本發(fā)明屬于生物合成領(lǐng)域，具體涉及一種通過酶催化制備（β,s）構(gòu)型玻色因的方法及工程菌。

背景技術(shù)：

1、玻色因是一種常用于化妝品的功能性原料，inci名稱為羥丙基四氫吡喃三醇。它可以促進(jìn)人體真皮層糖胺聚糖的合成，促進(jìn)蛋白聚糖的產(chǎn)生以及膠原蛋白的再生。糖胺聚糖、蛋白聚糖和膠原蛋白都是細(xì)胞外基質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)成分，對于維持皮膚的緊致度、均勻度、光滑度、彈性，保持皮膚健康狀態(tài)非常關(guān)鍵。皮膚衰老的外在表現(xiàn)為皮膚變薄、皮膚松弛、失去彈性、皺紋加深，在對于皮膚衰老的研究中，發(fā)現(xiàn)自然衰老的皮膚與光老化的皮膚均存在糖胺聚糖和蛋白聚糖的不同水平下降。使用添加玻色因的化妝品可以促進(jìn)表皮更新，強(qiáng)韌皮膚結(jié)構(gòu)，緊致肌膚，改善皺紋，增加皮膚光澤和彈性，因此玻色因被譽(yù)為護(hù)膚界的“抗老三巨頭”之一，也被廣泛應(yīng)用于大牌產(chǎn)品的面霜、精華液等產(chǎn)品中。

2、玻色因是一種β-木糖衍生物，最初是由歐萊雅公司開發(fā)的。它的分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)手性碳原子，其母核上的手性碳原子的空間排列相對固定，而糖苷配基(羥基丙烷)中的7號(hào)位碳原子產(chǎn)生了兩種不同構(gòu)型，分別是（β,s）和（β,r）這兩種非對映異構(gòu)體（如圖1所示）。研究表明，（β,s）構(gòu)型的生物活性要好于（β,r）構(gòu)型，而且（β,s）構(gòu)型的細(xì)胞毒性要比（β,r）構(gòu)型更弱。玻色因的常規(guī)生產(chǎn)工藝為化學(xué)合成，采用木糖為原料，與乙酰丙酮在堿性水溶液中發(fā)生縮合反應(yīng)，再經(jīng)硼氫化鈉作用還原酮羰基，獲得玻色因。通過化學(xué)合成工藝生產(chǎn)的玻色因是兩種構(gòu)型的混合物，（β,s）構(gòu)型和（β,r）構(gòu)型的比例通常在3:7~5:5，并且所使用的乙酰丙酮具有中等毒性，其蒸氣與空氣混合，能形成爆炸性混合物。cn?117510446?a公開了一種玻色因的制備方法，以d-木糖為起始原料，首先與乙酰丙酮反應(yīng)得到丙酮基四氫吡喃三醇，然后在廉價(jià)催化劑的存在下進(jìn)行羰基還原反應(yīng)，得到s構(gòu)型:r構(gòu)型＝50:50～55:45的羥丙基吡喃三醇，其催化反應(yīng)過程需要使用氫氣和高溫高壓條件?，F(xiàn)有技術(shù)中也有利用酶法合成（β,s）構(gòu)型玻色因的報(bào)道，但所使用的酶無法回收重復(fù)使用，不利于連續(xù)化生產(chǎn)。因此，開發(fā)一種安全環(huán)保、可連續(xù)化進(jìn)行的（β,s）構(gòu)型玻色因生產(chǎn)工藝，對于玻色因的大規(guī)模生產(chǎn)和市場應(yīng)用具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提出了一種通過酶催化制備（β,s）構(gòu)型玻色因的方法及工程菌。

2、本發(fā)明首先提供了一種用于酶催化制備（β,s）構(gòu)型玻色因的工程菌的構(gòu)建方法，其包括：

3、s1：設(shè)計(jì)序列如seq?id?no.1所示的改進(jìn)羰基還原酶編碼基因；設(shè)計(jì)序列如seq?idno.2所示的改進(jìn)甲酸脫氫酶編碼基因；將改進(jìn)羰基還原酶編碼基因和改進(jìn)甲酸脫氫酶編碼基因插入載體pet-28a(+)的第5070位和第5234位之間，且改進(jìn)羰基還原酶編碼基因位于改進(jìn)甲酸脫氫酶編碼基因的上游，獲得重組載體pet-28a（+）-lsadh-psfdhmut；

4、s2：將重組載體pet-28a（+）-lsadh-psfdhmut熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21（de3）感受態(tài)細(xì)胞，得到共表達(dá)羰基還原酶lsadh和甲酸脫氫酶psfdhmut的重組菌株bl21（de3）/pet-28a（+）-lsadh-psfdhmut。

5、本發(fā)明還提供了一種所述方法構(gòu)建的工程菌。并進(jìn)一步提供了所述的工程菌或其發(fā)酵產(chǎn)物在酶催化制備（β,s）構(gòu)型玻色因中的應(yīng)用。

6、本發(fā)明還提供了一種酶催化制備（β,s）構(gòu)型玻色因的方法，其包括如下步驟：

7、1）對所述工程菌進(jìn)行培養(yǎng)，對培養(yǎng)后菌體進(jìn)行破碎，分離純化得到羰基還原酶lsadh和甲酸脫氫酶psfdhmut；

8、2）配制海藻酸鈉溶液，加入所得羰基還原酶lsadh和甲酸脫氫酶psfdhmut酶液，其中羰基還原酶與甲酸脫氫酶的酶活之比為1:1~1:2，雙酶終濃度之和為2~5mg/ml；

9、將上述混合酶液滴加到與混合酶液等體積的殼聚糖和氯化鈣混合溶液中，進(jìn)行攪拌形成凝膠小球，再將凝膠小球靜置固化，制得羰基還原酶lsadh和甲酸脫氫酶psfdhmut共固定化酶；

10、3）利用包含所述共固定化酶的反應(yīng)體系進(jìn)行（β,s）構(gòu)型玻色因的制備，反應(yīng)條件為攪拌轉(zhuǎn)速300~500rpm，反應(yīng)溫度35~40℃，反應(yīng)時(shí)間6~8h；

11、反應(yīng)體系包含磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液10~50mm、15~30g/l共固定化酶、800~1000mm?β-丙酮木糖苷、1.5~2.5mm甲酸鈉、0.5~1mm輔酶nadp+。

12、進(jìn)一步的，所述步驟3）中，共固定化酶重復(fù)使用進(jìn)行（β,s）構(gòu)型玻色因的合成反應(yīng)。

13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有如下有益效果：

14、（1）本發(fā)明通過共固定化羰基還原酶lsadh和甲酸脫氫酶psfdhmut雙酶體系催化制備玻色因，催化反應(yīng)選擇性高，所獲得的產(chǎn)物為純（β,s）構(gòu)型，使得產(chǎn)物在功效活性和安全性上均優(yōu)于現(xiàn)有的化學(xué)合成工藝。共固定化羰基還原酶lsadh和甲酸脫氫酶psfdhmut的穩(wěn)定性好，可重復(fù)使用，有利于連續(xù)化生產(chǎn)和降低成本。

15、（2）本發(fā)明所采用的催化反應(yīng)在常溫常壓中性環(huán)境中進(jìn)行，避免了化學(xué)合成工藝中的高溫高壓反應(yīng)條件和堿性環(huán)境，降低了對于反應(yīng)設(shè)備和工藝操作的要求，減少了設(shè)備投入和能耗。

16、（3）本發(fā)明所采用的催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率＞99%，使用的底物β-丙酮木糖苷和甲酸鈉安全性高，并通過對甲酸脫氫酶進(jìn)行突變改造，使其能夠特異性催化輔酶nadp＋的循環(huán)再生，顯著的提高了產(chǎn)物（β,s）玻色因的合成效率，副產(chǎn)物為無毒無害且易于揮發(fā)的二氧化碳，不會(huì)殘留在反應(yīng)體系中對產(chǎn)物的分離純化造成影響。因此本發(fā)明提出的玻色因制備方法，不論在成本方面還是安全環(huán)保方面均具有顯著優(yōu)勢。

技術(shù)特征：

1.一種用于酶催化制備（β,s）構(gòu)型玻色因的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述改進(jìn)羰基還原酶編碼基因采用方法設(shè)計(jì)：對leifsonia?sp.?s749來源的羰基還原酶編碼基因lsadh進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化，并在其對應(yīng)的氨基酸序列的n端和c端加上組氨酸標(biāo)簽序列，lsadh基因的genbank登錄號(hào)：ab213459。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述改進(jìn)甲酸脫氫酶編碼基因采用方法設(shè)計(jì)：對pseudomonas?sp.?101來源的甲酸脫氫酶編碼基因psfdh進(jìn)行5個(gè)位點(diǎn)的突變設(shè)計(jì)以及大腸桿菌密碼子優(yōu)化，并在其對應(yīng)的氨基酸序列的n端加上strep標(biāo)簽，在其對應(yīng)的氨基酸序列的起始密碼子前面加上rbs序列和間隔序列；其中，所述5個(gè)位點(diǎn)的突變設(shè)計(jì)分別為a207g、d230q、c264a、h388k、s389v，psfdh基因genbank登錄號(hào)：p33160。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述方法構(gòu)建的工程菌。

5.權(quán)利要求4所述的工程菌或其發(fā)酵產(chǎn)物在酶催化制備（β,s）構(gòu)型玻色因中的應(yīng)用。

6.一種酶催化制備（β,s）構(gòu)型玻色因的方法，其特征在于，包括如下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟1）中，對工程菌進(jìn)行培養(yǎng)，包括:

8.?根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟1）中，羰基還原酶lsadh通過ni-nta親和層析柱進(jìn)行純化，甲酸脫氫酶psfdhmut通過?streptrap?hp親和層析柱進(jìn)行純化。

9.?根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟2）具體包括：配制1.0~4.0%濃度的海藻酸鈉溶液，在50~60℃下加熱達(dá)到完全溶解狀態(tài)；冷卻至室溫后，加入所得羰基還原酶lsadh和甲酸脫氫酶psfdhmut酶液；將上述混合酶液用滴加到與混合酶液等體積的2wt%殼聚糖和2?wt?%氯化鈣混合溶液中，在20~30℃下進(jìn)行攪拌形成凝膠小球，再將凝膠小球在2wt?%氯化鈣溶液中靜置30~40min進(jìn)行固化；固化后使用超純水洗滌去除表面的氯化鈣溶液，制得羰基還原酶lsadh和甲酸脫氫酶psfdhmut共固定化酶。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟3）中，共固定化酶重復(fù)使用進(jìn)行（β,s）構(gòu)型玻色因的合成反應(yīng)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種通過酶催化制備（β,S）構(gòu)型玻色因的方法及工程菌，屬于生物合成領(lǐng)域，本發(fā)明的工程菌以大腸桿菌BL21（DE3）為出發(fā)菌株，引入了SEQ?ID?No.1所示的改進(jìn)羰基還原酶編碼基因和SEQ?ID?No.2所示的改進(jìn)甲酸脫氫酶編碼基因。本發(fā)明利用該菌株生產(chǎn)的酶制備羰基還原酶LsADH和甲酸脫氫酶PsFDH<subgt;mut</subgt;共固定化酶進(jìn)行（β,S）構(gòu)型玻色因的酶催化合成，催化反應(yīng)選擇性高，可在常溫常壓中性環(huán)境中進(jìn)行，共固定化酶可重復(fù)使用，有利于連續(xù)化生產(chǎn)和降低成本。本發(fā)明所采用的催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率＞99%，使用的底物β?丙酮木糖苷和甲酸鈉安全性高，顯著的提高了產(chǎn)物（β,S）玻色因的合成效率。

技術(shù)研發(fā)人員：羅茂行,董洪鋼,劉迎賓,李舜,王甜憶
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江熙正霖生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19