本發(fā)明涉及單細(xì)胞懸液制備，尤其是涉及一種去除單細(xì)胞懸液中細(xì)胞團(tuán)塊和碎片的試劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著當(dāng)今科技的發(fā)展，多種細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段不斷涌現(xiàn)，諸如細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞分析和單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)等，大大增加了科研工作者從組織中制備出單細(xì)胞懸液的需求。其中單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠在一定程度上詳細(xì)解析復(fù)雜樣本中不同類(lèi)型細(xì)胞之間的特定差異，解析不同細(xì)胞在特定生理、病理狀態(tài)下的功能，鑒別不同細(xì)胞在發(fā)育或疾病進(jìn)展中的作用，從而揭示深刻的分子機(jī)理機(jī)制。鑒于單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)帶來(lái)的詳盡數(shù)據(jù)的強(qiáng)大功能，該技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，革新了眾多領(lǐng)域的研究范式與基本方法，對(duì)生命科學(xué)研究產(chǎn)生了顛覆式的影響。從組織中制備出高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液是進(jìn)行細(xì)胞分析的先決條件，也是進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序等下游實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2、單細(xì)胞懸液的細(xì)胞產(chǎn)量、細(xì)胞活率、細(xì)胞成團(tuán)情況以及細(xì)胞碎片等問(wèn)題均會(huì)對(duì)后續(xù)的細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)有著決定性的影響。因此，去除從動(dòng)物組織解離成單細(xì)胞懸液過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞團(tuán)塊及碎片，對(duì)于制備出高質(zhì)量單細(xì)胞懸液至關(guān)重要。目前，在制備單細(xì)胞懸液過(guò)程中多數(shù)采用低速離心的方法去除細(xì)胞碎片，然而這種方法一方面并不能將細(xì)胞碎片去除的很徹底，同時(shí)這種方法并不適用于多種類(lèi)型組織。因此，本發(fā)明提供一種可用于多種動(dòng)物組織解離的去碎片試劑及其使用方法，將正?；罴?xì)胞與細(xì)胞碎片分離開(kāi)來(lái)，從而獲得純化的單細(xì)胞懸液，提高后續(xù)諸如單細(xì)胞測(cè)序等實(shí)驗(yàn)的成功率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種去除單細(xì)胞懸液中細(xì)胞團(tuán)塊和碎片的試劑及其應(yīng)用，可以顯著去除動(dòng)物組織解離成單細(xì)胞懸液過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞團(tuán)塊及碎片，從而得到高活力細(xì)胞且最小碎片的單細(xì)胞懸液，為后續(xù)單細(xì)胞測(cè)序奠定基礎(chǔ)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種去除單細(xì)胞懸液中細(xì)胞團(tuán)塊和碎片的試劑，包括percoll原液、0.85%?w/v?nacl、0.5%?w/v?edta、0.5～2.5?mg/ml?adh-1三氟乙酸鹽和5.0～8.5?mg/ml胰蛋白酶抑制劑。

3、進(jìn)一步地，包括percoll原液、0.85%?w/v?nacl、0.5%?w/v?edta、1.5?mg/ml?adh-1三氟乙酸鹽和7.0?mg/ml胰蛋白酶抑制劑。

4、本發(fā)明還提供了上述試劑在動(dòng)物組織解離成單細(xì)胞懸液過(guò)程中，去除細(xì)胞團(tuán)塊及碎片的應(yīng)用。

5、本發(fā)明還提供了一種去除單細(xì)胞懸液中細(xì)胞團(tuán)塊和碎片的方法，包括以下步驟：

6、s1、將需要去除碎片的單細(xì)胞懸液收集到離心管中，300～500×g，4℃離心3～5min，然后緩慢倒掉上清，獲得細(xì)胞沉淀；

7、s2、向離心管中加入適量的1×pbs溶液，用巴氏吸管輕輕吸吹重懸細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞濃度為1×106～1×107個(gè)/ml；

8、s3、采用含鈣鎂離子的1×pbs緩沖液將上述試劑按20%～30%的體積比例稀釋?zhuān)缓笕∠♂尯玫脑噭┯谛碌碾x心管中；

9、s4、用巴氏吸管將調(diào)整好細(xì)胞濃度的單細(xì)胞懸液沿管壁緩慢滴加到試劑上部，同時(shí)保證細(xì)胞懸液與試劑互不干擾，形成清晰的兩相后梯度離心；

10、s5、去掉上層碎片，加適量含10%?fbs的1×pbs溶液重懸離心管底部沉淀，得到純化后的單細(xì)胞懸液。

11、進(jìn)一步地，步驟s3中試劑按25%的體積比例進(jìn)行稀釋。

12、進(jìn)一步地，步驟s4中細(xì)胞懸液占試劑與細(xì)胞懸液總體積的30-50%。

13、進(jìn)一步地，步驟s4中細(xì)胞懸液占試劑與細(xì)胞懸液總體積的50%。

14、進(jìn)一步地，步驟s4中梯度離心條件設(shè)置為800×g轉(zhuǎn)速，4?℃條件下離心20?min，升速降速設(shè)為1。

15、本發(fā)明所述的一種去除單細(xì)胞懸液中細(xì)胞團(tuán)塊和碎片的試劑及其應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：

16、本發(fā)明公開(kāi)的去碎片方法，采用密度介于活細(xì)胞與細(xì)胞碎片之間的去碎片試劑作為密度梯度液，將細(xì)胞混合液和密度梯度液一起離心，即可將活細(xì)胞和碎片分離開(kāi)來(lái)。部分死細(xì)胞在離心過(guò)程中會(huì)因細(xì)胞膜通透性增大而導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，最終成為細(xì)胞碎片而被去除，從而提高了細(xì)胞活率。去碎片試劑中含有的edta、adh-1三氟乙酸鹽和胰蛋白酶抑制劑能夠與細(xì)胞表面蛋白諸如鈣-粘蛋白等結(jié)合，阻斷細(xì)胞間粘附，有效降低細(xì)胞結(jié)團(tuán)情況。相較傳統(tǒng)離心方法，采用本發(fā)明去碎片方法不僅去除碎片更為徹底，降低了細(xì)胞結(jié)團(tuán)率的同時(shí)，更加適用于多種動(dòng)物組織類(lèi)型，獲得的高活率、低細(xì)胞結(jié)團(tuán)率和最小碎片的高質(zhì)量單細(xì)胞懸液，保證了下游細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)的成功率。

17、下面通過(guò)附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

技術(shù)特征：

1.一種去除單細(xì)胞懸液中細(xì)胞團(tuán)塊和碎片的試劑，其特征在于：包括percoll原液、0.85%?w/v?nacl、0.5%?w/v?edta、0.5～2.5?mg/ml?adh-1三氟乙酸鹽和5.0～8.5?mg/ml胰蛋白酶抑制劑。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于：包括percoll原液、0.85%?w/v?nacl、0.5%w/v?edta、1.5?mg/ml?adh-1三氟乙酸鹽和7.0?mg/ml胰蛋白酶抑制劑。

3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑在動(dòng)物組織解離成單細(xì)胞懸液過(guò)程中，去除細(xì)胞團(tuán)塊及碎片的應(yīng)用。

4.一種去除單細(xì)胞懸液中細(xì)胞團(tuán)塊和碎片的方法，其特征在于，包括以下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：步驟s3中試劑按25%的體積比例進(jìn)行稀釋。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：步驟s4中細(xì)胞懸液占試劑與細(xì)胞懸液總體積的30-50%。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：步驟s4中細(xì)胞懸液占試劑與細(xì)胞懸液總體積的50%。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：步驟s4中梯度離心條件設(shè)置為800×g轉(zhuǎn)速，4?℃條件下離心20?min，升速降速設(shè)為1。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種去除單細(xì)胞懸液中細(xì)胞團(tuán)塊和碎片的試劑及其應(yīng)用，涉及單細(xì)胞懸液制備技術(shù)領(lǐng)域。一種去除單細(xì)胞懸液中細(xì)胞團(tuán)塊和碎片的試劑，包括Percoll原液、0.85%w/v?NaCl、0.5%w/v?EDTA、0.5～2.5?mg/mL?ADH?1三氟乙酸鹽和5.0～8.5?mg/mL胰蛋白酶抑制劑。本發(fā)明采用上述的一種去除單細(xì)胞懸液中細(xì)胞團(tuán)塊和碎片的試劑及其應(yīng)用，可以顯著去除動(dòng)物組織解離成單細(xì)胞懸液過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞團(tuán)塊及碎片，從而得到高活力細(xì)胞且最小碎片的單細(xì)胞懸液，為后續(xù)單細(xì)胞測(cè)序奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：林傳勇,龐美霞,梁柳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州元信生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19