.5~9g/L、二氯化鈣0.2~0.24g/L、4?羥乙基哌嗪乙磺酸2.3~2.4g/L和水。本發(fā)明獲得的囊泡產(chǎn)量高、純度高，具有高效的骨組織靶向性，能夠延長藥物的體內(nèi)循環(huán)時間，增強骨再生能力。

技術(shù)研發(fā)人員：余婷婷,王經(jīng)緯,魏耀華,白如水,趙瑞芳,韓冰,聶廣軍
受保護的技術(shù)使用者：北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17