專利名稱:一種重組酵母脂肪酶的發(fā)酵制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種重組酵母脂肪酶的發(fā)酵制備方法，具體地說涉及一種重組畢赤酵母高 效表達來源于華根霉的脂肪酶的發(fā)酵制備方法。屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域：
。
技術(shù)背景
脂肪酶(Lipase E.C.3.1.1.3)全稱Triacylglycero1 acylhydrolase，能夠水解三酰 廿油酯為脂肪酸、二酸甘油酯、單酸廿油酯及甘油，其天然底物一般是不溶于 水的長鏈脂肪酸酰基酯，特點是在油水界面起催化作用。因此，脂肪酶可以說 是專門在異相系統(tǒng)或者非水介質(zhì)中油(或酯)與水的界面上催化的酶。通過控制反 應(yīng)體系中水的含量，改變反應(yīng)條件可以使水解反應(yīng)向合成方向進行，這些反應(yīng) 通常具有高度的區(qū)域或立體選擇性。自然界中的脂肪酶廣泛地存在于各種生物 體中，包括人類和植物。人體和其它動物體中，脂肪酶主要功能是對油脂進行 消化、吸收和修飾。在植物中，脂肪酶在茉莉酸防疫體系和病原體誘導(dǎo)的水楊 酸生成過程中起重要作用。在微生物中，脂肪酶則是用于對油脂的水解而生成 脂肪酸，脂肪酸再進入P-氧化途徑提供能量，并且在微生物油脂的儲存中也起到 一定的作用。
微生物脂肪酶種類多，具有比動植物脂肪酶更廣的作用pH、作用溫度，并 適合于工業(yè)化大生產(chǎn)，所以微生物是脂肪酶的一個重要來源，其中根霉屬 (及/7/zo/7iw sp.)微生物是脂肪酶的重要生產(chǎn)菌(Jaeger K E and EggertT, Curr Opin Biotech, 2002, 13:390-397)。在過去的十多年里，從根霉菌中分離到超過30種脂 肪酶，多種根霉脂肪酶已被制成商品化酶制劑。各種各樣的微生物，包括細菌、 酵母和霉菌都能用于脂肪酶的生產(chǎn)，并且這些脂肪酶都廣泛用于清潔劑、食品、 香料、手性醫(yī)藥中間體、生物材料和一些化學(xué)品的生產(chǎn)中(HasanF，etal. Enzyme and Microbial Technol， 2006, 39:235-251)。
是什么原因?qū)е铝酥久妇哂腥绱宋?？德國科學(xué)家Jaeger等人認為原 因主要有四點1、它們通常有非常精確的化學(xué)選擇性，位置選擇性和立體選擇 性；2、它們很容易就能大量被制備，因為許多微生物都能大量生產(chǎn)脂肪酶；3、 許多脂肪酶的結(jié)構(gòu)已經(jīng)研究清楚，這使得酶的理性改造變得更容易、更簡單；4、 脂肪酶不需要輔因子，并且不會催化副反應(yīng)(Jaeger KE and Eggert T. Current Opinion in Biotechnol， 2002, 13:3卯-397)。脂肪酶所催化的反應(yīng)也不僅僅局限于 水解，在一定條件下還能催化酯化、轉(zhuǎn)酯化、酯交換和氨解反應(yīng)。因此脂肪酶 成為生物催化劑中研究最廣泛的催化劑之一。然而在脂肪酶生物催化的工業(yè)生產(chǎn)過程中，催化劑脂肪酶是一個很大的限 制因素，自然條件下，菌株產(chǎn)脂肪酶量較低，利用常規(guī)育種方法難以滿足工業(yè) 化生產(chǎn)的需要。因此研究人員把注意力集中到克隆和表達脂肪酶基因上，通過 基因表達調(diào)控來提高脂肪酶的活力。
目前為止，國內(nèi)外已報道了多個根霉脂肪酶的基因序列，根霉屬主要包括 微抱根毒(/ /2z'zopw51 m/crc^sporiw)， 甸枝根毒(i Wzopw515to/omyb-)禾口米根霄 (朋/zop"s^y加e)三類，由于基因序列上微小的差異，分類學(xué)上將雪白根霉 (朋iz。/ms "ivewj)，德氏根霉(朋/zo/ ws c/e/e附flr)，爪哇根毒(/ /^c;piwyava"z.cws) 禾口少根根霉(及/n!zo;ms fl^r/z/ztw)歸為米根霉一類(Schipper M AA， Studies in Mycology, 1984， 25:1-19)， 目前已矛艮道了 i / /zo/ iw sto/omy^禾口 i /z/zopws o^yzae 脂肪酶基因，兩者的脂肪酶基因同源性達到80%以上。
曰本、德國先后用大腸桿菌、釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母成功表達米根霉 脂肪酶(/ Wzo戸sw^ae lipase, ROL)基因。雖然米根霉和德氏根霉脂肪酶在大 腸桿菌中有很好的表達，但這些脂肪酶只能以無活性的形式表達，還需要對重 組酶進行復(fù)性處理才能形成有活性的脂肪酶(Di Lorenzo M, et al. Appl Environ Microbiol, 2005,71:8974- 8977)。
Kohno等用釀酒酵母(Sacc/zaraw少ces c^ev/Wae)ND-12B和高拷貝質(zhì)粒 pJDB219成功構(gòu)建了一個雪白根霉脂肪酶高表達系統(tǒng)，優(yōu)化培養(yǎng)基成分后，發(fā)酵 液中重組脂肪酶酶活達到1600U/mL，為親本的6倍，每升發(fā)酵液含有0.2 g-0.3 g 重組脂肪酶(Kohno M，etal. Protein Express Purif, 1999， 15: 327-335)。隨著"細 胞表面工程"(cell surface engineering)的發(fā)展，Washida等以釀酒酵母為宿主，在 重組米根霉脂肪酶中添加一個連接肽，使脂肪酶連接到細胞壁上，從而使整個 細胞表面都有脂肪酶分布。這些釀酒酵母細胞能在以三油酸甘油酯為唯一碳源 的培養(yǎng)基上生長(Washida M， et al. Appl Microbiol Biotechnol， 2001， 56:681-686)。
近年來，國內(nèi)外越來越多的研究者利用真核宿主畢赤酵母(/^;^p"ww^)
表達脂肪酶基因。Minning等在畢赤酵母中表達米根霉脂肪酶成熟肽(ROL)基 因，以triolein為底物測定搖瓶培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)48h，上清重組脂肪酶酶活達到l 10 U/mL， 5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)后酶活提高約5倍(Mi皿ing S， et al. J Biotechnol, 1998， 66: 147-156)。譚天偉等在畢赤酵母中表達少根根霉脂肪酶前導(dǎo)肽(rRAL)基因， 以橄欖油為底物測定搖瓶培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)48 h，上清重組脂肪酶酶活達到18 U/mL， 5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)后酶活提高約10倍(Niu WN， et al. Mol Biotechnol, 2006, 32: 73-81)。
日本、德國對米根霉脂肪酶(i /z/zop^wy^e lipase, ROL)的基因序列和表 達做了比較深入的研究，米根霉脂肪酶由26個氨基酸信號序列(presequsece)、 97 個氨基酸前序列(prosequsence)和269個氨基酸成熟脂肪酶(matureROL)區(qū)域所組成。Takahash傳研究了前序列上相關(guān)區(qū)域的作用。研究表明前序列上的20號到 57號殘基對米根霉脂肪酶的分泌和折疊起著十分重要的作用酶的分泌必需有 前序列的20號到37號殘基，而經(jīng)折疊形成活性脂肪酶必需有38號到57號殘基 (Ueda M, et al. J Mol Catal B: Enzym， 2002， 17: 113-124)。
綜上所述，雖然針對脂肪酶基因的表達做了許多研究，但總體說來表達水 平還較低，如何提高脂肪酶的表達水平將是研究的難點。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組酵母脂肪酶的發(fā)酵制備方法，本發(fā)明中所述 脂肪酶基因來源于發(fā)明人從釀造濃香型大曲酒的酒曲中篩選到的一株高產(chǎn)脂肪 酶的華根霉(及/z/zop^c/n'"m^) CCTCC M201021 ，申請公開號CN1443841A 已報道，本發(fā)明提供了一種華根霉脂肪酶前導(dǎo)肽(prosequence及CL， prai C丄， 包括前導(dǎo)序列和成熟肽)在巴斯德畢赤酵母(尸/c/n'" / o^w^)中的高水平分泌 表達調(diào)控方法以及濃縮液體酶的制備。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，步驟為
將含有華根霉(i /^opus c/zf"e"^)CCTCC M201021脂肪酶編碼基因SEQ ID NO: l的重組酵母菌株GS115/pPIC9K-proRCL種子培養(yǎng)，然后按5% 10%接種量 接種于含40g/L甘油和4mL/L微量元素PTlV^溶液的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM中；
通氣攪拌培養(yǎng)，在整個培養(yǎng)過程中氧飽和度控制在20% 60%;
流加補料生長培養(yǎng)液菌種經(jīng)過一段適應(yīng)期后進入指數(shù)生長期，此時pH受 到閉環(huán)控制，自動流加質(zhì)量濃度25。/。的工業(yè)氨水控制pH5 7，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中 的底物甘油耗盡后，此時DO陡然上升，開始流加含12mL/L的PTM,的500g/L的 甘油補料生長培養(yǎng)液；溫度控制在28i:;
流加誘導(dǎo)培養(yǎng)液當(dāng)細胞光密度OD6Q。達到60 120后，停止流加補料生長培 養(yǎng)液，維持饑餓狀態(tài)約30min，徹底耗盡甘油，然后補入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)液，體系 中甲醇濃度控制在質(zhì)量百分0.05% 3%，繼續(xù)培養(yǎng)2 5天，溫度控制在20 28 。C;
收集發(fā)酵液，加入終濃度均為3% 6%的氯化鈣和磷酸氫二鈉作為酵母菌體 絮凝劑，板框過濾，超濾濃縮，制備得到濃縮5 10倍的液體脂肪酶制品；
出發(fā)菌株菌株GS115/pPIC9K-proRCL，已在Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 57 (2009) 304—311公開。
所述培養(yǎng)基為 (1)種子培養(yǎng)基
BMGY培養(yǎng)基蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L， YNB 13.4g/L，甘油20 g/L， 500x生物素2mL/L，pH6.0磷酸緩沖液100mL/L;用500 mL的三角瓶培養(yǎng)， 裝液量10%;(2) 微量元素PTMr溶液CuS04'5H20 6g/L, KI 0.08g/L, MnS04'H20 3g/L, Na2MoO4'2H20 0.2g/L， H3B03 0.02g/L, ZnS04.7H20 20g/L， FeSO4.7H20 65g/L, CoCl2'6H20 0.5g/L，生物素0.2g/L，H2SO45mL/L;
(3) 基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM: 85%H3P04 26.7mL/L， CaSO40.93g/L， K2S0418.2g /L， MgSO4'7H20 14.9g/L， KOH4.13g/L;
(4) 發(fā)酵培養(yǎng)基用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM配制成含40g/L甘油和4mL/L微量元 素PTMi溶液；
(5) 補料生長培養(yǎng)液
含12mL/L的PTMi的500g/L甘油補料液；
(6) 誘導(dǎo)培養(yǎng)液
含12mL/L的PTM,的100%甲醇誘導(dǎo)液。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種華根霉脂肪酶前導(dǎo)肽(prosequence i C丄，praWO:，包括前導(dǎo)序列和成熟肽)在巴斯德畢赤酵母(乃'c/2/a pwtoni) 中的高水平分泌表達調(diào)控方法以及濃縮液體酶的制備。


圖1重組酵母發(fā)酵上清液SDS-PAGE檢測圖譜。 圖2重組酵母產(chǎn)脂肪酶和細胞生長曲線。
具體實施方式
實施例1:
出發(fā)菌株菌株GS115/pPIC9K-proRCL ，已在Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 57 (2009) 304—311公開。
培養(yǎng)基
(1) 種子培養(yǎng)基
BMGY培養(yǎng)基蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L， YNB 13.4g/L，甘油20 g/L， 500x生物素2mL/L，pH6.0磷酸緩沖液100mL/L;用500 mL的三角瓶培養(yǎng)， 裝液量10%。
(2) 微量元素PTMi溶液CuS04'5H20 6g/L， KI 0.08g/L， MnS04'H20 3g/L， Na2Mo04.2H2 0 0.2g/L， H3B03 0.02g/L， ZnS04.7H20 20g/L, FeSO4.7H20 65g/L, CoCl2'6H20 0.5g/L,生物素0.2g/L,H2SO45mL/L;
(3) 基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM: 85% H3P04 26.7mL/L， CaSO40.93g/L， K2S04 18.2g /L， MgSO4.7H20 14.9g/L， KOH4.13g/L;
(4) 發(fā)酵培養(yǎng)基用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM配制成含40g/L甘油和4mL/L微量元 素PTMi溶液；
(5) 補料生長培養(yǎng)液 含12mL/L的PTJV^的500g/L甘油補料液；(6)誘導(dǎo)培養(yǎng)液
含12mL/L的PTMi的100%甲醇誘導(dǎo)液。 培養(yǎng)方法
配制2.5L基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基置于7L罐內(nèi)，插入pH電極與DO電極(己標定)，接好 空氣過濾器，包扎好后在蒸汽滅菌鍋內(nèi)12rC滅菌20min。滅菌后接上循環(huán)水冷 卻到28。C，并通入空氣，閉環(huán)控制，用25。/。的氨水調(diào)節(jié)pH。培養(yǎng)過程中通過調(diào) 節(jié)通氣量或混合通純氧與轉(zhuǎn)速來維持菌體生長所需的DO20M?；鹧娼臃N，接種 量為10%，并加入4mL/L己過濾除菌的PTMr溶液，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、溫度、空氣流量、 罐壓等進行分批發(fā)酵。菌種經(jīng)過一段適應(yīng)期后進入指數(shù)生長期，此時pH受到閉 環(huán)控制，自動流加25。/。的工業(yè)氨水將pH控制在5.5。當(dāng)基礎(chǔ)料中的底物甘油耗盡 后，此時DO陡然上升，開始流力卩500g/L甘油(含12mL/L的PTMi),調(diào)節(jié)流加速率 控制DO維持在20。/。-60。/。。當(dāng)細胞光密度達到90(OD6(xr90)左右后，停止補甘油， 維持饑餓狀態(tài)約30min，讓甘油徹底耗盡，然后補入甲醇。甲醇流加相溫度控制 為25-C，甲醇補加速率為0.2% (v/v)左右。甲醇電極(華東理工大學(xué)研制)在線
顯示和控制甲醇濃度。
發(fā)酵上清的SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示，在陽性轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)上清中37kD和 30kD處出現(xiàn)特征性條帶。37kD重組蛋白經(jīng)N-端氨基酸測序分析，其N-端七個氨 基酸為Asp-Thr-Glu-Thr-Val-Gly-Gly，表明重組脂肪酶的N-端前導(dǎo)序列部分缺失 了67個氨基酸。表達的重組脂肪酶由前導(dǎo)序列C-端的27個氨基酸和成熟肽的269 個氨基酸組成(簡稱pro27RCL)，這說明該重組脂肪酶是加工過的產(chǎn)物。文獻 報道重組米根霉脂肪酶在釀酒酵母分泌過程中，受到Kex2內(nèi)切蛋白酶(Kex2) 的作用后保留前序列C-端28個氨基酸(r28ROL) (Takahashi S. et al,々p/M/cra&o/ 說otec/2"o/， 1999,52:534-540) 。 proRCLN-端第66和67個氨基酸分別是Lys和 Arg，Kex2內(nèi)切蛋白酶的酶切位點(Lys-Arg)。據(jù)此推斷在畢赤酵母中表達proRCL 時受到Kex2類蛋白酶的作用僅得到被加工過的重組蛋白pro27RCL，沒有發(fā)現(xiàn)全 長的proRCL被分泌表達。pro27RCL的理論分子量應(yīng)該為32kD左右，說明畢赤 酵母對重組脂肪酶翻譯過程中，可能進行了糖基化修飾，理論分析pro27RCL蛋 白序列中含有l(wèi)個潛在的N-糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr) 。 30kD重組蛋白經(jīng)N-端氨基酸測序分析，其N-端七個氨基酸為Ser-Asp-Ser-Gly-Glu-Val-Val，表明該 條帶為成熟肽脂肪酶mRCL，根據(jù)文獻報道推測酵母細胞自溶后分泌的蛋白酶將 proRCL前導(dǎo)序列切割掉，變?yōu)槌墒祀膍RCL (Takahashi S. et al，々 p/M/craWo/ 飽ec/mo/, 2001， 55 : 454-462) <>
通過此發(fā)酵工藝，發(fā)酵過程曲線如圖2所示，87h脂肪酶比活達到最高，隨 著發(fā)酵時間的延長，脂肪酶由于蛋白酶的降解形成成熟肽，但是蛋白表達量進 一步增大，導(dǎo)致總體酶活繼續(xù)上升，發(fā)酵112h，總酶活最高可達到1400U/mL，蛋白表達量為3.0g/L，發(fā)酵液比活470U/mg。 實施例2 培養(yǎng)基同實施例l 培養(yǎng)方法
酉己制2.5L基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基置于7L罐內(nèi)，插入pH電極與DO電極(己標定)，接好 空氣過濾器，包扎好后在蒸汽滅菌鍋內(nèi)12rC滅菌20min。滅菌后接上循環(huán)水冷 卻到28'C，并通入空氣，閉環(huán)控制，用25W的氨水調(diào)節(jié)pH。培養(yǎng)過程中通過調(diào) 節(jié)通氣量或混合通純氧與轉(zhuǎn)速來維持菌體生長所需的DO20M?；鹧娼臃N，接種 量為10%，并加入4mL/L己過濾除菌的PTM!溶液，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、溫度、空氣流量、 罐壓等進行分批發(fā)酵。菌種經(jīng)過一段適應(yīng)期后進入指數(shù)生長期，此時pH受到閉 環(huán)控制，自動流加25n/。的工業(yè)氨水將pH控制在6.0。當(dāng)基礎(chǔ)料中的底物甘油耗盡 后，此時DO陡然上升，開始流加500g/L的甘油(含12mL/L的PTMi),調(diào)節(jié)流加速 率控制00維持在20%-60%。當(dāng)細胞光密度達到60(OD,-60)左右后，停止補甘 油，維持饑餓狀態(tài)約30min，讓甘油徹底耗盡，然后補入甲醇。甲醇流加相溫度 控制為25'C，甲醇補加速率為0.3% (v/v)左右。甲醇電極(華東理工大學(xué)研制) 在線顯示和控制甲醇濃度。
通過此發(fā)酵工藝，79h脂肪酶比活達到最高，可達到2000U/mL發(fā)酵液，蛋 白表達量為2.5 g/L,發(fā)酵液比活800 U/mg。
收集發(fā)酵液，加入終濃度為4%的氯化鈣和磷酸氫二鈉作為酵母菌體絮凝 劑，板框過濾，超濾濃縮，最終制備得到濃縮10倍的液體脂肪酶制品。序列表
<210> SEQIDNO:l <211> 1092 <212> DNA
<213> 華根霉(A/^o/msc/H'"e"Ws) CCTCCM 201021
<400> 1
gttcctgttgctggtcataaEiggttcagtcaaggcaactsatggcactgacttccaactc60
cctcctctcatctctagccgttgtactcctccttcccatcaggtgatccc120
gatgccgaagcttactatattaacaagagcgttcaatggtaccaagctcacggtggc亂180
tacactgctcttatcaagcgtgatactgaa3CCgtCggtggtatgaccttggatttgccc240
gagaaccctcctcctattcctgccacgtccactgctcccagctctgattcaggtgaagtt300
gtcacagccactgctgctca￡L￡LtC￡L3ag3gctcacta已ctacgctggtgttgctgctact360
gcttactgtcgtagtgtcgttccaggtaccgtaagcastgtctcaagtat420
gttcctgatggt犯gcttatcaagaccttcacttctcttctcactgataccaatggcttt480
atcttg3g犯gtgatgctcaaaagaccatctatgttactttccgtggtactaattccttc540
ag犯gcgctattactgacatggtcttcacctttactgattattctcctgtCEiagggcgcc600
犯3gttcax:gctggtttcctttcctcatacaacca^gttgcttccccgtc660
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ggtggtgcccaagccttgctcgctggtatggatctctacc^cgtga^agagattatct780
ccceiagaacttgagcatctatactgttggttgtcctcgtgtcggt^ica^tgcattcgct840
tactacgtcgacagcaccggaattcccttccaccgtaccgttcacaagcgtgatatcgtc900
cctcatgttcctcctcaagccttcggttatcttcaccccggtgtcgaatcttggatcaag960
gaagaccctgctgatgttca犯tctgt3cttccaacattgatgc鄧taac1020
tctatcgttcctttcacctctatcgctgatcacttaacctactttggtatteiscga^ggs1080
agctgtttgt1092
權(quán)利要求
1、一種發(fā)酵制備脂肪酶的方法，其特征是步驟為將含有華根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶編碼基因SEQ IDNO1的重組酵母菌株GS115/pPIC9K-proRCL種子培養(yǎng)，然后按5％～10％接種量接種于含40g/L甘油和4mL/L微量元素PTM1溶液的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM中；通氣攪拌培養(yǎng)，在整個培養(yǎng)過程中氧飽和度控制在20％～60％；流加補料生長培養(yǎng)液菌種經(jīng)過一段適應(yīng)期后進入指數(shù)生長期，此時pH受到閉環(huán)控制，自動流加質(zhì)量濃度25％的工業(yè)氨水控制pH5～7，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的底物甘油耗盡后，此時DO陡然上升，開始流加含12mL/L的PTM1的500g/L的甘油補料生長培養(yǎng)液；溫度控制在28℃；流加誘導(dǎo)培養(yǎng)液當(dāng)細胞光密度OD600達到60～120后，流加補料生長培養(yǎng)液，維持饑餓狀態(tài)約30min，徹底耗盡甘油，然后補入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)液，體系中甲醇濃度控制在質(zhì)量百分0.05％～3％，繼續(xù)培養(yǎng)2～5天，溫度控制在20～28℃；收集發(fā)酵液，加入終濃度均為3％～6％的氯化鈣和磷酸氫二鈉作為酵母菌體絮凝劑，板框過濾，超濾濃縮，制備得到濃縮5～10倍的液體脂肪酶制品；所述培養(yǎng)基為(1)種子培養(yǎng)基BMGY培養(yǎng)基蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，YNB 13.4g/L，甘油20g/L，500×生物素2mL/L，pH6.0磷酸緩沖液100mL/L；用500mL的三角瓶培養(yǎng)，裝液量10％；(2)微量元素PTM1溶液CuS04·5H206g/L，KI0.08g/L，MnSO4·H2O3g/L，Na2MoO4·2H200.2g/L，H3BO30.02g/L，ZnSO4·7H2O20g/L，F(xiàn)eSO4·7H2065g/L，CoCl2·6H200.5g/L，生物素0.2g/L，H2SO45mL/L；(3)基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM85％H3PO426.7mL/L，CaSO40.93g/L，K2SO418.2g/L，MgSO4·7H2014.9g/L，KOH4.13g/L；(4)發(fā)酵培養(yǎng)基用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM配制成含40g/L甘油和4mL/L微量元素PTM1溶液；(5)補料生長培養(yǎng)液含12mL/L的PTM1的500g/L甘油補料液；(6)誘導(dǎo)培養(yǎng)液含12mL/L的PTM1的100％甲醇誘導(dǎo)液。
專利摘要
一種重組酵母脂肪酶的發(fā)酵制備方法，屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明將含有華根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶編碼基因SEQ IDNO1的重組酵母菌株GS115/pPIC9K-proRCL種子培養(yǎng)，然后按5％～10％接種量接種于含40g/L甘油和4mL/L微量元素PTM₁溶液的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM中；通氣攪拌培養(yǎng)，流加補料生長培養(yǎng)液，流加誘導(dǎo)培養(yǎng)液，收集發(fā)酵液，加入終濃度均為3％～6％的氯化鈣和磷酸氫二鈉作為酵母菌體絮凝劑，板框過濾，超濾濃縮，最終制備得到濃縮5～10倍的液體脂肪酶制品；重組酵母發(fā)酵培養(yǎng)過程中脂肪酶的表達量可達到2000U/mL發(fā)酵液，蛋白表達量為2.5g/L，發(fā)酵液比活800U/mg。
文檔編號C12N9/20GKCN101544966SQ200910026718
公開日2009年9月30日 申請日期2009年4月28日
發(fā)明者喻曉蔚, 巖 徐, 王同春 申請人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan