專利名稱:以木質纖維素類物質發(fā)酵制取高光學純度l－乳酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種木質纖維素類物質經過微生物兩步發(fā)酵制取高光學純度L-乳酸及優(yōu)質飼料的方法。
背景技術：
乳酸，英文名Lactic acid，學名α-羥基丙酸(α-hydroxypropanoic acid)，結構式為CH3 CHOHCOOH，分子量為90.08，是一種天然存在的有機酸，廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中，具有D-型和L-型兩種構型，乳酸在食品、醫(yī)藥、化工、環(huán)保等領域有廣泛的用途，由于人體只具有代謝L一乳酸的L一乳酸脫氫酶，因此只有L一乳酸能被人體完全代謝利用。而D-乳酸和DL一乳酸過量攝入則有可能引起代謝紊亂甚至導致中毒。因此，從健康角度來考慮，世界衛(wèi)生組織明確規(guī)定，成人每天攝入D一乳酸的量不得超過100mg/kg體重，對于三個月以下的嬰兒食品中不應加入D一乳酸，而對于L一乳酸則不加限制。L-乳酸的生產及其聚合物作為可降解塑料和醫(yī)用材料的研究日益深入，因此，高光學純度的L-乳酸均具有廣闊的應用前景。
目前，乳酸的生產主要是由微生物利用葡萄糖或木糖進行發(fā)酵生成，存在的一個很大的問題是生產成本的問題，而在我國存在很大的木質纖維素類物質資源，例如農作物秸稈，工廠廢棄物如糖蜜、木屑、廢紙等，據了解我國每年僅農作物秸稈和農產品谷殼等就有7億多噸，再加上工業(yè)上的纖維廢棄物的話數量就更加龐大了，就地焚燒不僅浪費資源，還導致嚴重的環(huán)境污染，但是由于沒有很好的菌種及有效的方法一直限制著這些資源的應用。
公開號為CN1594584的一項專利公開了一種由農作物秸稈發(fā)酵同時制取乳酸及飼料的方法，前后經過了固態(tài)發(fā)酵→液態(tài)發(fā)酵→固態(tài)發(fā)酵三次發(fā)酵才能生產出乳酸及飼料，原料來源為農作物秸稈，在秸稈的前處理中利用了堿液處理，對環(huán)境又造成了二次污染。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種以天然木質纖維素類物質為原料，通過微生物兩步發(fā)酵制取高光學純度L-乳酸及優(yōu)質飼料的工藝，不僅較好的解決了木質纖維素類物質的利用問題，而且為L-乳酸的生產大大降低了成本。
本發(fā)明的技術方案為一種以木質纖維素類物質發(fā)酵制取高光學純度L-乳酸的方法，其特征在于依次進行以下步驟(1)、含木質纖維素類物質的預處理將含木質纖維素類物質粉碎，備用；(2)、配制黑曲霉培養(yǎng)基稱取一定量的木質纖維素類物質，加入黑曲霉固體發(fā)酵所需要的營養(yǎng)鹽液，滅菌；(3)、進行黑曲霉接種在黑曲霉培養(yǎng)基中接種；(4)、黑曲霉發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)，得到木聚糖酶及纖維素酶；(5)、加水，反應向發(fā)酵液中加入無菌水，使木聚糖酶及纖維素酶與底物充分反應，產生還原糖類，作為下一步液體發(fā)酵的碳源；(6)、過濾將發(fā)酵液過濾，木質纖維素類物質的殘渣為畜類飼料；(7)、配制米根霉培養(yǎng)基向濾液中加入米根霉發(fā)酵所需營養(yǎng)物質，滅菌；(8)、進行米根霉接種在米根霉培養(yǎng)基中接種；(9)、米根霉發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)，得到L-乳酸。
黑曲霉固體發(fā)酵所需要的營養(yǎng)鹽液成份為(g/l)KH2PO43.0；NaNO35.0；玉米漿粉5.0；MgSO40.25，起始PH為5.0，木質纖維素類物質加入到營養(yǎng)鹽液后，其含水量為65％。
黑曲霉發(fā)酵采用32℃-28℃變溫發(fā)酵，培養(yǎng)64-72小時。
向發(fā)酵液中加入無菌水后，PH值為5.0左右，反應溫度為50℃，使木聚糖酶及纖維素酶與底物充分反應。
所述的濾液中加入的米根霉發(fā)酵所需要的營養(yǎng)物質，其成份為(NH4)2SO43g/l；ZnSO4·7H2O 0.15g/l；KH2PO40.3g/l；MgSO4·7H2O 0.75g/l；CaCO310g/l(單獨滅菌)，接種量為5-10％。
米根酶發(fā)酵條件為37℃、搖床轉速為200rpm，經12-36小時后發(fā)酵完畢。
所述的黑曲霉和米根霉，其分別選取N+脈沖式輻照處理，其中黑曲霉處理的能量為10～15keV，劑量為20×2.6×1013～120×2.6×1013ions/cm2，米根霉處理得能量為10～15keV，劑量為40×2.6×1013～60×2.6×1013ions/cm2。
所述的含木質纖維素類的物質是指一些工農業(yè)的廢棄物，農業(yè)廢棄物如秸稈粉，玉米芯，甘蔗渣等，工業(yè)上的廢棄物如廢木屑等。
本發(fā)明只需經過兩步發(fā)酵即可生產出L-乳酸及飼料，木質纖維素類物質不需要經過堿液處理，同時本發(fā)明所選用的這個菌種發(fā)酵所產生的乳酸經測定光學純度大于98％，是一種非常優(yōu)良的生產高光學純度L-乳酸的菌種。所用原料為所有木質纖維素類物質，來源更加廣泛。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點工藝流程簡單，利用離子注入選育的黑曲霉作為固態(tài)發(fā)酵產酶出發(fā)菌，產酶量高，達到了國際先進水平，第二步利用離子注入選育的米根霉進行發(fā)酵產酸，實驗證明其不但能夠利用六碳糖，利用五碳糖的水平也非常高，所以大大增加了半纖維素的利用率，并且所產L-乳酸光學純度高，經濟價值高，步驟簡單，發(fā)酵時間短，投資少，同時產生的廢渣還可以作為優(yōu)質飼料，具有較大的經濟效益。



圖1為木質纖維素類物質兩步發(fā)酵制取高光學純度L-乳酸和優(yōu)質飼料的工藝流程圖。
具體的實施方式兩株高產菌株的制備一株黑曲霉突變株(Aaspergillus niger mutant P602)是由黑曲霉中間突變株Aaspergillus niger mutant N218經過能量為10～15keV，劑量為20×2.6×1013～120×2.6×1013ions/cm2的進行N+注入處理得到的。
一株米根霉突變株(Rhizopus oryzae 6041)是由米根霉出發(fā)菌經過能量為10～15keV，劑量為40×2.6×1013～60×2.6×1013ions/cm2的進行N+注入處理得到的高產菌。
離子注入在中國科學院等離子體物理研究所離子注入機上進行，它由離子源、聚焦系統、質量分析、加速系統、真空系統、靶室和測控系統等基本部分組成。工作原理是在離子源中產生等離子體，其中離子經引出系統引出，經質量分析器選擇后，在加速系統中獲得能量，就可以注入樣品。
經離子注入誘變處理后這兩種菌的產酶及產酸水平均有大幅度提高。
例1種子培養(yǎng)黑曲霉取10ml無菌水將培養(yǎng)好的新鮮產孢子斜面上的孢子洗下，制成孢子懸液備用。
米根霉37℃，200r/min，培養(yǎng)12h。裝液量250mL三角瓶裝入50mL液體培養(yǎng)基。
(1)、木質纖維素類物質的預處理將玉米芯、秸稈粉等木質纖維素類物質粉碎至40-60目，備用。
(2)、利用黑曲霉進行固體發(fā)酵產酶稱取一定量的干物質，加入黑曲霉固體發(fā)酵所需要的營養(yǎng)鹽液，成份為(g/l)KH2PO43.0；NaNO35.0；玉米漿粉5.0；MgSO40.25，起始PH為5.0，起始含水量為65％，培養(yǎng)基配好后裝入250ml的錐形瓶中，121℃滅菌20分鐘，等到培養(yǎng)基滅好冷卻后進行接種，取10ml無菌水將培養(yǎng)好的新鮮產孢子斜面上的孢子洗下，制成孢子懸液，吸取底物重量的10-15％于配好并滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行變溫發(fā)酵[32℃-28℃]，培養(yǎng)64-72小時，經測定此時產生了大量了木聚糖酶及纖維素酶。
黑曲霉能夠發(fā)酵利用的木質纖維素類物質非常的廣泛，但是要想使其產酶達到最高水平，就要合理調整各類物質的配比，為了使其產酶高，還要添加合適的營養(yǎng)鹽液，本發(fā)明優(yōu)先推薦如下條件需要的營養(yǎng)鹽液，成份為(g/l)KH2PO43.0；NaNO35.0；玉米漿粉5.0；MgSO40.25，起始PH為5.0，起始含水量為65％，培養(yǎng)基配好后裝入200ml的錐形瓶中進行變溫發(fā)酵[32℃-28℃]，搖床轉速200rpm，培養(yǎng)64-72小時。
(3)、固體發(fā)酵完畢后，往發(fā)酵瓶中加入80-100ml無菌水，置于50℃條件下，并使其輕輕搖動，使產生的能消化木素類物質的酶類與木素類物質充分反應(固態(tài)發(fā)酵完畢后，其PH值為5.0左右，為酶反應的最適PH)，產生還原糖類，作為下一步液體發(fā)酵的碳源。
(4)、將發(fā)酵液過濾，過濾后的木質纖維素類物質殘渣則由于經過了木聚糖酶的消化消除“抗營養(yǎng)因子”戊聚糖可以作為畜類飼料。取一定量的濾液，加入米根霉發(fā)酵所需要的營養(yǎng)元素，米根霉發(fā)酵產酸培養(yǎng)基組成為(g/l)(NH4)2SO43，ZnSO4·7H2O 0.15，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.75。同時為了控制發(fā)酵過程中的PH值，在發(fā)酵液中加入了一定量的CaCO3。溫度為37℃、搖床轉速為200rpm，接種量為5-10％，具體接種過程同黑曲霉相同，經測定12-36小時后發(fā)酵完畢，產生L-乳酸。
例2將玉米芯、秸稈粉碎至40-60目，備用。
利用黑曲霉進行固體發(fā)酵產酶將玉米芯、秸稈粉按一定比例混合，并加入麩皮作為營養(yǎng)因子，最終玉米芯∶麩皮∶秸稈粉＝4∶2.5∶1，稱取7.5克干物質，加入黑曲霉固體發(fā)酵所需要的營養(yǎng)鹽液，成份為(g/l)KH2PO43.0；NaNO35.0；玉米漿粉5.0；MgSO40.25，起始PH為5.0，起始含水量為65％，培養(yǎng)基配好后裝入250ml的錐形瓶中，121℃滅菌20分鐘，等到培養(yǎng)基滅好冷卻后進行接種，取10ml無菌水將培養(yǎng)好的新鮮產孢子斜面上的孢子洗下，制成孢子懸液，吸取1ml于配好并滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行變溫發(fā)酵[32℃-28℃]，培養(yǎng)64小時，經測定此時產生了大量了木聚糖酶及纖維素酶。
經測定，產生的木聚糖酶的酶活為6320IU/g，纖維素酶酶活為28IU/g。
固體發(fā)酵完畢后，往發(fā)酵瓶中加入100ml無菌水，置于50℃條件下，并使其輕輕搖動，使產生的能消化木質纖維素類物質的酶類與底物充分反應，產生還原糖類，作為下一步液體發(fā)酵的碳源。
將發(fā)酵液過濾，過濾后的木質纖維素類物質殘渣則由于經過了木聚糖酶的消化消除“抗營養(yǎng)因子”戊聚糖可以作為畜類飼料。取濾液50ml，加入米根霉發(fā)酵所需要的營養(yǎng)鹽液，米根霉發(fā)酵產酸培養(yǎng)基組成為(g/l)(NH4)2SO43，ZnSO4·7H2O 0.15，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.75。同時為了控制發(fā)酵過程中的PH值，我們在發(fā)酵液中加入了一定量的CaCO3。進行米根酶發(fā)酵時培養(yǎng)條件為裝液量為50ml，溫度為37℃、搖床轉速為200rpm，接種量為5％，具體接種過程同黑曲霉相同，經測定12-36小時后發(fā)酵完畢，產生L-乳酸，產生的量為7-8mg/g干物質，也就是說經過兩次發(fā)酵后，每100g干物質可以產生10g左右的乳酸，其對木質纖維素類物質的轉化率達到10％左右。
權利要求
1.一種以木質纖維素類物質發(fā)酵制取高光學純度L-乳酸的方法，其特征在于依次進行以下步驟(1)、含木質纖維素類物質的預處理將含木質纖維素類物質粉碎，備用；(2)、配制黑曲霉培養(yǎng)基稱取一定量的木質纖維素類物質，加入黑曲霉固體發(fā)酵所需要的營養(yǎng)鹽液，滅菌；(3)、進行黑曲霉接種在黑曲霉培養(yǎng)基中接種；(4)、黑曲霉發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)，得到木聚糖酶及纖維素酶；(5)、加水，反應向發(fā)酵液中加入無菌水，使木聚糖酶及纖維素酶與底物充分反應，產生還原糖類，作為下一步液體發(fā)酵的碳源；(6)、過濾將發(fā)酵液過濾，木質纖維素類物質的殘渣為畜類飼料；(7)、配制米根霉培養(yǎng)基向濾液中加入米根霉發(fā)酵所需營養(yǎng)物質，滅菌；(8)、進行米根霉接種在米根霉培養(yǎng)基中接種；(9)、米根霉發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)，得到L-乳酸。
2.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于黑曲霉固體發(fā)酵所需要的營養(yǎng)鹽液成份為(g/l)KH2PO43.0；NaNO35.0；玉米漿粉5.0；MgSO40.25，起始PH為5.0，木質纖維素類物質加入到營養(yǎng)鹽液后，其含水量為65％。
3.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于黑曲霉發(fā)酵采用32℃-28℃變溫發(fā)酵，培養(yǎng)64-72小時。
4.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于向發(fā)酵液中加入無菌水后，PH值為5.0左右，反應溫度為50℃，使木聚糖酶及纖維素酶與底物充分反應。
5.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于濾液中加入的米根霉發(fā)酵所需要的營養(yǎng)物質，其成份為(NH4)2SO43g/l；ZnSO4·7H2O 0.15g/l；KH2PO40.3g/l；MgSO4·7H2O 0.75g/l；CaCO310g/l(單獨滅菌)，接種量為5-10％。
6.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于米根酶發(fā)酵條件為37℃、搖床轉速為200rpm，經12-36小時后發(fā)酵完畢。
7.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于所述的黑曲霉和米根霉，其分別選取N脈沖式輻照處理，其中黑曲霉處理的能量為10～15keV，劑量為20×2.6×1013～120×2.6×1013ions/cm2，米根霉處理得能量為10～15keV，劑量為40×2.6×1013～60×2.6×1013ions/cm2。
8.根據權利要求
1所述的方法，其特征在于所述的含木質纖維素類的物質是指一些工農業(yè)的廢棄物，農業(yè)廢棄物如秸稈粉，玉米芯，甘蔗渣等，工業(yè)上的廢棄物如廢木屑等。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種以木質纖維素類物質發(fā)酵制取高光學純度L－乳酸的方法，該工藝涉及一種以木質纖維素類物質為原料，只需粉碎，不經過任何酸堿處理，添加適當的營養(yǎng)物質，第一步接種黑曲霉進行固態(tài)發(fā)酵64－72小時，第二步，發(fā)酵液過濾后濾液接種米根酶進行液態(tài)發(fā)酵 12－36小時。經過兩次發(fā)酵后，每100g干物質可以產生6－12g左右的乳酸，其對木質纖維素類物質的轉化率達到8－15％。固態(tài)發(fā)酵后的殘渣則由于經過了木聚糖酶的消化消除“抗營養(yǎng)因子”戊聚糖可以作為畜類飼料。本發(fā)明據有生產成本低，步驟簡單，時間短，對環(huán)境友好，經濟價值高等優(yōu)點，非常值得推廣和應用。
文檔編號C12P7/40GKCN1908184SQ200610041291
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月5日
發(fā)明者王冬梅, 李文, 楊英歌, 吳躍進, 余增亮 申請人:中國科學院等離子體物理研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan