專利名稱:雙重?zé)晒鈖cr－改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光PCR-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法。
背景技術(shù)：
食源性疾病發(fā)病率較高，例如霍亂弧菌引起霍亂，傷寒沙門氏菌和志賀氏菌分別引起傷寒和痢疾。霍亂、傷寒、痢疾屬我國的重點傳染病。副溶血弧菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、變形桿菌等引起的食物中毒，其發(fā)病率在我國食源性疾病發(fā)病率中占較高的比例。目前這些食源性致病菌仍以傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定的方法進(jìn)行檢測。這種傳統(tǒng)檢測方法操作繁瑣，耗時耗力，一般需5天時間，最長的還需要一個月的時間，而且生化試驗和血清學(xué)試驗不穩(wěn)定；檢測靈敏度較低。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們采用PCR技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌的診斷。例如中國專利公開號為CN1526825的專利申請，披露了一種利用副溶血弧菌pR72H序列的特異性，通過DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳觀察等現(xiàn)代分子生物學(xué)手段檢測副溶血弧菌的方法。然而該P(yáng)CR技術(shù)易污染，造成檢測失敗，還需電泳。自1995年美國PE公司提出實時PCR檢測原理后，實時PCR以其快速、定量、無需后電泳、無交叉污染等突出優(yōu)點而被廣泛采用。
分子信標(biāo)是1996年Tyagi等提出來的一種具有頸環(huán)構(gòu)型的分子探針，是基于核酸堿基配對原則和熒光共振能量現(xiàn)象設(shè)計的，在PCR擴(kuò)增的退火階段，分子信標(biāo)與生成的靶序列結(jié)合發(fā)出熒光，在延伸階段，則脫離靶序列而不干擾擴(kuò)增，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，與模板結(jié)合的分子信標(biāo)的量亦增加，最終的熒光強(qiáng)度與模板量成正比。
但目前所采用的實時PCR方法為單一熒光PCR方法，只能檢測一種致病菌，且檢測速度和靈敏度仍不能滿足要求。隨著生態(tài)環(huán)境的變化和抗生素的濫用，許多致病菌引起的臨床癥狀越來越不典型，常常需要同時檢測多種細(xì)菌才能確定病原。這就對快速診斷技術(shù)提出了更高的要求又快又能同時檢測多種病原微生物。因此急需開發(fā)同時快速診斷多種細(xì)菌的方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)操作繁瑣、耗時長等缺點，以及不能同時快速地檢測多種食源性致病菌的缺陷而提供一種雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法，根據(jù)待測兩種致病菌的特異基因序列設(shè)計一對引物1和改良分子信標(biāo)探針1，以及一對引物2和改良分子信標(biāo)探針2，采用熒光PCR-改良分子信標(biāo)擴(kuò)增待測兩種致病菌特異基因的序列，利用分子信標(biāo)與擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交，檢測反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度，以達(dá)到設(shè)定的閾值時所需的循環(huán)次數(shù)Ct值作為結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)，Ct值為0或40陰性；Ct小于38陽性。
熒光PCR-改良分子信標(biāo)擴(kuò)增基因序列的反應(yīng)體系為1×PCR緩沖液MgCl20.5～5mmoldNTP各 0.05～1.5mmol引物1 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol引物2 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol探針1 0.1～1.0μmol探針2 0.1～1.0μmolTaq酶 0.2～10U模板 1～20μl總體積 20～100μl所述熒光PCR-改良分子信標(biāo)擴(kuò)增特異基因序列的反應(yīng)條件是90～100℃預(yù)變性3～10分鐘，40～50個循環(huán)中92～95℃變性15～60秒，50～60℃退火15～60秒，70～72℃延伸15～120秒。
所述檢測的食源性致病菌為選自霍亂弧菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌，以及O157H7大腸桿菌中的一種或兩種的組合。
所述致病菌的特異基因序列分別為霍亂弧菌腸毒素基因ctxA序列、副溶血弧菌耐熱直接溶血素基因TDH序列、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因NUC、單增李斯特氏菌的溶血素基因hly的序列、沙門氏菌的侵襲基因ivnA序列、志賀氏菌的編碼侵襲性質(zhì)粒抗原H基因ipaH序列，以及O157H7大腸桿菌的溶血素基因rfbE序列。
所述改良分子信標(biāo)的引物和探針分別為ctxA基因的一對引物ctxA-F5′-TCCGGAGCATAGAGCTTGGA-3′，ctxA-R5′-TCGATGATCTTGGAGCATTCC-3′ctxA基因的探針HEX-5′-CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-3′Dabcyl，TDH基因的一對引物TDH-F5′-AAACATCTGCTTTTGAGCTTCCA-3′，TDH-R5′-CTCGAACAACAAACAATATCTCATCAG-3′，TDH基因的探針FAM 5′-CCGGGGTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGG-Dabcyl，NUC基因的一對引物NUC-F5’-GGCAATACGCAAAGAGGTT-3’NUC-L5’-CTTCTTCTATTTACGCCGTTATC-3’NUC基因的探針ROX-5’-CGATGCAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCG-3’-DABCYLhly基因的一對引物hly-F5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’hly-L5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’hly基因的探針
FAM-5’-CGCGCTTGTATATACTTATCGATTTCATCCGCGCG-3’-DABCYLinvA基因的一對引物invA-F5’-GCGGAATATC(I)ATGACGCAGCT-3’invA-L5’-CGCTACGTTTTGCTTCACGG-3’invA基因的探針5’-FAM-CCGCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCGG-DABCYL-3’ipaH基因的一對引物ipaH-F5’-TGAAGGAAATGCGTTTCTATG-3’ipaH-L5’-AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3’ipaH基因的探針CY55’-CACGGCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTG-3’-DABCYLrfbE基因的一對引物rfbE-L5’-AGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC-3’rfbE-R5’-GCTTGTTCTAACTGGGCTAATC-3’rfbE基因的探針5’-FAMCGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCCG-DABCYL-3’，其中劃線部分為改良分子信標(biāo)探針的靶序列。
所述的雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法，還進(jìn)一步包括對待測樣品處理和模板提取步驟。
所述樣品包括食品樣品、糞便、嘔吐物標(biāo)本，其中處理糞便、嘔吐物標(biāo)本及提取模板是根據(jù)糞便和嘔吐物量的多少，用100-200μL生理鹽水懸浮，煮沸，10000rpm離心2分鐘，取5μL上清液即可用于實時PCR反應(yīng)；食品樣品的處理和模板的提取是將食品樣品在針對待測細(xì)菌的增菌液中增菌后，共取1.2mL增菌液10000rpm離心5分鐘，棄其上清液后，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用于實時PCR反應(yīng)；或棄其上清液后加入裂解液裂解，經(jīng)酚-氯仿抽提，且乙醇沉淀后，加入20μL水溶解，取5μL溶液用于實時PCR反應(yīng)。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明在改良分子信標(biāo)技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了雙重實時PCR同時檢測兩種細(xì)菌的方法，此方法(1)根據(jù)不同需要，可隨機(jī)組合兩種細(xì)菌同時進(jìn)行檢測；(2)靈敏度高，樣品含32-100cfu/ml細(xì)菌即可檢出；(3)特異性強(qiáng)，與對照組十幾種細(xì)菌無交叉反應(yīng)；(4)操作簡單，結(jié)果觀察直觀明了，可一次檢測96份標(biāo)本(含陰陽性對照)；(5)檢測速度快，檢測大便和嘔吐物標(biāo)本僅需2小時檢測時間，檢測食品樣品僅需1-2天時間(包括樣品的前期處理)。



圖1至圖3為本發(fā)明熒光PCR-改良分子信標(biāo)檢測曲線圖。
具體實施方式
本發(fā)明以7種食源性致病菌的檢測為例，可隨機(jī)兩兩組合，來分析雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)的檢測方法，從而實現(xiàn)快速準(zhǔn)確地同時檢測兩種致病菌。
改良分子信標(biāo)探針是為了提高雜交效率，在原來分子信標(biāo)原理基礎(chǔ)上提出的。改良分子信標(biāo)的突出特點是將分子信標(biāo)的臂部分也作為靶識別序列，而不僅僅是用于形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的無關(guān)添加序列。對于同樣長度的檢測靶序列，改良分子信標(biāo)比分子信標(biāo)更短，而且由于臂序列不再懸空，因而與靶序列的結(jié)合更趨緊密。改良分子信標(biāo)比分子信標(biāo)更易設(shè)計且成功率更高，同時對擴(kuò)增條件要求不嚴(yán)格，因此對于多個靶序列的同時檢測，改良分子信標(biāo)的優(yōu)勢更加明顯。
根據(jù)GenBank公布的7種食源性致病菌的毒素基因或侵襲基因的保守序列，即霍亂弧菌的ctxA、副溶血弧菌的TDH、沙門氏菌的invA、志賀氏菌的ipaH、金黃色葡萄球菌的NUC和單增李斯特氏菌的hly基因，O157H7大腸桿菌的溶血素基因rfbE，分別設(shè)計引物和改良分子信標(biāo)探針，用不同的熒光劑標(biāo)記7條探針，同時以十幾種細(xì)菌作對照，建立熒光PCR-改良分子信標(biāo)檢測7種食源性致病菌的反應(yīng)體系。并將此檢測體系應(yīng)用于常見細(xì)菌性食物中毒的快速診斷。用雙重?zé)晒釶CR檢測食源性致病菌的方法主要包括以下步驟(1)根據(jù)GenBank公布的食源性致病菌的毒素基因或侵襲基因的保守序列，分別設(shè)計引物和改良分子信標(biāo)探針；(2)待測樣品處理和模板提?。?3)熒光PCR擴(kuò)增；(4)檢測熒光信號，以達(dá)到設(shè)定的閾值時所需的循環(huán)次數(shù)Ct值作為結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)。
其中步驟(2)樣品處理和模板提取，樣品適用范圍包括食品樣品、糞便、嘔吐物等標(biāo)本。對于糞便、嘔吐物標(biāo)本，根據(jù)糞便和嘔吐物量的多少，用100-200μL生理鹽水懸浮，煮沸，10000rpm離心2分鐘，取5μL上清液即可用于實時PCR反應(yīng)。食品樣品的處理和模板的提取是將食品樣品在針對待測細(xì)菌的增菌液中增菌后，取1mL增菌液于10000rpm離心5分鐘，棄其上清液后，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用于實時PCR反應(yīng)；或棄其上清液后加入裂解液裂解，經(jīng)酚-氯仿抽提，且乙醇沉淀后，加入20μL水溶解，取5μL溶液用于實時PCR反應(yīng)。
步驟(3)的熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為1×PCR緩沖液MgCl20.5～5mmoldNTP各 0.05～1.5mmol引物1 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol引物2 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol探針1 0.1～1.0μmol探針2 0.1～1.0μmolTaq酶 0.2～10U模板 1～20μl總體積 20～100μl
以上試劑組分10×PCR緩沖液，MgCl2，Taq酶，dNTP均購自中國大連寶生物公司。反應(yīng)條件是94～95℃預(yù)變性3～10分鐘，40個循環(huán)中94～95℃變性15～30秒，50～55℃退火15～30秒，72℃延伸15～30秒。
步驟(4)檢測熒光信號的Ct值，是采用iCycler實時PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司)或MX4000熒光PCR擴(kuò)增儀退火階段檢測熒光，一次可檢測96份樣品(包括陰陽對照)。根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果Ct值為0或40表示呈陰性；Ct小于38表示呈陽性；Ct在38-40之間時，樣品需重新檢測。檢測大便和嘔吐物標(biāo)本僅需2小時檢測時間，檢測食品標(biāo)本僅需1-2天時間(包括樣品的前期處理)。
例一本例中以雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測霍亂弧菌和副溶血弧菌為例。根據(jù)GenBank公布的霍亂弧菌腸毒素基因(ctxA)的序列和副溶血弧菌耐熱直接溶血素基因(TDH)序列并比較分析，分別設(shè)計一對引物和探針。
ctxA基因的引物1和探針1ctxA-F5′-TCCGGAGCATAGAGCTTGGA-3′，ctxA-R5′-TCGATGATCTTGGAGCATTCC-3′ctxA-ProbeHEX-5′-CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-3′Dabcyl，TDH基因的引物2和探針2TDH-F5′-AAACATCTGCTTTTGAGCTTCCA-3′，TDH-L5′-CTCGAACAACAAACAATATCTCATCAG-3′，TDH-ProbeFAM 5′-CCGGGGTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGG-Dabcyl，試驗用菌株12種細(xì)菌共104株菌株。包括1株沙門氏菌(Salmonella)、1株志賀氏菌(Shigella)、5株產(chǎn)毒性大腸桿菌(EnterotoxinEscherichia coli)(1株菌株血清學(xué)試驗為陽性，4株菌株血清學(xué)試驗和腸毒素試驗陽性)、1株金黃色葡萄球菌(S.aureus)、1株蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)、1株李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、1株溶藻弧菌(V.algionolyticus)、1株河弧菌(V.fluvialis)、1株創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)、1株變形桿菌(Proteus)、40株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)和50株霍亂弧菌(V.cholera)。溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌由廣東省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗所提供，其余菌株均購自中國藥品生物制品檢定所?；魜y弧菌的分離鑒定和腸毒素實驗按照《霍亂防治手冊》(1999年版)操作。其他11種細(xì)菌的分離和鑒定以及產(chǎn)毒性大腸桿菌的腸毒素試驗均按照中華人民共和國頒布的《食品微生物學(xué)》國家檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作。
利用上述PCR體系同時檢測霍亂弧菌和副溶血弧菌的方法還包括以下步驟(1)樣品處理和模板提取樣品適用范圍包括食品樣品、糞便、嘔吐物等標(biāo)本，糞便、嘔吐物標(biāo)本的處理及提取方法與前述方法相同；食品樣品25g食品放在225mL堿性蛋白胨水中增菌6-8小時后，取1mL增菌液，10000rpm離心5分鐘，棄取上清液，加入30μL水溶解，煮沸，取5μL上清液用于實時PCR反應(yīng)。
(2)熒光PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為1×PCR緩沖液MgCl22.5μLdNTP各 1.5mmol引物1 0.05mmol引物2 0.2μmol+0.2μmol探針1 0.2μmol探針2 0.2μmolTaq酶 1U模板 10μl總體積 25μl
實時PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘，45個循環(huán)中94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒。
(3)檢測采用iCycler實時PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司)退火階段檢測熒光，將含反應(yīng)液的PCR管逐一放到熒光PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行檢測。根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果Ct值為0或40陰性；Ct小于38陽性；Ct在38-40之間樣品需重新檢測，儀器檢測時間2小時。
用本例的雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測含霍亂弧菌和/或副溶血弧菌的體系。圖1(a)為不含霍亂弧菌或副溶血弧菌的空白體系的熒光PCR擴(kuò)增儀測定的熒光強(qiáng)度曲線，圖1(b)為雙重?zé)晒釶CR檢測同時含有霍亂弧菌和副溶血弧菌的熒光強(qiáng)度曲線，圖1(c)為熒光PCR檢測含有霍亂弧菌的熒光強(qiáng)度曲線，圖1(d)為雙重?zé)晒釶CR檢測含有副溶血弧菌的熒光強(qiáng)度曲線。由圖1比較分析，雙重?zé)晒釶CR檢測兩種細(xì)菌，無交叉反應(yīng)，相互之間沒有干擾和抑制作用，熒光信號沒有減弱，且特異性強(qiáng)。
共采集148份樣品，48份食物中毒樣品和100份海產(chǎn)品。148份樣品用前述雙重?zé)晒釶CR進(jìn)行檢測，同時采用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法進(jìn)行驗證。熒光PCR方法和傳統(tǒng)檢測方法結(jié)果的符合率為100％，熒光PCR靈敏度高于傳統(tǒng)檢測方法。見表1。
表1 傳統(tǒng)檢測方法和熒光PCR檢測方法的比較


(4)特異性分析特異性檢測以沙門氏菌、志賀氏菌、產(chǎn)毒性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、李斯特氏菌、溶藻弧菌、河弧菌、創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的DNA作對照，對霍亂弧菌和副溶血弧菌進(jìn)行ctxA和TDH改良分子信標(biāo)實時PCR擴(kuò)增。特異性分析結(jié)果表明，只有含ctxA基因的霍亂弧菌和含TDH基因的副溶血弧菌有熒光信號，其他細(xì)菌無熒光信號，進(jìn)一步證明了熒光PCR的特異性。見表2。
表2 霍亂弧菌和副溶血弧菌雙重實時PCR特異性分析


由表2可見，本發(fā)明的熒光PCR-改良分子信標(biāo)探針特異性強(qiáng)，與對照組10種細(xì)菌無交叉反應(yīng)，尤其與霍亂弧菌毒力因子相似的產(chǎn)毒性大腸桿菌也無交叉反應(yīng)，即本例中所采用的4株腸毒素實驗為陽性的菌株也無熒光信號產(chǎn)生。
(5)靈敏度分析分別選1株小川型霍亂弧菌和1株副溶血弧菌作為靈敏度分析的代表株。菌液靈敏度分析菌株經(jīng)堿性蛋白胨水(APW)增菌過夜后，進(jìn)行10倍稀釋，共做10個稀釋度，然后依次取10個稀釋度的1mL菌液進(jìn)行實時PCR反應(yīng)。同時相對應(yīng)的按中華人民共和國頒布的《食品微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)》做細(xì)菌總數(shù)計數(shù)。本發(fā)明的熒光PCR方法靈敏度高，32-69cfu/mL細(xì)菌，即可檢出。
(6)重復(fù)性試驗分別對1株小川型霍亂弧菌和1株副溶血弧菌重復(fù)10次進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，10次Ct值相差不到0.1個循環(huán)。
例二根據(jù)GenBank公布的沙門氏菌的侵襲基因(ivnA)和志賀氏菌的編碼侵襲性質(zhì)粒抗原H基因(ipaH)的序列并比較分析，分別設(shè)計一對引物和探針。
invA基因的引物1invA-F5’-GCGGAATATC(I)ATGACGCAGCT-3’invA-L5’-CGCTACGTTTTGCTTCACGG-3’invA基因的探針15’-FAM-CCGCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCGG-DABCYL-3’ipaH基因的引物2ipaH-F5’-TGAAGGAAATGCGTTTCTATG-3’ipaH-L5’-AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3’ipaH基因的探針2ROX5’-CACGGCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTG-3’-DABCYL試劑組分10×PCR緩沖液，MgCl2，Taq酶，dNTP均購自中國大連寶生物公司。
試驗用菌株14種細(xì)菌共132株菌株。包括1株產(chǎn)毒性大腸桿菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)、1株侵襲性大腸桿菌(enteroinvasive E.coli，EIEC)、1株O157H7大腸桿菌(O157H7)、1株致病性大腸桿菌(enteropathogenic E.coli，EPEC)、1株枸櫞酸桿菌(Citrobacter)、1株大腸埃希氏菌E.coli、1株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、1株霍亂(V.cholera)弧菌、1株金黃色葡萄球菌(S.aureus)、1株單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、1株蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)、1株變形桿菌(Proteus)、70株沙門氏菌(Salmonella)(各種血清型)、50株志賀氏菌(Shigella)(各種血清型)。所有菌株均按照中華人民共和國頒布的《食品微生物學(xué)》國家檢驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分離和鑒定。
利用上述熒光PCR方法同時檢測沙門氏菌和志賀氏菌的方法還包括以下步驟
(1)樣品處理和模板提取樣品適用范圍包括食品樣品、糞便、嘔吐物等標(biāo)本；對糞便、嘔吐物標(biāo)本，根據(jù)糞便和嘔吐物量的多少，用100-200μL生理鹽水懸浮，煮沸，10000rpm離心2分鐘，取5μL 上清液即可用于實時PCR反應(yīng)；對于食品樣品，其中檢測沙門氏菌時，將25g食品放在225mLSC中增菌10個小時；對于志賀氏菌，將25g食品放在225mLGN中增菌10個小時，增菌后，取1mL增菌液，10000rpm離心5分鐘，棄其上清液，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用于實時PCR反應(yīng)。
(2)熒光PCR擴(kuò)增配制雙重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系1×PCR緩沖液MgCl22.5μLdNTP各 1.5mmol引物1 0.05mmol引物2 0.2μmol+0.2μmol探針1 0.2μmol探針2 0.2μmolTaq酶 1U模板 10μl總體積 25μl實時PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘，45個循環(huán)中94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒。
(3)檢測采用iCycler實時PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司)退火階段檢測熒光，一次可檢測96份樣品(包括陰陽對照)。結(jié)果判斷根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果Ct值為0或40陰性；Ct小于38陽性；Ct在38-40之間樣品需重新檢測。
用前述14種細(xì)菌共132株菌株進(jìn)行實驗，用本發(fā)明的單一或雙重?zé)晒釶CR方法分別檢測按前述方法配制的不含沙門氏菌或志賀氏菌空白體系、含有沙門氏菌和志賀氏菌的體系、含有沙門氏菌的體系、以及含有志賀氏菌的體系。采用iCycler實時PCR擴(kuò)增儀檢測退火階段熒光，熒光強(qiáng)度曲線如圖2。其中，圖2(a)為空白體系的熒光PCR擴(kuò)增儀測定的熒光強(qiáng)度曲線，圖2(b)為雙重?zé)晒釶CR檢測含有沙門氏菌和志賀氏菌的熒光強(qiáng)度曲線，圖2(c)為熒光PCR檢測含有沙門氏菌的熒光強(qiáng)度曲線，圖2(d)為熒光PCR檢測含有志賀氏菌的熒光強(qiáng)度曲線。由圖2比較分析，雙重?zé)晒釶CR檢測兩種細(xì)菌，無交叉反應(yīng)，相互之間沒有干擾和抑制作用，熒光信號沒有減弱，特異性強(qiáng)。
共采集350份樣品，包括食品樣品和食物中毒樣品。350份樣品用熒光PCR進(jìn)行檢測的同時采用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法進(jìn)行驗證。按上述方法對樣品進(jìn)行處理及模板的提取后進(jìn)行檢測，傳統(tǒng)檢測方法和熒光PCR檢測方法的比較見表3。
表3 傳統(tǒng)檢測方法和熒光PCR檢測方法的比較


雙重?zé)晒釶CR方法檢測大便和嘔吐物標(biāo)本僅需2小時檢測時間，檢測食品標(biāo)本僅需1天時間(包括樣品的前期處理)，可同時檢測兩種細(xì)菌。因此雙重?zé)晒釶CR方法省時省力，準(zhǔn)確性高，可滿足疾病的快速診斷。而且，熒光PCR方法和傳統(tǒng)檢測方法結(jié)果的符合率為100％，熒光PCR靈敏度高于傳統(tǒng)檢測方法。
例三根據(jù)GenBank公布的金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(NUC)和單增李斯特氏菌的溶血素基因(hly)的序列并比較分析，分別設(shè)計一對引物和探針。
NUC基因的一對引物1NUC-F5’-GGCAATACGCAAAGAGGTT-3’NUC-L5’-CTTCTTCTATTTACGCCGTTATC-3’NUC基因的探針1ROX-5’-CGATGCAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCG-3’-DABCYLhly基因的一對引物2hly-F5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’hly-L5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’hly基因的探針2FAM-5’-CGCGCTTGTATATACTTATCGATTTCATCCGCGCG-3’-DABCYL試劑組分10×PCR緩沖液，MgCl2，Taq酶，dNTP均購自大連寶生物公司。
試驗用菌株13種細(xì)菌共85株菌株。包括1株沙門氏菌(Salmonella)(Salmonella)、1株志賀氏菌(Shigella)、1株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、1株霍亂弧菌(V.cholera)、1株O157H7大腸桿菌(O157H7)、1株蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)、1株變形桿菌(Proteus)、1株表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、1株葡萄球菌(Staphylococcus)、1株乙型溶血性鏈球菌(Streptococcus)、20株金黃色葡萄球菌(S.aureus)、22株單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、33株非單增李斯特氏菌(Non L.monocytogenes)。所有菌株均按照中華人民共和國頒布的《食品微生物學(xué)》國家檢驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分離和鑒定。
利用雙重?zé)晒釶CR體系同時檢測金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌的方法還包括以下步驟(1)樣品處理和模板提取其中樣品適用范圍包括食品樣品、糞便、嘔吐物等標(biāo)本，(a)糞便、嘔吐物標(biāo)本根據(jù)糞便和嘔吐物量的多少，用100-200μL生理鹽水懸浮，煮沸，10000rpm離心2分鐘，取5μL上清液即可用于實時PCR反應(yīng)；(b)食品樣品金黃色葡萄球菌25g食品放在225mL 7.5％Nacl增菌液過夜；單增李斯特氏菌25g食品放在225mLLB1中增菌24小時，增菌后，取1mL增菌液，10000rpm離心5分鐘，棄其上清液，加入裂解液裂解，經(jīng)酚-氯仿抽提，且乙醇沉淀后，加入20μL水溶解，取5μL溶液用于實時PCR反應(yīng)。
(2)熒光PCR擴(kuò)增配制雙重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系1×PCR緩沖液MgCl22.5μLdNTP各 1.5mmol引物1 0.05mmol引物2 0.2μmol+0.2μmol探針1 0.2μmol探針2 0.2μmolTaq酶 1U模板 10μl總體積 25μl實時PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘，45個循環(huán)中94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒。
(3)檢測采用iCycler實時PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司)退火階段檢測熒光，將含反應(yīng)液的PCR管逐一放到熒光PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行檢測，可一次檢測96份樣品。Ct值為0或40陰性；Ct小于38陽性；Ct在38-40之間樣品需重新檢測。
用前述13種細(xì)菌共85株菌株進(jìn)行實驗，用本發(fā)明的單一或雙重?zé)晒釶CR方法分別檢測按前述方法配制的不含金黃色葡萄球菌或單增李斯特氏菌的空白體系、同時含有金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌的體系、含有金黃色葡萄球菌弧菌的體系、以及含有單增李斯特氏菌的體系。采用iCycler實時PCR擴(kuò)增儀檢測退火階段熒光，熒光強(qiáng)度曲線如圖3。其中，圖3(a)為空白體系的熒光PCR擴(kuò)增儀測定的熒光強(qiáng)度曲線，圖3(b)為雙重?zé)晒釶CR檢測含有金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌的熒光強(qiáng)度曲線，圖3(c)為熒光PCR檢測含有金黃色葡萄球菌弧菌的熒光強(qiáng)度曲線，圖3(d)為雙重?zé)晒釶CR檢測含有單增李斯特氏菌的熒光強(qiáng)度曲線。由圖3比較分析，雙重?zé)晒釶CR檢測兩種細(xì)菌，無交叉反應(yīng)，相互之間沒有干擾和抑制作用，熒光信號沒有減弱，特異性強(qiáng)。
共采集248份樣品，包括食品樣品和食物中毒樣品。248份樣品用熒光PCR進(jìn)行檢測的同時采用傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行驗證。樣品處理和模板提取方法與前述方法相同。傳統(tǒng)檢測方法和熒光PCR檢測方法的比較見表4。
表4 傳統(tǒng)檢測方法和熒光PCR檢測方法的比較


雙重?zé)晒釶CR方法檢測大便和嘔吐物標(biāo)本僅需2小時檢測時間，檢測食品標(biāo)本僅需1.5天時間(包括樣品的前期處理)，可同時檢測兩種細(xì)菌。因此雙重?zé)晒釶CR方法省時省力，準(zhǔn)確性高，可滿足疾病的快速診斷。而且，熒光PCR方法和傳統(tǒng)檢測方法結(jié)果的符合率為100％，熒光PCR靈敏度高于傳統(tǒng)檢測方法。
例四根據(jù)GenBank公布的O157H7大腸桿菌的溶血素基因rfbE序列并比較分析，分別設(shè)計一對引物和探針rfbE基因的引物rfbE-L5’-AGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC-3’rfbE-R5’-GCTTGTTCTAACTGGGCTAATC-3’rfbE基因的探針5’-FAMCGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCCG-DABCYL-3’
rfbE的擴(kuò)增片段為169bp。
與其它實例中的雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)擴(kuò)增體系、反應(yīng)條件及結(jié)果的檢測方法相同，可同時準(zhǔn)確地檢測O157H7與前述十幾種其它致病菌(如沙門氏菌、志賀氏菌、產(chǎn)毒性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、單增李斯特氏菌、變形桿菌、溶血性鏈球菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌等)的兩兩隨機(jī)組合體系，且特異性強(qiáng)、靈敏度高，其熒光強(qiáng)度曲線與圖1至3相同。
雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的檢測體系可開發(fā)成一序列快速檢測試劑盒，滿足疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)、檢驗檢疫部門和技術(shù)監(jiān)督部門的日常檢驗和公共衛(wèi)生突發(fā)事件的快速應(yīng)對，具有重大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
權(quán)利要求
1.一種雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法，根據(jù)待測兩種致病菌的特異基因序列設(shè)計一對引物1和改良分子信標(biāo)探針1，以及一對引物2和改良分子信標(biāo)探針2，采用熒光PCR-改良分子信標(biāo)擴(kuò)增待測兩種致病菌特異基因的序列，利用分子信標(biāo)與擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交，檢測反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度，以達(dá)到設(shè)定的閾值時所需的循環(huán)次數(shù)Ct值作為結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)，Ct值為0或40陰性；Ct小于38陽性。
2.如權(quán)利要求
1所述的雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法，其特征在于所述熒光PCR-改良分子信標(biāo)擴(kuò)增基因序列的反應(yīng)體系為1×PCR緩沖液MgCl20.5～5mmoldNTP各 0.05～1.5mmol引物1 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol引物2 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol探針1 0.1～1.0μmol探針2 0.1～1.0μmolTaq酶 0.2～10U模板 1～20μl總體積 20～100μl
3.如權(quán)利要求
1所述的雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法，其特征在于所述熒光PCR-改良分子信標(biāo)擴(kuò)增特異基因序列的反應(yīng)條件是90～100℃預(yù)變性3～10分鐘，40～50個循環(huán)中92～95℃變性15～60秒，50～60℃退火15～60秒，70～72℃伸15～120秒。
4.如權(quán)利要求
1至3中任一項所述的雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法，其特征在于所述檢測的食源性致病菌為選自霍亂弧菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌，以及O157H7大腸桿菌中的一種或兩種的組合。
5.如權(quán)利要求
4所述的雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法，其特征在于所述致病菌的特異基因序列分別為霍亂弧菌腸毒素基因ctxA序列、副溶血弧菌耐熱直接溶血素基因TDH序列、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因NUC、單增李斯特氏菌的溶血素基因hly的序列、沙門氏菌的侵襲基因ivnA序列、志賀氏菌的編碼侵襲性質(zhì)?？乖璈基因ipaH序列，以及O157H7大腸桿菌的溶血素基因rfbE序列。
6.如權(quán)利要求
5所述的雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法，其特征在于所述改良分子信標(biāo)的引物和探針分別為ctxA基因的一對引物ctxA-F5′-TCCGGAGCATAGAGCTTGGA-3′，ctxA-R5′-TCGATGATCTTGGAGCATTCC-3′ctxA基因的探針HEX-5′-CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-3′Dabcyl，TDH基因的一對引物TDH-F5′-AAACATCTGCTTTTGAGCTTCCA-3′，TDH-R5′-CTCGAACAACAAACAATATCTCATCAG-3′，TDH基因的探針FAM5′-CCGGGGTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGG-Dabcyl，NUC基因的一對引物NUC-F5’-GGCAATACGCAAAGAGGTT-3’NUC-L5’-CTTCTTCTATTTACGCCGTTATC-3’NUC基因的探針ROX-5’-CGATGCAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCG-3’-DABCYLhly基因的一對引物hly-F5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’hly-L5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’hly基因的探針FAM-5’-CGCGCTTGTATATACTTATCGATTTCATCCGCGCG-3’-DABCYLinvA基因的一對引物invA-F5’-GCGGAATATC(I)ATGACGCAGCT-3’invA-L5’-CGCTACGTTTTGCTTCACGG-3’invA基因的探針5’-FAM-CCGCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCGG-DABCYL-3’ipaH基因的一對引物ipaH-F5’-TGAAGGAAATGCGTTTCTATG-3’ipaH-L5’-AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3’ipaH基因的探針CY55’-CACGGCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTG-3’-DABCYLrfbE基因的一對引物rfbE-L5’-AGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC-3’rfbE-R5’-GCTTGTTCTAACTGGGCTAATC-3’rfbE基因的探針5’-FAMCGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCCG-DABCYL-3’，其中劃線部分為改良分子信標(biāo)探針的靶序列。
7.如權(quán)利要求
1所述的雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法，其特征在于還進(jìn)一步包括對待測樣品處理和模板提取步驟。
8.如權(quán)利要求
7所述的雙重?zé)晒釶CR-改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法，其特征在于所述樣品包括食品樣品、糞便、嘔吐物標(biāo)本，其中處理糞便、嘔吐物標(biāo)本及提取模板是根據(jù)糞便和嘔吐物量的多少，用100-200μL生理鹽水懸浮，煮沸，10000rpm離心2分鐘，取5μL上清液即可用于實時PCR反應(yīng)；食品樣品的處理和模板的提取是將食品樣品在針對待測細(xì)菌的增菌液中增菌后，共取1.2mL增菌液10000rpm離心5分鐘，棄其上清液后，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用于實時PCR反應(yīng)；或棄其上清液后加入裂解液裂解，經(jīng)酚-氯仿抽提，且乙醇沉淀后，加入20μL水溶解，取5μL溶液用于實時PCR反應(yīng)。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種雙重?zé)晒釶CR－改良分子信標(biāo)檢測食源性致病菌的方法，根據(jù)待測兩種致病菌的特異基因序列設(shè)計對應(yīng)的一對引物1和改良分子信標(biāo)探針1，以及一對引物2和改良分子信標(biāo)探針2，采用熒光PCR－改良分子信標(biāo)擴(kuò)增待測兩種致病菌特異基因的序列，利用分子信標(biāo)與擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交，檢測反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度，以達(dá)到設(shè)定的閾值時所需的循環(huán)次數(shù)Ct值作為結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)，Ct值為0或40陰性；Ct小于38陽性。本發(fā)明的方法，靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡單，結(jié)果觀察直觀明了，適用于任意兩種細(xì)菌隨機(jī)組合和兩種食源性致病菌的快速同時檢測以及大量樣品的檢驗。
文檔編號C12Q1/68GKCN1796569SQ200410091918
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月29日
發(fā)明者扈慶華, 李慶閣, 鄭薇薇, 石曉路, 鄭琳琳, 王冰, 莊志雄, 劉小立, 張順祥 申請人:深圳市疾病預(yù)防控制中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan