本發(fā)明屬于中藥檢測(cè)，具體涉及一種基于dna條形碼的忍冬藤和紅白忍冬藤分子鑒別方法。

背景技術(shù)：

1、忍冬藤為忍冬科植物忍冬 lonicera?japonicathunb.?的干燥莖枝。秋、冬二季采割，曬干。藥材呈長(zhǎng)圓柱形，多分枝，表面棕紅色至暗棕色，有的灰綠色，光滑或被茸毛。忍冬藤藥用價(jià)值高，具有清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)的功效，臨床常用于溫病發(fā)熱，熱毒血痢，癰腫瘡瘍，風(fēng)濕熱痹，關(guān)節(jié)紅腫熱痛。

2、紅白忍冬 lonicera?japonicavar.?chinensis是忍冬 lonicera?japonicathunb.的自然變種，并不是《中華人民共和國(guó)藥藥典》規(guī)定的藥用品種，且主要藥效物質(zhì)綠原酸、木犀草苷等成分存在差異。但是目前實(shí)際生產(chǎn)中也有大量栽培，在秋冬采收季節(jié)，紅白忍冬的莖枝常常會(huì)一同混入忍冬藤中，經(jīng)過(guò)晾曬加工后，成為忍冬藤藥材的混偽品，無(wú)法區(qū)分，影響臨床使用和療效。因此，亟待建立一種快速準(zhǔn)確鑒定忍冬藤及其偽品紅白忍冬藤的方法。

3、dna條形碼技術(shù)，通過(guò)對(duì)具有進(jìn)化保守的線粒體基因組、葉綠體基因組及核糖體相關(guān)dna序列的分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同品種的快速鑒定，進(jìn)化關(guān)系分析。在中藥材分子分析鑒定中具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于dna條形碼的忍冬藤和紅白忍冬藤分子鑒別方法，檢測(cè)方法高效且便捷，可以用于忍冬藤藥材的真?zhèn)舞b別。

2、本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、一種基于dna條形碼的忍冬藤和紅白忍冬藤分子鑒別方法，鑒別忍冬藤和紅白忍冬藤的dna條形碼基因?yàn)榇嬖趇ndel差異的細(xì)胞核基因lj7a621t37和/或存在snp差異的葉綠體基因trnh-psba；

4、所述的存在indel差異的細(xì)胞核基因lj7a621t37的pcr擴(kuò)增上游引物和下游引物分別如seq?id?no.1?和eq?id?no.2?所示；

5、所述的存在snp差異的葉綠體基因trnh-psba的pcr擴(kuò)增上游引物和下游引物分別如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。

6、進(jìn)一步地，基于dna條形碼的忍冬藤和紅白忍冬藤分子鑒別方法包括以下步驟：

7、（1）提取待檢測(cè)樣品的dna；

8、（2）以該dna為模板用存在indel差異的細(xì)胞核基因lj7a621t37和/或存在snp差異的葉綠體基因trnh-psba對(duì)應(yīng)的上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

9、（3）步驟（2）擴(kuò)增出的基因片段用瓊脂糖凝膠電泳分離，選取條帶單一明亮的部分進(jìn)行測(cè)序分析和序列峰圖分析，判斷待檢測(cè)樣品為忍冬藤或紅白忍冬藤。

10、進(jìn)一步地，步驟（2）中pcr擴(kuò)增的系統(tǒng)為：ddw?20μl，takar?premix?tap?dye?25μl，正向引物?2μl，反向引物?2μl，模板?1μl。

11、進(jìn)一步地，步驟（2）中pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃?180s；?98℃?10s，57℃?30s，72℃45s，28個(gè)循環(huán)；72℃?5min。

12、進(jìn)一步地，步驟（3）中存在indel差異的細(xì)胞核基因lj7a621t37擴(kuò)增后分離出的串聯(lián)重復(fù)序列g(shù)gagaa序列，有4個(gè)該重復(fù)序列的判斷為忍冬，有3個(gè)該重復(fù)序列，缺失第219位堿基至224位堿基（ggagaa）為紅白忍冬。

13、進(jìn)一步地，步驟（3）中存在snp差異的葉綠體基因trnh-psba擴(kuò)增后分離出的序列第331為位堿基序列為g判斷為忍冬，第331為位堿基序列為a判斷紅白忍冬。

14、本發(fā)明取得的有益效果為：

15、本發(fā)明利用存在indel差異的細(xì)胞核基因lj7a621t37和存在snp差異的葉綠體基因trnh-psba的特異性引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增及測(cè)序檢測(cè)，根據(jù)位點(diǎn)不同堿基情況進(jìn)行忍冬藤和紅白忍冬藤的鑒別。利用2對(duì)特異性引物，2個(gè)特異性位點(diǎn)可獲得準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，檢測(cè)方法高效且便捷，可以用于忍冬藤藥材的真?zhèn)舞b別。

技術(shù)特征：

1.一種基于dna條形碼的忍冬藤和紅白忍冬藤分子鑒別方法，其特征在于，鑒別忍冬藤和紅白忍冬藤的dna條形碼基因?yàn)榇嬖趇ndel差異的細(xì)胞核基因lj7a621t37和/或存在snp差異的葉綠體基因trnh-psba；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于dna條形碼的忍冬藤和紅白忍冬藤分子鑒別方法，其特征在于，基于dna條形碼的忍冬藤和紅白忍冬藤分子鑒別方法包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于dna條形碼的忍冬藤和紅白忍冬藤分子鑒別方法，其特征在于，步驟（2）中pcr擴(kuò)增的系統(tǒng)為：ddw?20μl，takar?premix?tap?dye?25μl，正向引物?2μl，反向引物?2μl，模板?1μl。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于dna條形碼的忍冬藤和紅白忍冬藤分子鑒別方法，其特征在于，步驟（2）中pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃?180s；?98℃?10s，57℃?30s，72℃?45s，28個(gè)循環(huán)；72℃?5min。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于dna條形碼的忍冬藤和紅白忍冬藤分子鑒別方法，其特征在于，步驟（3）中存在indel差異的細(xì)胞核基因lj7a621t37擴(kuò)增后分離出的串聯(lián)重復(fù)序列g(shù)gagaa序列，有4個(gè)該重復(fù)序列的判斷為忍冬，有3個(gè)該重復(fù)序列，缺失第219位堿基至224位堿基ggagaa為紅白忍冬。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于dna條形碼的忍冬藤和紅白忍冬藤分子鑒別方法，其特征在于，步驟（3）中存在snp差異的葉綠體基因trnh-psba擴(kuò)增后分離出的序列第331為位堿基序列為g判斷為忍冬，第331為位堿基序列為a判斷紅白忍冬。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于DNA條形碼的忍冬藤和紅白忍冬藤分子鑒別方法，屬于中藥檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。鑒別忍冬藤和紅白忍冬藤的DNA條形碼基因?yàn)榇嬖贗NDEL差異的細(xì)胞核基因Lj7A621T37和/或存在SNP差異的葉綠體基因trnH?psbA；存在INDEL差異的細(xì)胞核基因Lj7A621T37的PCR擴(kuò)增上游引物和下游引物分別如SEQ?ID?NO.1?和EQ?ID?NO.2?所示；存在SNP差異的葉綠體基因trnH?psbA的PCR擴(kuò)增上游引物和下游引物分別如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示。本發(fā)明利用2對(duì)特異性引物，2個(gè)特異性位點(diǎn)可獲得準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，檢測(cè)方法高效且便捷，可以用于忍冬藤藥材的真?zhèn)舞b別。

技術(shù)研發(fā)人員：管仁偉,趙一伍,王淑,趙秋晨,郭瑞齊,冉志芳,張翠翠,林慧彬,李圣波
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東省中醫(yī)藥研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19