專利名稱:促進動物的快速生長和改進肉質(zhì)的方法
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
，本發(fā)明涉及用腺病毒伴隨病毒載體尤其是用1型腺病毒伴隨病毒載體導(dǎo)入生長激素基因或相關(guān)基因的方法提高生豬飼料報酬率，促進動物快速生長和改進動物肉質(zhì)。
背景技術(shù)：
肉產(chǎn)品的質(zhì)量對于飼養(yǎng)業(yè)十分關(guān)鍵，也是影響消費者選擇的重要因素。消費者選擇某種肉制品的欲望取決于其價格、鮮嫩程度及外觀等因素。從飲食的營養(yǎng)和健康角度考慮，減少動物性脂肪的攝入量對預(yù)防心腦血管疾病及血管硬化性疾病有著積極的意義，因此，提高生豬的瘦肉與肥肉的比例變得越來越重要和有意義；同時，瘦肉/脂肪比值高對于肉類的加工也十分有利，因為可以避免繁重的剝?nèi)ブ具^程；另外，瘦肉/脂肪高比值有利于提高飼料轉(zhuǎn)化效率即飼料報酬率，因為一般來說產(chǎn)生1公斤脂肪比產(chǎn)生1公斤瘦肉消耗的飼料要多4倍。然而，用天然飼料往往導(dǎo)致飼料/肉轉(zhuǎn)化效率低下，在肌肉的表面和內(nèi)部都含有高比例的脂肪。而從經(jīng)營角度看，降低飼養(yǎng)成本，縮短出欄時間，提高肉料比，降低投入/產(chǎn)出比例，是飼養(yǎng)業(yè)為獲得最大收益而努力追求的目標。
用傳統(tǒng)的雜交育種方法增加動物瘦肉/脂肪比值已進行了大量且長期的嘗試，并取得了非常大的成功。這些方法往往周期長、費用高，且無法避免副作用，如肉質(zhì)下降，動物應(yīng)激的易感性增加等。
豬肉在許多國家都是重要的食用肉來源。一般地，25～30公斤重的豬斷奶后轉(zhuǎn)入飼養(yǎng)棚中進行飼養(yǎng)。在30～90公斤重的范圍內(nèi)豬的生長速度相對恒定，但飼料的消耗顯著增加。當接近屠宰體重90～110公斤時豬的飼料轉(zhuǎn)化效率不斷下降。生長晚期(60～90公斤)，肉質(zhì)開始定型，增加的體重主要是脂肪。產(chǎn)生脂肪的能耗是產(chǎn)生瘦肉組織的2.4倍，因此，如果使代謝向生產(chǎn)瘦肉組織轉(zhuǎn)化顯然十分有利。
與動物生長和促性腺發(fā)育的激素類物質(zhì)對于提高生豬的飼料報酬率有很明確的作用。但與促性腺發(fā)育的激素類物質(zhì)如“瘦肉精”等因?qū)釡缁畹炔幻舾卸菀讓?dǎo)致生物殘留，造成對人體和環(huán)境、生豬健康的損害，現(xiàn)在已嚴禁使用。
豬的生長激素(growth hormone，GH)等蛋白類激素，在具有促生長等作用的同時，因?qū)釡缁畹纫蛩胤浅Ｃ舾卸鵁o生物殘留，因此不會造成對人體和環(huán)境、生豬健康的損害。
生長激素(growth hormone，GH)在控制動物正常生長中起到重要作用。它對于絕大多數(shù)家養(yǎng)動物的生長代謝的控制機理現(xiàn)在已經(jīng)比較清楚，但細節(jié)還有待進一步闡明，然而，人們已經(jīng)知道用外源的生長激素是可以提高已研究過的兒乎所有種類動物的生長速度。例如，用天然的豬垂體激素或重組生長激素在一定時期給豬反復(fù)注射，可明顯促進其體重的增加、肉質(zhì)的改善、飼料消耗降低，從而提高飼料轉(zhuǎn)化效率。
生長激素對動物的作用的一些研究報道的結(jié)果有所不同。主要影響因素包括動物的體重、性別、注射生長激素的劑量和頻度等。過大劑量及過頻(1次/天)地注射生長激素可導(dǎo)致動物的高死亡率，伴隨肝臟和腎臟退變、胃出血、水腫及關(guān)節(jié)炎等。因此，許多研究都集中在生長激素的不同用法對動物的生長、肉質(zhì)改善、飼料轉(zhuǎn)化效率的影響等方面。Walker等(美國專利5637566)采用合成的豬生長激素0.06～0.15mg/kg毛重對35～100kg的豬進行隔日、每3天、每4天一次注射，共10～30天。結(jié)果大大提高了豬(包括母豬、閹豬及公豬)的生長速度和瘦肉/脂肪比例及飼料轉(zhuǎn)化效率。然而，注射的生長激素在動物體內(nèi)會迅速降解，因此無論是采用每天一次或幾天一次的方法，都無可避免地需要多次注射，造成藥物成本和操作成本的增加，并且反復(fù)注射易引起應(yīng)激反應(yīng)，不利于豬的生長和肉質(zhì)改善，同時，工作量也很大。
解決用生長激素反復(fù)注射的問題可采用兩種策略。一種是轉(zhuǎn)基因動物，即將生長激素基因轉(zhuǎn)移到受精卵中，篩選出陽性基因型的個體，并進行繁殖。然而這種方法往往成本高，在高等哺乳動物如豬、牛中更難以實現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因的胚胎在發(fā)育中往往畸形或流產(chǎn)，或出生后異常，獲得遺傳性狀不容易穩(wěn)定，難以形成種群。且轉(zhuǎn)基因豬中，由于生長激素在胚胎期或幼豬期的過早的高表達將會導(dǎo)致個體的生理紊亂，反而對個體生長起到副作用。因此，生長激素的轉(zhuǎn)基因豬的研究并未獲得成功。另一種方法是用體細胞基因轉(zhuǎn)移的方法，將攜帶生長激素基因的DNA導(dǎo)入動物個體體內(nèi)，如肌肉注射，形成一個異位的內(nèi)分泌器官，使生長激素在體內(nèi)表達外源的生長激素并分泌到體循環(huán)系統(tǒng)中，促進動物的快速生長、瘦肉/脂肪比例及飼料轉(zhuǎn)化效率提高。
除了用生長激素基因外，其它刺激生長激素分泌的激素也可達到同樣目的。Schwartz R(Nat Biotechnol 1999 Dec；17(12)1179-83)的研究組曾報道用含有豬生長激素釋放激素基因(GHRH)的質(zhì)粒DNA給小豬肌肉注射，結(jié)果使小豬生長速度明顯加快，體重增加20％以上，并且沒有器官肥大或相關(guān)病理變化。其中GHRH編碼的蛋白對血清蛋白酶具有抗性，其表達受到肌肉特異性的合成的啟動子(SP)控制。用該裸質(zhì)粒DNA 10mg給3周齡的小豬一次性肌肉內(nèi)注射，隨后用電穿孔處理，可提高血清中GHRH的水平，增加生長激素的分泌，增加血清IGF-1的水平。
然而，裸DNA直接肌肉注射存在轉(zhuǎn)染效率低、效果不穩(wěn)定等缺點，有必要采用更有效的基因載體系統(tǒng)。
AAV載體其具有安全性好、可介導(dǎo)外源基因的持續(xù)表達，在肌肉、視網(wǎng)膜、肝臟、腦組織、腸道等靶組織中表達良好的特點，近年來受到基因治療領(lǐng)域越來越多的關(guān)注，成為較為理想的基因轉(zhuǎn)移和表達載體。許多研究表明，重組AAV載體可介導(dǎo)外源基因在肌肉組織持續(xù)高表達，并且可將目的蛋白分泌到體循環(huán)系統(tǒng)中起作用。用AAV載體開展的各種動物實驗主要是在鼠體內(nèi)進行的，而利用血清型2型AAV病毒介導(dǎo)的凝血因子IX基因治療血友病B和血清型2型AAV病毒介導(dǎo)CFTR基因治療肺囊性纖維化病變正在開展人體臨床試驗。
而其他的血清型如1、3、5等的AAV病毒所介導(dǎo)的目的基因的表達水平和特點與AAV-2的所介導(dǎo)的目的基因的表達水平和特點有相當大的區(qū)別，尤其是AAV-1(即血清型1的AAV病毒)，其表達水平高于AAV-2的表達水平2-3個數(shù)量級，且在進行基因轉(zhuǎn)移后，目的基因的表達比AAV-2的更早。我們已經(jīng)進行的實驗結(jié)果和其他研究小組的工作已經(jīng)表明證實了這些特點(Valder R.Arruda，et al，Safety and efficacy of factor IX gene transfer to skeletal muscle inmurine and canine hemophilia B models by adeno-associated viral vector serotype 1 Blood.2003Sep 11[Epub ahead of print]，PMID12969984[PubMed-as supplied by publisher])。
AAV病毒是一類體積小、無包膜的病毒，內(nèi)含單鏈DNA，其中正鏈和負鏈的數(shù)量基本相等。AAV病毒屬于微小病毒屬(Parvoviridae)，它的復(fù)制需要輔助病毒的存在。(Kotin，RM.1994.Hum.Gene Ther.5793-801)。文獻報道的的主要的靈長類AAV病毒有六種血清型，分別被命名為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6。(Baclunann PA，MD.Hoggan，JL.Melnick，1975，Parvoviridae，Intervirology 583-92)(Bantel-Schaal U.，and H.zur Hausen.1998.Virology 13452-63)(Rutledge.EA.，CL.Halbert，and DW.Russell.1998.J.Virol.72309-319)到目前為止，AAV1、2、3、4、5、6的全序列都已經(jīng)清楚，各種血清型基因組的同源性在52-82％之間(Bantel-Schaal U.，and H.zur Hausen.J.Virol.1999，73939-947)。另外，有越來越多的新的AAV血清型報道，比如AAV7、AAV8等。
AAV基因組的兩末端各有一個145bp的倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列(inverted terminal repeat，ITR)。ITR序列之間為AAV病毒的編碼區(qū)，左側(cè)的ORF編碼4種Rep蛋白；右側(cè)的ORF編碼3種Cap蛋白。
AAV病毒ITR長145bp。其中前125bp可形成一個T形的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由兩個小同紋結(jié)構(gòu)(palindrome)組成，旁邊為一個較大的回紋結(jié)構(gòu)。ITR序列是AAV病毒的復(fù)制、整合、拯救和包裝所必需的順式作用元件。
AAV病毒Rep基因編碼至少4種非結(jié)構(gòu)蛋白Rep78，Rep68，Rep52，Rep40。由p5啟動子起始的2種mRNA翻譯成Rep78和Rep68；p19啟動子起始的2種mRNA翻譯成Rep52和Rep40。Rep52和Rep40蛋白C末端的氨基酸序列分別與Rep78和Rep68相同。Rep78和Rep68蛋白與AAV基因表達的正負調(diào)控有關(guān)。這兩種蛋白都可以和ITR中的特定序列(5’-GCTCTCTCGCTC-3’)結(jié)合。類似的序列在AAV的3個啟動子上游均可找到。當ITR自我折疊時可加強這種結(jié)合作用。Rep78/Rep68具有ATP酶和螺旋酶的功能。當其與ITR結(jié)合時便成為在124位點核苷酸處特異切割的缺口酶，識別的位點是5’-T/TGG。這兩種蛋白對于AAV生活周期的每一時期都是必需的。在非允許條件下(沒有輔助病毒和刺激因素)，Rep蛋白只有微量表達，這種表達又能抑制其進一步的表達。另外，在非允許條件下Rep的表達似乎可抑制AAV基因組以直接方式復(fù)制。近來的研究證明Rep蛋白的表達對位點特異性整合是必需的。相反，在允許條件下，Rep蛋白的表達對AAV病毒從整合狀態(tài)的拯救、各種AAV基因的表達和AAV DNA的復(fù)制都是必需的。Rep52和Rep40參與了病毒的裝配，它們在病毒雙鏈DNA合成中是不需要的，但在單鏈DNA和病毒顆粒的累積中則是必需的。
AAV病毒Cap基因編碼衣殼蛋白，其轉(zhuǎn)錄從p40啟動子開始，形成約2.6kb和2.3kb mRNA，拼接后分別編碼三個結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3，分子量分別為87、73和62kDa，在成熟毒粒中的比例為1∶1∶10。沒有VP1時，VP2和VP3就可以包裝子代單鏈DNA。但這樣的毒粒感染性較低，提示VP1在病毒顆粒的穩(wěn)定性或感染性上是需要的。VP2在病毒樣空顆粒的裝配中起重要作用。VP3似乎需要與其它兩個中的一個共同完成核定位任務(wù).
各種血清型AAV病毒的同源性比較文獻報道靈長類主要的六種血清型AAV病毒血清型1、2、3、4、5、6。其中只有AAV5最初是從人體中分離出來的(Bantel-Schaal，and H.zur Hausen.1984.Virology13452-63)，其余5種血清型的AAV病毒都是在研究腺病毒時發(fā)現(xiàn)的(Ursula Bantel-Schaal，Hajo Delius and Harald zur Hausen.J.Virol.1999，73939-947)。到目前為止，全部6種血清型的AAV病毒的全序列都已經(jīng)清楚，(John Chiorini，F(xiàn)rank Kim，Linda Yang，and Robert Kotin.J.Virol.1999，731309-1319)，AAV1、2、3、4、6血清型基因組的同源性普遍較高，特別是ITR和Rep區(qū)域，其中Rep在AAV1、2、3、4、6中的同源性高達89-93％，因此AAV1、2、3、4、6血清型之間Rep可以識別來自另一血清型的ITR，并支持其包裝。(Chiorini J，L.Yang，Y.Liu，B.Safer，and M.Kotin.1997.J.Virol.716823-6833)(Muramatsu，S.，H.Mizukami，N.Young，and K.Brown.1996.Virology221208-217)。
對現(xiàn)有AAV2載體進行“換殼”改造(雜合AAV病毒載體的構(gòu)建)對現(xiàn)有AAV2載體進行“換殼”改造，是獲得除AAV2外的其它5種AAV血清型的細胞親嗜性的AAV病毒載體的最簡捷途徑。AAV各血清型的基因組之間既高度同源又有區(qū)別的特性，使我們可以比較容易地對我們現(xiàn)有的AAV2載體進行“換殼”改造。即不改變現(xiàn)有AAV病毒載體順式元件ITR(來自AAV2)的同時，通過更換各AAV血清型的外殼蛋白Cap，分別獲得具有AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6血清型細胞親嗜性的雜合AAV病毒載體(ITR來自AAV2、外殼分別來自AAV1、AAV3、AAV4、AAV5和AAV6)。其中AAV1、AAV3、AAV4、AAV6與AAV2的同源性較高，只要改變Cap而不改變AAV2的Rep，就能反式包裝出相應(yīng)的外殼來自AAV1、AAV3、AAV4、AAV5或AAV6而ITR來自AAV2的AAV雜合載體。
在我們先前申報的發(fā)明“可用于大規(guī)模生產(chǎn)的腺病毒伴隨病毒生產(chǎn)方法及用途”(專利申請?zhí)?9119039.4；公開號CN 1252441A)中描述了“一株載體細胞/一株輔助病毒”的生產(chǎn)策略制備重組腺病毒伴隨病毒。
而在我們曾做過的研究中同樣采用“一株載體細胞/一株輔助病毒”的生產(chǎn)策略，但是使用的“一株輔助病毒”是HSV1-r2c1，用輔助病毒HSV1-r2c1感染載體細胞以大量制備具有rAAV-1外殼的重組病毒。其中，一種載體細胞中導(dǎo)入了含有AAV2的ITR元件的真核表達質(zhì)粒載體pSNAV；另一種載體細胞中導(dǎo)入了含有AAV1的ITR元件的真核表達質(zhì)粒載體pSNAV-N1。試驗顯示，使用這兩種細胞對病毒的包裝和生產(chǎn)都沒有不利的影響，它們均可以包裝出具有AAV-1外殼的病毒顆粒，只是這兩種rAAV-1病毒顆粒中包含的基因表達盒中的ITR元件是不相同的，一種含AAV2的ITR元件，我們稱之為重組AAV2/1雜合病毒；另一種含AAV1的ITR元件，稱為重組AAV1病毒。雖然這兩種ITR元件的同源性很高，但仍然是不同的。
輔助病毒HSV1-r2c1一種重組單純皰疹病毒(HSV1)，其特征在于其基因組中插入了一種DNA序列，它具有SEQ ID NO.1(是rep2cap1)所示的核苷酸序列或其同源序列。其中DNA序列SEQ ID NO.1被插入HSV1基因組的UL2基因的xbaI位點中。rep2cap1核苷酸序列片段是被插入到Set C的COS6的UL2基因的xbaI位點中。
另外，DNA序列SEQ ID NO.1也可以通過插入HSV1的UL44基因的XbaI位點或用同源重組的方法插入HSV1的其它非必需基因區(qū)。比如用同源臂方法用SEQ ID NO.1替代HSV1的非必需基因tk。rep2cap1核苷酸序列片段是被插入到Set C的COS56的UL44基因的xbaI位點中。
將輔助病毒HSV1-r2c1感染載體細胞，被感染的載體細胞能在表達AAV2的Rep蛋白的同時還表達AAV1的Cap蛋白。用重組單純皰疹病毒rHSV1-r2c1作為輔助病毒感染含有AAV2或AAV1的ITR和外源基因的基因序列(ITR--外源基因-ITR)的基因表達盒的細胞株，可以產(chǎn)生具有1血清型AAV外殼的重組AAV病毒載體(rAAVs)。
所用輔助病毒HSV1-r2c1的產(chǎn)生是在對一套含有HSV1病毒全基因組的粘性質(zhì)粒Set C粘粒(包括cos6，cos14，cos28，cos48，cos56共5個粘粒，Cunningham，C.and A.J.Davison 1993 Acosmid-base system for constructing mutants of Herpes Simplex Virus Tupe 1.Virology 197116-124)進行改造的基礎(chǔ)上實現(xiàn)的。該套粘粒中裝載的每一HSV1病毒基因組片段的末端與裝載于另一粘粒中的HSV1片段的末端序列重復(fù)，這是5個HSV1基因組片段在細胞中發(fā)生同源重組從而產(chǎn)生重組HSV1的基礎(chǔ)。Set C(見附圖4)中的cos6上的非必需基因UL2和cos56上HSV1的非必需基因UL44中有一個XbaI單切點，用于將外源基因插入其中，并通過5個粘粒重組而產(chǎn)生插入了外源基因的重組HSV1病毒。
將AAV1的cap基因與AAV2的rep基因相連，成為rep2cap1 DNA片段(見附圖1)，將這個DNA片段裝入HSV1基因組中，得到表達AAV1的cap蛋白和AAV2的rep蛋白的重組HSV1HSV-r2c1。rep和cap片段可以以單拷貝形式插入HSV1基因組的同一位置，也可以分別插入HSV1的不同位置。rep和cap片段也可以以兩個或兩個以上拷貝形式插入HSV1基因組的同一位置，也可以分別插入HSV1的不同位置。rep(AAV2)和cap(AAV1)基因分別用上下游引物從各自的病毒基因組模板，通過PCR方法獲得后，再采用限制性內(nèi)切酶切、連接的方法得到r2c1基因片段，這些基因片段的兩端都是XbaI位點。將經(jīng)過XbaI酶切的r2c1基因片段插入cos6或cos56的XbaI位點中，構(gòu)建成重組粘粒cos6-r2c1ΔUL2或cos56-r2c1 UL44。然后將cos6-r2c1ΔUL2或cos56-r2c1 UL44與cos14，cos28，cos48，cos56等摩爾混合，用PacI酶切去cos骨架，用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，HSV1片段在細胞內(nèi)發(fā)生同源重組而產(chǎn)生HSV1-r2c1重組病毒5天后細胞開始出現(xiàn)病變，待細胞完全病變后收培養(yǎng)液上清，2000r/min離心5min，上清分裝保存于-20℃。用該方法產(chǎn)生的含有目的DNA片段的重組HSV1病毒的概率達50～100％。通過空斑篩選很容易獲得純一的重組病毒。
另外，將r2c1基因片段通過同源臂重組、轉(zhuǎn)座子、定點插入、隨機插入等方式插入HSV1基因組中，同樣可以得到與上述HSV1-r2c1重組病毒功能相同的重組病毒。
同樣，以上描述的HSV1-r2c1重組病毒也可以是插入了與SEQ ID NO.1的DNA片段同源的其它DNA序列?！捌渌碊NA序列”指非SEQ ID NO.1，但與其有一定DNA序列同源性，同樣可以起AAV載體輔助病毒功能的其它DNA序列。
本發(fā)明用腺病毒伴隨病毒載體尤其是用1型腺病毒伴隨病毒載體導(dǎo)入生長激素基因或相關(guān)基因的方法更顯著地提高了生豬飼料報酬率，促進動物快速生長和改進動物肉質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種促進動物生長發(fā)育、提高動物肉質(zhì)和提高飼料轉(zhuǎn)化效率的新方法。
本發(fā)明通過使外源生長激素基因或相關(guān)基因如生長激素釋放激素基因在動物體內(nèi)高水平、持續(xù)穩(wěn)定的表達達到促進動物生長發(fā)育、提高動物肉質(zhì)和提高飼料轉(zhuǎn)化效率的目的。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了能表達目的DNA的重組腺病毒伴隨病毒，該目的基因穩(wěn)定地插入在上述重組腺病毒伴隨病毒基因組的適當位置。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了含有重組腺病毒伴隨病毒的重組質(zhì)粒以及含有該質(zhì)粒的宿主細胞。
在再一實施方案中，本發(fā)明提供了一種促進動物生長，提高飼料轉(zhuǎn)化率且改善飼養(yǎng)動物肉質(zhì)的方法。該方法是在特定的飼養(yǎng)階段用含有目的DNA的重組腺病毒伴隨病毒對對動物進行肌肉注射。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明提供一種新的重組腺病毒伴隨病毒，該病毒基因組中含有促進動物生長發(fā)育的基因。提供一種用該病毒促進動物生長發(fā)育、提高畜禽肉質(zhì)的新方法。
本發(fā)明的目的DNA為與動物生長發(fā)育有關(guān)的基因，優(yōu)選的是生長激素基因和生長激素釋放激素基因。更優(yōu)選的是生長激素基因。最優(yōu)選的是豬的生長激素基因。
本發(fā)明的方法可適用于促進動物的生長，優(yōu)選的是適用于家養(yǎng)動物，例如豬、牛、羊的生長發(fā)育。
在一優(yōu)選實施方案中，先用PCR方法獲得豬的生長激素基因全長cDNA片段。取1周齡乳豬的垂體組織，用Trizol試劑提取住組織總RNA，以之為模板用豬生長激素基因特異性引物進行RT-PCR擴增，擴增條件為94℃ 45秒、56℃ 45秒、72℃ 45秒，30個循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳分離，用玻璃奶方法回收約650bp的DNA片段，插入克隆質(zhì)粒pTeasy(Promega公司)中，測序(測序結(jié)果見附圖10)。結(jié)果表明該DNA片段為豬的生長激素基因全長cDNA(650bp)。
通用型的AAV載體質(zhì)粒pSNAV-1(見附圖5)是通過將一特定DNA片段插入pSV2neo質(zhì)粒的BamHI位點中構(gòu)成。插入的DNA片段含有AAV-2病毒兩端ITR序列及其間的CMV啟動子/增強子元件、多克隆位點及多聚腺苷酸加尾信號序列。目的DNA片段可插入在AAV載體質(zhì)粒pSNAV-1 CMV啟動子/增強子下游的多克隆位點中構(gòu)成重組AAV載體質(zhì)粒。其中CMV啟動子/增強子元件與目的基因和polyA序列構(gòu)成了目的基因的表達單位；SV40病毒復(fù)制子/啟動子-neo-polyA構(gòu)成了neo基因表達單位。后者使獲得該質(zhì)粒的動物細胞產(chǎn)生對G418藥物的抗性。利用這種特性可將重組AAV載體質(zhì)粒pSNAV-1導(dǎo)入細胞(可選的細胞包括Vero細胞、BHK細胞、293細胞等)中進行G418選擇培養(yǎng)，獲得重組AAV病毒的生產(chǎn)細胞株。
用輔助病毒HSV1-r2c1感染(moi 0.1~10)該細胞株，2-5天，細胞發(fā)生完全病變后收集病變細胞和培養(yǎng)液，即獲得含有大量重組AAV病毒的混合物。其中的AAV兩個ITR序列及夾于其間的目的基因表達單位會被“拯救(rescue)”出來，即從基因組DNA上特異地切下來，大量復(fù)制并被包裝到AAV病毒殼粒中形成重組AAV1病毒顆粒。被包裝到AAV1病毒殼粒中的AAV基因組為單鏈的兩端帶有AAV ITR序列的DNA，不包含重組AAV質(zhì)粒中ITR序列以外的細菌質(zhì)粒骨架和neo基因表達單位。
我們對我們先前申報的發(fā)明(申請?zhí)?9119038.6公開號CN 1243878A)所涉及的真核表達質(zhì)粒載體pSNAV進行了改造。我們將pSNAV中含有的AAV-2的ITR元件更換成了AAV-1的ITR元件，相應(yīng)構(gòu)建成了pSNAV-N1(結(jié)構(gòu)見附圖6)。
同樣，將重組AAV載體質(zhì)粒pSNAV-N1導(dǎo)入細胞(可選的細胞包括Vero細胞、BHK細胞、293細胞等)中進行G418選擇培養(yǎng)，獲得重組AAV病毒的生產(chǎn)細胞株，用輔助病毒HSV1-r2c1感染(moi 0.1~10)該細胞株，~5天，細胞發(fā)生完全病變后收集病變細胞和培養(yǎng)液，即獲得含有大量重組AAV1病毒的混合物。
重組AAV1病毒的純化用1/10體積的氯仿處理上述任一收集的病變細胞和培養(yǎng)液混合液，可極為有效地滅活其中含有的重組單純皰疹病毒的生物活性，同時使大量的蛋白質(zhì)變性沉淀。離心去除沉淀和氯仿，取上清進一步濃縮和純化重組AAV病毒。用聚乙二醇(PEG8000)和氯化鈉沉淀重組AAV病毒。離心去除上清。沉淀用少量PBS緩沖液重懸、溶解。用氯仿抽提，取上清均可獲得純化的重組AAV1病毒。
將豬生長激素全長cDNA插入AAV載體質(zhì)粒pSNAV-1的CMV啟動子下游，構(gòu)建成含有豬生長激素基因的重組AAV載體質(zhì)粒pSNAV-GH。其基因組結(jié)構(gòu)見附圖8.
將豬生長激素全長cDNA插入AAV載體質(zhì)粒pSNAV-N1的CMV啟動子下游，構(gòu)建成含有豬生長激素基因的重組AAV載體質(zhì)粒pSNAV-N1-GH。其基因組結(jié)構(gòu)見附圖9.
用以上所述方法制備和純化含有豬生長激素基因的重組AAV1病毒。
含有豬生長激素基因的重組AAV1病毒具有野性型人AAV病毒的理化特征和感染性，注射到肌肉組織后可逐漸在肌肉細胞中形成染色體外高分子DNA形式及染色體中整合形式穩(wěn)定存在，形成一個異位的內(nèi)分泌器官，長期表達并釋放生長激素至體循環(huán)系統(tǒng)中。
給1月齡至3月齡的乳豬一次性肌肉注射含有豬生長激素基因的重組AAV1病毒10(e9)~10(e12)病毒顆粒/kg體重可長期表達和釋放豬生長激素，促進生豬的快速生長和提高飼料報酬率。



圖1為rep2cap1圖譜。rep基因以AAV2的rep基因為主體(長約1721bp)，3’端含有來自AAV1的一小段rep(長約280bp)。cap基因完全來自AAV1(長約2210bp)。
圖2為cos6-r2c1ΔUL2圖譜。基因方向不限。
圖3為cos56-r2c1ΔUL44圖譜?；蚍较虿幌?。
圖4為SetC圖譜。cos6、cos28、cos14、cos56、cos48組成SetC，后者用PacI切去cos骨架后，轉(zhuǎn)染細胞，經(jīng)同源重組得到HSV1病毒。其中cos6的HSV1的UL2基因、cos56上的HSV1的UL44基因中各有一各Xba1位點，用于插入外源基因。
圖5為AAV載體質(zhì)粒pSNAV-1的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖6為AAV載體質(zhì)粒pSNAV-N1圖譜，其中ITR為AAV-1的ITR元件。
圖7為pSNAV-GFP圖譜。GFP(綠色熒光蛋白)基因由人CMV病毒的立即早期啟動子啟動，polyA來自SV40病毒。GFP表達盒兩端是AAV2的ITR(反向末端重復(fù))。將本發(fā)明的重組HSV病毒HSV-r2c1感染已經(jīng)轉(zhuǎn)染pSNAV-GFP的細胞株，能得到帶有AAV1血清型的表達報告基因GFP的AAV病毒載體。
圖8為重組AAV質(zhì)粒pSNAV-GH的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖9為重組AAV質(zhì)粒pSNAV-N1-GH的結(jié)構(gòu)示意圖，其中ITR為AAV-1的ITR元件。
圖10為豬生長激素基因特異的PCR引物序列和測序結(jié)果。
具體實施方式
以下通過實施例進一步詳細描述本發(fā)明。但是，所有實施例不以任何方式構(gòu)成對本
發(fā)明內(nèi)容
的限定。
實施例1 從乳豬腦垂體擴增豬的生長激素基因?qū)⒊錾恢艿拈L白豬乳豬從左前肢處心臟放血處死，迅速切開豬顱骨，充分暴露顱底腦組織，在顱底垂體窩處用DEPC水處理過的鑷子小心取下豬腦垂體。將垂體在DEPC處理過的緩沖液中洗1次，然后將垂體放入干烤滅菌的組織勻漿器中，進行勻漿處理。
按照提取RNA的實驗方法，將經(jīng)勻漿處理后的垂體組織用總RNA提取Trizol試劑盒(Gibco公司)進行RNA的快速提取。以所提取的RNA做為模板，以O(shè)ligoT為引物進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，之后取5ul產(chǎn)物為模板，用所設(shè)計的豬生長激素基因的PCR引物進行體外基因擴增。PCR的上游引物primer 1和下游引物primer 2的序列分別為primer 15’ta ggt acc atg gct gca ggc cct cgg a 3’(SEQ ID NO.4)primer 25’gt aga tct cta gaa ggc aca gct gct ctc 3’(SEQ ID NO.5)其中，primer 1中設(shè)計了KpnI酶切位點，primer 2中設(shè)計了Bgl II酶切位點。
PCR反應(yīng)條為94℃ 45秒、56℃ 45秒、72℃ 45秒，30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物進行電泳，電泳結(jié)果證實得到獲得的DNA片段與豬的生長激素基因大小相符。
將PCR產(chǎn)物DNA插入克隆載體T-easy Vector(Promega公司，得到重組質(zhì)粒pTeasy-GH。用此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.Coli.DH5α后，挑取轉(zhuǎn)化菌克隆，進行質(zhì)粒DNA的快速提取。經(jīng)過酶切鑒定，初步確定T-easy Vector載體中插入的DNA片段為豬生長激素基因的cDNA(含信號肽DNA片段)。然后進行DNA序列測定，確切證實所插入的DNA片段為豬生長激素基因的cDNA，測序結(jié)果見附圖10，該序列與GeneBank公布的豬生長激素序列(E00229，E00217)完全一致。將此重組質(zhì)粒的保留均種大量擴增，進行DNA的大量提取。
實施例2 通用型AAV載體質(zhì)粒pSNAV-1的構(gòu)建首先采用酶切、補平、再連接的方式，經(jīng)兩步克隆去除pSV2neo上的EcoR I和Bgl II位點，成為pSV2neoΔEΔB；將pCMV-lacZ中CMV啟動子控制下的LacZ表達盒用Xho I和BamH I切出并回收，連接入pAV53質(zhì)粒(含有AAV-2病毒兩端的ITR序列)用Xho I和BamHI雙切后的ITR中間，構(gòu)成攜帶LacZ表達盒的AAV載體質(zhì)粒pAV-LacZ；pAV-LacZ用Bgl II酶切，回收ITR-CMV-LacZ-ITR片段，連接入pSV2neoΔEΔB的BamH I位點，構(gòu)成攜帶LacZ表達盒的又一AAV載體質(zhì)粒pSNAV-lacZ；用Xho I和BamH I雙切pSNAV-lacZ，去除其中的LacZ表達盒，代之以pCMVPA用Xho I和BamH I雙切得到的CMV和polyA片段，構(gòu)建成pSNAV-1(見附圖5)。
pSNAV-1含有AAV-2基因組兩端的ITR，在兩個ITR之間依次為CMV立早增強子和啟動子、多克隆位點和polyA信號。在ITR外側(cè)具有SV40啟動子控制下的新霉素抗性基因表達盒。質(zhì)粒的骨架上含有在大腸桿菌中進行復(fù)制所需的復(fù)制起點序列和氨芐青霉素抗性基因。多克隆位點包括KpnI、EcoR I、Sal I、Bgl II。所能容納的外源基因長度約為3.6kb。
實施例3 cos6-r2c1ΔUL2的構(gòu)建以AAV1(AAV1病毒株背景ATCC編號為ATCC VR645)為模板，PCR方法擴增出相應(yīng)的cap1(AAV1)(見引物1、2)。反應(yīng)條件94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 3min，30個循環(huán)，得到2210bp的PCR片段cap1，用限制性內(nèi)切酶KpnI+XbaI雙酶切后，與從pSSV9(pSSV9含AAV2的rep和cap基因的質(zhì)粒。Du B，Wu P，Boldt-Houle DM，Terwilliger EF GeneTher 1996，3254-61)用KpnI+XbaI切出的AAV2的rep2(1721bp)相連接，將連接產(chǎn)物裝入pGEM-p3zf(+)質(zhì)粒(Promega公司)的XbaI位點中，得到p3zf-r2c1質(zhì)粒。再用XbaI從p3zf-r2c1質(zhì)粒中切下r2c1(約4347bp)，裝入cos6的Xbal位點中，得到cos6-r2c1ΔUL2。
引物1AAV1 cap上游引物5’-GTCTGGAGCATGACTTTGGC-3’(SEQIDNO.2)引物2AAV1 cap下游引物5’-TCTAGAAGCGCAACCAAGCAGTTAAT-3’(SEQIDNO.3)實施例4 重組HSV1-r2c1的制備將cos6-r2c1ΔUL2與cos14，cos28，cos48，cos56等5個粘粒等摩爾混合，用PacI酶切去cos骨架(不必分離去除)，用酚、酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次，吸取上清，用2.5倍無水乙醇沉淀DNA。用lipofactamine(GIBCO BRL)20ul與10ug DNA按產(chǎn)品說明書共轉(zhuǎn)染80％鋪滿的BHK-21細胞(約2×106)細胞，5個HSV1片段將在細胞內(nèi)發(fā)生同源重組而分別產(chǎn)生HSV1-r2c1重組病毒。轉(zhuǎn)染24h后換用含2％FBS的1640培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)，每天換液一次。5天后細胞開始出現(xiàn)病變，待細胞完全病變后收培養(yǎng)液上清，2000r/min離心5min，上清分裝保存于-20℃。對獲得的重組病毒進行兩次空斑純化，可得到純一的HSV1-r2c1重組病毒。
實施例5 AAV包裝細胞株BHK/pSNAV-GFP和BHK/pSNAV-N1-GFP的建立在pSNAV-1質(zhì)粒(伍志堅、吳小兵、侯云德，系列腺病毒伴隨病毒載體的構(gòu)建及表達半乳糖苷酶的研究，病毒學(xué)報，2000，16(1)，1-6)的基礎(chǔ)上構(gòu)建成含有GFP基因的重組質(zhì)粒pSNAV-GFP，其結(jié)構(gòu)為帶有“ITR(AAV2)-外源基因-ITR(AAV2)”和抗性基因neo′的質(zhì)粒(見附圖8)。將該質(zhì)粒用脂質(zhì)體方法導(dǎo)入BHK-21細胞(ATCC CCL-10)，用G418 200ug/ml選擇培養(yǎng)10-15d，獲得的抗性細胞株命名為BHK/pSNAV-GFP。
AAV1和腺病毒5感染293細胞，3天后凍融細胞，5800g離心30分鐘，CsCl純化方法見(J.V.1997，718429-8436)。上述AAV1病毒在0.1％SDS、0.2毫克/毫升蛋白酶k，37℃作用3小時，再用酚/氯仿抽提2次，氯仿抽提1次，加醋酸鈉和酒精沉淀DNA，DNA沉淀后用TE(PH8.0)重懸，95℃、5分鐘，在0.3-1.0M NaCl中50-60℃處理2小時，使雙鏈退火。用QiaexIIgel extraction kit(Qiagen)純化瓊脂糖凝膠上跑出的約5Kb的AAV1 DNA帶，再用Klenow大片段補平末端，加上Xba I Linker(dCTCTAGAG)連接純化后Xba I切開，裝入pGEM-3zf(Promega公司產(chǎn)品)的Xba I位點中，在E.Coli DH5α Max Efficiency中擴增。挑出單克隆，提取質(zhì)粒，用內(nèi)切酶酶切以及rep2探針方法篩出含完整AAV1基因組的克隆，再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細胞，24小時后再感染HSV-1，2天后用Hirt法提取細胞染色體外小分子DNA，Dpn I酶切、Southern轉(zhuǎn)印，用rep探針雜交，用monomer以Dimer帶證明基因組完整性，得到pAAV1。pAAV1用Eco47-3和NcoI雙切，回收含AAV1 ITRs的載體質(zhì)粒片段用T4 DNA聚合酶補平，將Promega公司的pSV2neo的抗性基因neor用Bgl II和Sma I酶切回收抗性基因neor、用T4 DNA聚合酶補平，裝入含AAV1 ITRs的載體質(zhì)粒片段中，再將pSNAV-1用Xho I和BamH I酶切回收CMV-PolyA片段，用T4 DNA聚合酶補平，裝入含AAV1 ITRs的載體質(zhì)粒片段中，得到含有AAV1的ITR元件的重組質(zhì)粒pSNAV-N1。
在pSNAV-N1的基礎(chǔ)上構(gòu)建成含有GFP基因的重組質(zhì)粒pSNAV-N1-GFP，其結(jié)構(gòu)為帶有“ITR(AAV1)-外源基因-ITR(AAV1)”和抗性基因neor的質(zhì)粒。將該質(zhì)粒用脂質(zhì)體方法導(dǎo)入BHK-21細胞(ATCC CCL-10)，用G418 200ug/ml選擇培養(yǎng)10-15d，獲得的抗性細胞株命名為BHK/pSNAV-N1-GFP。
實施例6 含豬生長激素基因的重組AAV 1病毒的制備將攜帶重組質(zhì)粒pTeasy-GH的E.Coli.DH5α菌種大量擴增，用堿裂解法進行質(zhì)粒DNA的大量提取。用Kpn I和Bgl II雙酶切將660bp的豬生長激素基因從pTeasy-GH質(zhì)粒中切出并回收；用Kpn I和Bgl II雙酶切AAV載體質(zhì)粒pSNAV-N1(結(jié)構(gòu)見附圖6)，將回收的660bp生長激素基因與雙酶切的pSNA-N1連接，得到重組AAV載體質(zhì)粒pSNAV-N1-GH(結(jié)構(gòu)見附圖9)。
用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pSNAV-N1-GH轉(zhuǎn)染至真核細胞株BHK-21細胞(ATCC CCL-10)中，用G418 800ug/ml選擇培養(yǎng)10～15天，每3天換液1次，直至獲得G418抗性細胞克隆。將各抗性細胞克隆混合、擴增作為豬生長激素基因的重組AAV1病毒的生產(chǎn)細胞。將細胞進行傳代并保種，獲得的抗性細胞株命名為BHK/pSNAV-N1-GH。
將生產(chǎn)細胞株BHK/pSNAV-N1-GH用轉(zhuǎn)瓶方式擴大培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)瓶(110×288mm)中細胞長滿后傾出培養(yǎng)液，用HSV1-r2c1感染BHK/pSNAV-N1-GH細胞，待細胞完全病變，蓋緊瓶蓋劇烈振搖，將瓶壁上的細胞全部洗脫至培養(yǎng)液中，收集病變的細胞及其培養(yǎng)液，裝至一只三角燒瓶中(其中便含有重組rAAV1-GH病毒)，然后進行重組病毒rAAV1-GH的分離和純化。
在三角瓶中加入氯仿25ml(10∶1v/v)，然后置37℃搖床中劇烈振搖1-2小時后室溫下靜置10min。加DNase和RNase至終濃度1ug/ml。輕輕混勻，室溫下消化45min。加入固體氯化鈉至終濃度1mol/L，振搖溶解。4℃12000rpm離心15min。取出上層水相，棄氯仿和沉淀。加PEG8000至終濃度10％(w/v)。振搖溶解。4℃放置過夜后，4℃11000rpm離心15min。將上清倒入干凈容器中。將離心管倒扣在吸水紙上，讓上清盡量流盡。用5mlPBS2+緩沖液將各離心管管底和管壁上的沉淀吹打洗脫下來合并，將其分裝至1.5-ml塑料離心管中(0.6ml/管)，加等體積的氯仿抽提。4℃12000rpm離心5min，在無菌操作下小心吸出上層水相，移入無菌管中。然后進行超濾，去除氯仿，即獲得純化的重組病毒rAAV1-GH。該病毒液體積比初始體積濃縮了200倍。
同樣，用與上面相同方法和步驟，用Kpn I和Bgl II雙酶切將660bp的豬生長激素基因從pTeasy-GH質(zhì)粒中切出并回收；用Kpn I和Bgl II雙酶切AAV載體質(zhì)粒pSNAV-1將回收的660bp生長激素基因與雙酶切的pSNAV-1連接，得到重組AAV載體質(zhì)粒pSNAV-GH；將該質(zhì)粒用脂質(zhì)體方法導(dǎo)入BHK-21細胞，用G418 200ug/ml選擇培養(yǎng)10-15d，獲得的抗性細胞株命名為BHK/pSNAV-GH；將生產(chǎn)細胞株BHK/pSNAV-GH用同樣的轉(zhuǎn)瓶方式擴大培養(yǎng)，同樣用HSV1-r2c1感染BHK/pSNAV-GH細胞株，得到重組rAAV1-GH病毒，用相同的分離和純化方法獲得體積比初始體積濃縮了200倍的重組rAAV1-GH病毒。
實施例7 用含有綠色熒光蛋白基因的重組AAV1病毒給小豬肌肉注射為了了解重組AAV1病毒在豬肌肉組織中的表達情況，取含有綠色熒光蛋白基因的重組AAV1病毒(rAAV1-GFP)用PBS緩沖液2ml稀釋，給出生30公斤左右的長白豬(雌、雄各1只)進行頸部肌肉注射，注射劑量為1×10(e9)病毒顆粒/kg體重。在注射部位用苦味酸做記號。GFP-rAAV病毒顆粒注射后第15天、30天、45天分別施行手術(shù)，在注射區(qū)域分別取少量肌肉組織，冰凍切片后，放在載玻片上，在倒置熒光顯微鏡下用長波紫外線激發(fā)觀察。觀察結(jié)果顯示，兩只豬在15天、30天、45天所取的肌肉組織均有綠色熒光蛋白(GFP)的表達，且隨時間的延長，GFP的表達強度增強。
rAAV1-GFP的制備方法用HSV1-r2c1感染BHK/pSNAV-GFP細胞或BHK/pSNAV-N1-GFP，細胞病變(36-72h)后反復(fù)凍融4次裂解細胞。細胞裂解液中含有rAAV/r2c1-GFP和輔助病毒HSV1-r2c1。低速離心去除細胞碎片，取裂解液56℃處理30min以滅活輔助病毒HSV1-r2c1，得到細胞裂解液上清中含有的AAV1血清型的rAAV1-GFP。
實施例8 用含有豬生長激素基因的重組AAV1病毒給豬肌肉注射選用32頭血緣相近、日齡一致、體重相仿的長白豬健康生長豬(30±1.0kg)，公母各半，按體重隨機分為兩組，試驗組24頭，分三圈飼養(yǎng)，每圈8頭，公母各4頭，對照組8頭，同樣公母各4頭。采用豬場自配的飼料日糧，由玉米、麥麩、豆粕、菜籽柏等和要原料組成試驗組和對照組豬群的飼養(yǎng)管理條件盡可能一致，試驗開始前先預(yù)飼10天，期間按豬場正常程序進行常規(guī)免疫，并進行驅(qū)蟲和去勢，然后開始為期6周的正試期。豬群自由采水，飼料記量不限量。
取含有豬生長激素基因的重組病毒rAAV1-GH按每公斤體重肌肉注射1×10(9e)病毒顆粒。另外，用不含生長激素的重組AAV病毒用同樣的方法和劑量，給對照組豬進行頸部肌肉注射。在注射部位用苦味酸做記號。
在六周試驗期間及結(jié)束當天早飼前稱量并記錄每頭豬的體重，以圈為單位記錄耗料量。生產(chǎn)性能測試指標主要有日增重、日采食量、飼料增重比(也稱為飼料報酬率)。在正試期結(jié)束即屠宰所有參試豬只，測定胴體重量，分離瘦肉，計算每頭豬的瘦肉率。
統(tǒng)計分析原始數(shù)據(jù)按重復(fù)為單位進行整理，日增重、日采食量、飼料增重比按單因子樣本數(shù)不等有重復(fù)對比試驗進行t檢驗。
肌肉注射含豬生長激素基因1型重組腺相關(guān)病毒對生長肥豬體增重、瘦肉率和飼料利用率的影響見下表
試驗階段及指標 試驗組 對照組飼料初始體重(IWT/kg) 30.5+1.0 30.2+1.2平均日耗料量(ADFI/g) 1953.49±169.21N1918.2±179.12平均日增重(ADG/g) 743.62±48.2**550.83±62.3飼料增重比(F/G) 2.627*3.48由上表可見，注射1型重組腺相關(guān)病毒可使豬的日增重比對照組提高35％，經(jīng)t檢驗，試驗組與對照組差異極顯著(P＜0.01)，使飼料增重比減少24.05％，差異顯著(P＜0.05)。試驗組瘦肉率提高增加18％。從以上試驗結(jié)果可以看出，注射含豬生長激素基因的1型重組腺相關(guān)病毒可以顯著地促進生長肥育豬的生長和提高飼料報酬率。
序列表<110>本元正陽基因技術(shù)股份有限公司<120>促進動物的快速生長和改進肉質(zhì)的方法<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4347<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>rep2cap1<400>1ctagagtcct gtattagagg tcacgtgagt gttttgcgac attttgcgac accatgtggt 60cacgctgggt atttaagccc gagtgagcac gcagggtctc cattttgaag cgggaggttt 120gaacgcgcag ccgccatgcc ggggttttac gagattgtga ttaaggtccc cagcgacctt 180gacgggcatc tgcccggcat ttctgacagc tttgtgaact gggtggccga gaaggaatgg 240gagttgccgc cagattctga catggatctg aatctgattg agcaggcacc cctgaccgtg 300gccgagaagc tgcagcgcga ctttctgacg gaatggcgcc gtgtgagtaa ggccccggag 360gcccttttct ttgtgcaatt tgagaaggga gagagctact tccacatgca cgtgctcgtg 420gaaaccaccg gggtgaaatc catggttttg ggacgtttcc tgagtcagat tcgcgaaaaa 480ctgattcaga gaatttaccg cgggatcgag ccgactttgc caaactggtt cgcggtcaca 540aagaccagaa atggcgccgg aggcgggaac aaggtggtgg atgagtgcta catccccaat 600tacttgctcc ccaaaaccca gcctgagctc cagtgggcgt ggactaatat ggaacagtat 660ttaagcgcct gtttgaatct cacggagcgt aaacggttgg tggcgcagca tctgacgcac 720gtgtcgcaga cgcaggagca gaacaaagag aatcagaatc ccaattctga tgcgccggtg 780atcagatcaa aaacttcagc caggtacatg gagctggtcg ggtggctcgt ggacaagggg 840attacctcgg agaagcagtg gatccaggag gaccaggcct catacatctc cttcaatgcg 900gcctccaact cgcggtccca aatcaaggct gccttggaca atgcgggaaa gattatgagc 960ctgactaaaa ccgcccccga ctacctggtg ggccagcagc ccgtggagga catttccagc 1020aatcggattt ataaaatttt ggaactaaac gggtacgatc cccaatatgc ggcttccgtc 1080tttctgggat gggccacgaa aaagttcggc aagaggaaca ccatctggct gtttgggcct 1140gcaactaccg ggaagaccaa catcgcggag gccatagccc acactgtgcc cttctacggg 1200tgcgtaaact ggaccaatga gaactttccc ttcaacgact gtgtcgacaa gatggtgatc 1260tggtgggagg aggggaagat gaccgccaag gtcgtggagt cggccaaagc cattctggga 1320ggaagcaagg tgcgcgtgga ccagaaatgc aagtcctcgg cccagataga cccgactccc 1380gtgatcgtca cctccaacac caacatgtgc gccgtgattg acgggaactc aacgaccttc 1440gaacaccagc agccgttgca agaccggatg ttcaaatttg aactcacccg ccgtctggat 1500catgactttg ggaaggtcac caagcaggaa gtcaaagact ttttccggtg ggcaaaggat 1560cacgtggttg aggtggagca tgaattctac gtcaaaaagg gtggagccaa gaaaagaccc 1620
gcccccagtg acgcagatat aagtgagccc aaacgggtgc gcgagtcagt tgcgcagcca 1680tcgacgtcag acgcggaagc ttcgatcaac tacgcagaca ggtaccaaaa caaatgttct 1740cgtcacgcgg gcatgcttca gatgctgttt ccctgcaaga catgcgagag aatgaatcag 1800aatttcaaca tttgcttcac gcacgggacg agagactgtt cagagtgctt ccccggcgtg 1860tcagaatctc aaccggtcgt cagaaagagg acgtatcgga aactctgtgc cattcatcat 1920ctgctggggc gggctcccga gattgcttgc tcggcctgcg atctggtcaa cgtggacctg 1980gatgactgtg tttctgagca ataaatgact taaaccaggt atggctgccg atggttatct 2040tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc gagtggtggg acttgaaacc 2100tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac gacggccggg gtctggtgct 2160tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac aagggggagc ccgtcaacgc 2220ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac cagcagctca aagcgggtga 2280caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt caggagcgtc tgcaagaaga 2340tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag gccaagaagc gggttctcga 2400acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct ggaaagaaac gtccggtaga 2460gcagtcgcca caagagccag actcctcctc gggcatcggc aagacaggcc agcagcccgc 2520taaaaagaga ctcaattttg gtcagactgg cgactcagag tcagtccccg atccacaacc 2580tctcggagaa cctccagcaa cccccgctgc tgtgggacct actacaatgg cttcaggcgg 2640tggcgcacca atggcagaca ataacgaagg cgccgacgga gtgggtaatg cctcaggaaa 2700ttggcattgc gattccacat ggctgggcga cagagtcatc accaccagca cccgcacctg 2760ggccttgccc acctacaata accacctcta caagcaaatc tccagtgctt caacgggggc 2820cagcaacgac aaccactact tcggctacag caccccctgg gggtattttg atttcaacag 2880attccactgc cacttttcac cacgtgactg gcagcgactc atcaacaaca attggggatt 2940ccggcccaag agactcaact tcaaactctt caacatccaa gtcaaggagg tcacgacgaa 3000tgatggcgtc acaaccatcg ctaataacct taccagcacg gttcaagtct tctcggactc 3060ggagtaccag cttccgtacg tcctcggctc tgcgcaccag ggctgcctcc ctccgttccc 3120ggcggacgtg ttcatgattc cgcaatacgg ctacctgacg ctcaacaatg gcagccaagc 3180cgtgggacgt tcatcctttt actgcctgga atatttccct tctcagatgc tgagaacggg 3240caacaacttt accttcagct acacctttga ggaagtgcct ttccacagca gctacgcgca 3300cagccagagc ctggaccggc tgatgaatcc tctcatcgac caatacctgt attacctgaa 3360cagaactcaa aatcagtccg gaagtgccca aaacaaggac ttgctgttta gccgtgggtc 3420tccagctggc atgtctgttc agcccaaaaa ctggctacct ggaccctgtt atcggcagca 3480gcgcgtttct aaaacaaaaa cagacaacaa caacagcaat tttacctgga ctggtgcttc 3540aaaatataac ctcaatgggc gtgaatccat catcaaccct ggcactgcta tggcctcaca 3600caaagacgac gaagacaagt tctttcccat gagcggtgtc atgatttttg gaaaagagag 3660cgccggagct tcaaacactg cattggacaa tgtcatgatt acagacgaag aggaaattaa 3720agccactaac cctgtggcca ccgaaagatt tgggaccgtg gcagtcaatt tccagagcag 3780cagcacagac cctgcgaccg gagatgtgca tgctatggga gcattacctg gcatggtgtg 3840gcaagataga gacgtgtacc tgcagggtcc catttgggcc aaaattcctc acacagatgg 3900acactttcac ccgtctcctc ttatgggcgg ctttggactc aagaacccgc ctcctcagat 3960cctcatcaaa aacacgcctg ttcctgcgaa tcctccggcg gagttttcag ctacaaagtt 4020tgcttcattc atcacccaat actccacagg acaagtgagt gtggaaattg aatgggagct 4080gcagaaagaa aacagcaagc gctggaatcc cgaagtgcag tacacatcca attatgcaaa 4140atctgccaac gttgatttta ctgtggacaa caatggactt tatactgagc ctcgccccat 4200tggcacccgt taccttaccc gtcccctgta attacgtgtt aatcaataaa ccggttgatt 4260cgtttcagtt gaactttggt ctcctgtcct tcttatctta tcggttacca tggttatagc 4320
ttacacatta actgcttggt tgcgctt 4347<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于AAV1的cap1的上游引物<400>2gtctggagca tgactttggc 20<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于AAV1的cap1的下游引物<400>3tctagaagcg caaccaagca gttaat 26<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于豬的生長激素基因的上游引物<400>4taggtaccat ggctgcaggc cctcgga 27<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于豬的生長激素基因的下游引物<400>5gtagatctct agaaggcaca gctgctctc 29
權(quán)利要求
1.一種能表達目的DNA的重組腺病毒伴隨病毒，其中的目的DNA存在于病毒伴隨病毒兩個ITR元件之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的重組AAV病毒，其中所述的目的DNA編碼與動物生長相關(guān)的因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的重組AAV病毒，其中所述的目的DNA編碼的動物生長相關(guān)的因子選自動物生長激素(GH)、動物生長激素釋放激素(GHRH)。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1-3中任一項所述的重組AAV病毒，其中所述的腺病毒伴隨病毒為人腺病毒伴隨病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的重組AAV病毒，其中所述的腺病毒伴隨病毒為人1型腺病毒伴隨病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的重組AAV病毒，其中所攜帶的目的DNA為天然或人工合成的豬生長激素(GH)的編碼序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的重組AAV病毒，其中所攜帶的目的DNA為天然或人工合成的豬生長激素釋放激素(GHRH)的編碼序列。
8.一種促進動物生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率并改善動物肉質(zhì)的方法，該方法包括利用專利要求1-7中任一項所述的重組腺病毒伴隨對動物進行肌肉注射。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其中所述動物選自豬、牛、羊等飼養(yǎng)動物。
10.根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其中所述動物為豬。
11.根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其中是在動物生長的早、中期對其進行肌肉注射。
12.一種促進豬的生長并提供其瘦肉比例的方法，該方法包括用含有天然或人工合成的豬生長激素基因重組人1型腺病毒伴隨病毒對豬進行肌肉注射。
專利摘要
本發(fā)明敘述了一種用腺病毒伴隨病毒載體尤其是用1型腺病毒伴隨病毒載體導(dǎo)入生長激素基因或相關(guān)基因的方法促進動物快速生長和改進動物肉質(zhì)。本發(fā)明能顯著提高飼料利用率和促進動物的生長。
文檔編號C12N15/12GKCN1626652SQ200310117208
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月8日
發(fā)明者董小巖 申請人:本元正陽基因技術(shù)股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan