專利名稱:重組桿菌溶素的表達(dá)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
。具體地，本發(fā)明涉及一種重組蛋白的表達(dá)和應(yīng)用。
技術(shù)背景
桿菌溶素的定義是在中性(pH值在7附近)條件下具有分解蛋白質(zhì)的一類酶的總稱。其來源為大腸桿菌，本發(fā)明中的桿菌溶素基因來自芽孢桿菌屬。桿菌溶素蛋白分子量約為35KDa，最佳PH值為7. 0。桿菌溶素的用處非常廣泛，本發(fā)明中的桿菌溶素是用于糖化血紅蛋白檢測試劑盒。這就需要從這一類的蛋白酶中選取能特異性的切割糖化血紅蛋白的 β鏈N-末端糖化纈氨酸殘基的桿菌溶素酶。
血糖試劑盒中包含有兩種酶桿菌溶素和果糖纈氨酸氧化酶。反應(yīng)原理是首先用桿菌溶素把糖化血紅蛋白β鏈N-末端的糖化纈氨酸殘基切割下來，然后糖化的纈氨酸作為果糖纈氨酸氧化酶的反應(yīng)底物，被特異性地清除N-末端的氨基酸并且產(chǎn)生過氧化氫，然后通過檢測過氧化氫的量計(jì)算血糖的濃度。糖化血紅蛋白檢測試劑盒是用于檢測人全血中的糖化血紅蛋白的濃度。
糖尿病及其并發(fā)癥是危害我國人體健康的重要疾病，也是我們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ姷囊环N難以完全治愈的疾病，近年來其發(fā)病率持續(xù)增高，一旦患病，會(huì)給人們甚至是整個(gè)家庭的幸福罩上極大的陰影。中國中醫(yī)科學(xué)院糖尿病研究總院，通過對近5萬名20歲以上的人群進(jìn)行血糖檢測，糖尿病的總患病率已達(dá)11.觀％。因此對其進(jìn)行診斷、檢測和治療具有重要意義，也必定會(huì)帶來不容忽視的市場價(jià)值。
糖化血紅蛋白(HbAlc)則是血液中與葡萄糖結(jié)合了的那部分血紅蛋白，是β鏈N 端纈氨酸與葡萄糖進(jìn)行的非酶縮合反應(yīng)，先形成不穩(wěn)定的Shiff堿，然后經(jīng)過Amadori重排，形成穩(wěn)定的酮氨化合物，它們的結(jié)合緩慢而不逆。HbAlc不受血糖濃度暫時(shí)的波動(dòng)的影響，可以反映測定前8-12周血糖的平均水平，與抽血時(shí)間，患者是否空腹，是否使用胰島素等因素都無關(guān)，因而是判定糖尿病長期控制的良好指標(biāo)。在國外，已經(jīng)將HbAlc監(jiān)測作為糖尿病治療判定和調(diào)整治療方案的“金標(biāo)準(zhǔn)”。非糖尿病人的HbAlc為4-5. 5%，老年人在 7. 0-7. 5%為正常值。
桿菌溶素基因分為兩部分，前面的分泌肽和后面的成熟肽部分，分泌肽的作用是使細(xì)胞內(nèi)生成的桿菌溶素分泌到胞外?，F(xiàn)有技術(shù)中的生產(chǎn)桿菌溶素的方法都是將桿菌溶素的基因全部表達(dá)，因?yàn)闂U菌溶素對細(xì)胞有毒性，所以細(xì)胞為了生存，表達(dá)桿菌溶素的量很小，以便盡可能降低對細(xì)胞的毒害，并且因?yàn)槭欠置诘桨獾呐囵B(yǎng)液中，所以表達(dá)出來的桿菌溶素濃度低，并且難以進(jìn)一步濃縮。另外，現(xiàn)有技術(shù)的方法一般通過對芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)再純化的方法制備產(chǎn)品的，例如申請?zhí)?00810234458. 8 (公開號CN 101407800A，
公開日2009年4月15日)的中國專利申請中記載“本發(fā)明是一種來自海洋的多粘類芽孢桿菌Ll_9(Paenil3acillus polymyxa isolate L1-9)產(chǎn)中性蛋白酶方法，其步驟包括菌株活化、種子液的制備、產(chǎn)酶培養(yǎng)基的制備和產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)和粗酶液的制備。”這類方法一般純度低，成本高。因此，需要對桿菌溶素的基因和表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步研究以提供獲得桿菌溶素的新方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明運(yùn)用基因工程技術(shù)只截取桿菌溶素基因中的成熟肽部分，去掉分泌肽部分，表達(dá)純化大量穩(wěn)定的重組桿菌溶素包涵體，并對其進(jìn)行復(fù)性，得到了有活性的穩(wěn)定的桿菌溶素。因此，本發(fā)明提供一種桿菌溶素基因和該基因表達(dá)的重組蛋白及其制備方法。通過本發(fā)明的方法得到的桿菌溶素具有易純化、產(chǎn)量大、活性高的特點(diǎn)。
因此，本發(fā)明一方面提供一種截短芽孢桿菌的桿菌溶素基因，該基因具有如SEQ ID NO :1所示的核酸序列。
SEQ ID NO 1
agtcgccggcacgtcgacggtcggcgtgggccgcggtgtgttgggggatcagaaatatatcaatacgac gtattcctcgtattatggctactactatttgcaagacaatacgcgcggcagcggcatttttacgtatgacggacgaa accgcaccgttttgcccggcagcttgtgggccgatggcgacaaccaatttttcgccagctatgacgcggcggccgtg gacgcccattattacgccggcgtcgtgtatgattactacaaaaatgtgcacggccggctgagetatgacggcagcaa cgccgccatccgttcgaccgtccattatggccgtggctacaacaacgcgttttcgaacggttcgcaaatggtgtacg gcgatggcgacggacagacgtttttgccgttttccggcggcattgacgtcgtggggcatgagttgacccatgcggtg acggattatacggccgggcttgtttaccaaaacgaatccggcgccatcaatgaagcgatgtccgatattttcggcac gctcgtggagttctacgccaaccgcaacccggactgggagatcggcgaagacatttacacgcctggggtcgccggcg atgcggtccgctcgatgtccgacccggcgaaatacggcgatccggatcattattccaaacggtacaccggcacgcaa gacaacggcggcgtccatacgaacagcggcatcatcaataaagccgcgtacttgctcagccaaggcggcgtccatta cggcgtgagcgtcaccggcatcggccgcgacaatatggggaaaattttctaccgggcgcttgtctactatttgacgc cgacgtcgaacttcagccagctgcgcgccgcctgcgtgcaagcggccgctgatttgtacgggtcgacaagccaagaa gtcaactcggtgaaacaggcgttcaatgcggttggagtgtattaa
本發(fā)明另一方面提供一種截短芽孢桿菌的桿菌溶素蛋白，該蛋白具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO 2
VAGTSTVGVGRGVLGDQKYINTTYSSYYGYYYLQDNTRGSGIFTYDGRNRTVLPGSLWADGDNQFFAS YDAAAVDAHYYAGVVYDYYKNVHGRLSYDGSNAAIRSTVHYGRGYNNAFWNGSQMVYGDGDGQTFLPFSGGIDVVG HELTHAVTDYTAGLVYQNESGAINEAMSDIFGTLVEFKANRNPDffEIGEDIYTPGVAGDALRSMSDPAYY⑶PDH YSKRYTGTQDNGGVHTNSGIINKAAYLLSQGGVHYGVSVTGIGRDKMGKIFYRALVYYLTPTSNFSQLRAACVQA AADLYGSTSQEVNSVKQAFNAVGVY
本發(fā)明還提供一種制備重組桿菌溶素的方法，包括以下步驟
1)根據(jù)SEQ ID NO 1所示的核酸序列進(jìn)行全基因合成，從而得到SEQ ID NO=I所示的核酸序列的截短芽孢桿菌的桿菌溶素基因；
2)用步驟1)獲得的核酸序列與表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行重組，對重組子進(jìn)行驗(yàn)證(例如DNA 測序)以確定重組表達(dá)質(zhì)粒的序列正確；
3)用步驟2、獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；
4)培養(yǎng)宿主細(xì)胞獲得桿菌溶素包涵體蛋白；
5)將步驟4)得到的桿菌溶素包涵體蛋白通過復(fù)性液進(jìn)行復(fù)性，得到有活性的可溶的重組桿菌溶素。
本發(fā)明還提供一種對包涵體進(jìn)行復(fù)性的復(fù)性液，該復(fù)性液包含 IMTris-Cl (ρΗ7· 5)，50mM ZnCl2, IOOmM CaCl2,0. 25M Argo
優(yōu)選地，在本發(fā)明的步驟幻中使用上述復(fù)性液。
本發(fā)明不限于特定的表達(dá)載體。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的表達(dá)載體為能與桿菌溶素基因序列重組并形成表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)載體。優(yōu)選地，使用的表達(dá)載體為原核表達(dá)載體，表達(dá)出來的桿菌溶素為包涵體形式。優(yōu)選地，原核表達(dá)載體為pET28b。
本發(fā)明不限定特定的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的宿主細(xì)胞為能夠表達(dá)重組表達(dá)質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，且具有校正大腸桿菌密碼子偏好性的特征。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的宿主細(xì)胞為大腸桿菌Rosetta garni II (DE3)。
在本發(fā)明中，優(yōu)選地培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基為含抗生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為 35°C 37°C，培養(yǎng)時(shí)間為4 5小時(shí)，誘導(dǎo)溫度為35°C 37°C，誘導(dǎo)時(shí)間為3 5小時(shí)，誘導(dǎo)物IPTG終濃度為0. 5 ImM。
篩選宿主細(xì)胞中高效表達(dá)的陽性表達(dá)菌株作為工程菌，重組桿菌溶素蛋白通過工程菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)后離心收集菌體，超聲破碎后離心收集沉淀清洗后得到包涵體蛋白，之后進(jìn)一步復(fù)性得到。
本發(fā)明中，桿菌溶素活性的定義是在pH值7. 0和40°C條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μ g酪氨酸定義為一個(gè)酶活力單位，優(yōu)選地，使用的活性的測定方法是取桿菌溶素溶液200μ 1，以濃度為2%酪蛋白底物緩沖液為底物，40°C恒溫水浴20min，加入福林-酚試劑 Iml保溫顯色20min后，在波長660nm處進(jìn)行比色測定，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酪氨酸含量。
本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比具有很多優(yōu)點(diǎn)1.方法簡單，并且產(chǎn)量大。 因?yàn)楸景l(fā)明的方法中的桿菌溶素在細(xì)胞內(nèi)聚集成包涵體形式，包涵體形式的蛋白沒有生物活性，所以可以大量表達(dá)，獲得很高的產(chǎn)量。而且直接將細(xì)胞破碎，即可得蛋白，方法簡單。 2.易純化，純化出來的產(chǎn)品純度很高。本發(fā)明的方法得到的桿菌溶素是包涵體蛋白，所以非常容易純化。3.復(fù)性后的桿菌溶素的活力很高。本發(fā)明提供的復(fù)性液對桿菌溶素的復(fù)性可以起到很好的作用。
本發(fā)明運(yùn)用基因工程技術(shù)表達(dá)純化大量穩(wěn)定的重組桿菌溶素蛋白，解決了糖化血糖檢測試劑盒自主研發(fā)的瓶頸問題。


圖1是純化后的重組桿菌溶素。
圖2是測定桿菌溶素的活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖3是根據(jù)本發(fā)明制備的桿菌溶素與現(xiàn)有技術(shù)的桿菌溶素的純度比較。1 分子標(biāo)記；2 對照產(chǎn)品A ；3 對照產(chǎn)品B ；4 本發(fā)明產(chǎn)品。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 制備重組桿菌溶素蛋白
(1) PET28b-npr 載體的構(gòu)建
根據(jù)SEQ ID NO 1序列(該序列來自于芽孢桿菌Bacillus caldolyticus，可從NCBI的genebank中獲得，其基因序列號P23384，委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司進(jìn)行全基因合成，并且在序列兩端分別加上Nde I和HindIII兩個(gè)酶切位點(diǎn)，三博遠(yuǎn)志將合成的基因序列插在一個(gè)質(zhì)粒上，首先，我們用Nde I和HindIII兩個(gè)限制性內(nèi)切酶將基因片段切下來，再用這兩個(gè)酶去雙酶切表達(dá)載體質(zhì)粒pET28b (Novagen)，之后，用連接酶將這基因片段和空質(zhì)粒連接起來，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5 α細(xì)胞里，之后，提取質(zhì)粒，經(jīng)過酶切鑒定后， 將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主菌Rosetta garni II (DE3)(購自Novagen)中。
(2) pET28b-npr 的表達(dá)
將帶有pET28b-npr的菌株在LB培養(yǎng)基中表達(dá)。具體步驟a.取-72 °C保存的pET28b-npr菌株，在無菌條件下，用接種環(huán)挑取少許菌種，劃平板，37 °C過夜培養(yǎng)單菌落。b.次日，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基(每個(gè)單菌落，接種5mlLB培養(yǎng)基)中， 37°C 200rpm過夜培養(yǎng)。c.第三日，取培養(yǎng)的菌體按1 %的接種量轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基中， 370C 220rpm培養(yǎng)3-3. 5小時(shí)至0D600于0. 8左右，加入至終濃度為ImM的IPTG，37°C 220rpm 誘導(dǎo)4h。
(3)細(xì)胞的超聲破碎
操作步驟a.將誘導(dǎo)完的500ml菌體離心，8000rpm 5min。b.將菌體加入 SOml1Tris-HCL充分重懸置于冰上，50%功率，5s/^s超聲30min。c.將超聲破碎完畢的菌體離心，15000rpm 40min，沉淀為BAC包涵體蛋白。d.將離心所得的上清和沉淀作SDS-PAGE 電泳，考察超聲破碎菌體的情況。
(4)包涵體蛋白的洗滌
用40mlTris-CL緩沖液去充分懸浮沉淀，再超聲5min，功率50%，k/5s，然后離心 15000rpm 20min
重復(fù)上面步驟兩次，最后一次不用超聲。
(5)包涵體蛋白的溶解
溶液準(zhǔn)備
a. 6M的鹽酸胍緩沖液稱取574g鹽酸胍溶于500mlIOOmMTris-CL(ρΗ8. 0)緩沖液，充分?jǐn)嚢枞芙?，最后定容體積至1L。
b. 3M的鹽酸胍緩沖液稱取鹽酸胍溶于500mlIOOmMTris-CL(ρΗ8. 0)緩沖液，充分?jǐn)嚢枞芙猓詈蠖ㄈ蒹w積至1L。
操作步驟向裝有包涵體蛋白的50ml離心管中加入30ml的6M鹽酸胍緩沖液，放在振蕩搖床上，充分振蕩30分鐘。待包涵體蛋白完全溶解后，15000轉(zhuǎn)離心30分鐘，倒出上清。
將上清倒入透析袋里，將透析袋放入3M的鹽酸胍緩沖液透析過夜。
(6)蛋白復(fù)性
溶液準(zhǔn)備
復(fù)性液:1MTris-Cl (ρΗ7· 5), 50mM ZnCl2, IOOmM CaCl2,0. 25MArgo
具體步驟將在3M鹽酸胍緩沖液透析過夜過的蛋白溶液取出來，測試其蛋白濃度，計(jì)算蛋白溶液中的蛋白含量，并按照蛋白量復(fù)性液體積=0. Img Iml的比例配制復(fù)性液。
稀釋復(fù)興準(zhǔn)備一個(gè)滴定漏斗，并將漏斗固定在鐵架子上，之后，將它們放入4°C
6層析冷柜中。在滴定漏斗中的塞子堵緊后，將蛋白溶液加入漏斗中，在漏斗下方放好配制好的復(fù)性液，在復(fù)性液里放入一個(gè)轉(zhuǎn)子，并在復(fù)性液下方放上磁力攪拌器，打開攪拌器，使復(fù)性液旋轉(zhuǎn)起來，這些都準(zhǔn)備妥當(dāng)后，緩慢旋轉(zhuǎn)滴定漏斗上的塞子，使漏斗中的蛋白溶液以盡可能慢的速度滴入下方的復(fù)性緩沖液中。這樣做的目的是使蛋白復(fù)性盡可能的充分完全。 蛋白溶液滴定完后，要繼續(xù)復(fù)性至少M(fèi)小時(shí)。
(7)蛋白濃縮
蛋白復(fù)性后，體積過大，因此需要濃縮，利用超濾系統(tǒng)將蛋白復(fù)性液濃縮至 200ml-300ml 左右。
實(shí)施例2 桿菌溶素活性檢測
1、試劑準(zhǔn)備
福林-酚試劑可直接購買
0. 4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液稱取6. Mg，加去離子水定容體積至100ml，棕色
瓶避光保存。
0. 4mol/L碳酸鈉溶液4. 24g碳酸鈉，加去離子水定容體積至100ml。
2%酪蛋白底物緩沖液稱取酪蛋白2g，置于IOOml三角瓶中，加入0.2mol/ LNa2HP0461ml，沸水浴中攪拌溶解，充分溶解后冷卻過濾，之后加入39ml0. 2mol/L Na2HPO4, 混合均勻，即成PH7. 0的2%酪蛋白底物緩沖液
0. lmol/L鹽酸1ml濃鹽酸加水稀釋成125ml的溶液。
標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液(300 μ g/ml)精確稱取0. Ig酪氨酸，逐步加入0. lmol/L鹽酸溶解后，用去離子水定容體積至IOOml放入冰箱中保存，臨用時(shí)用去離子水稀釋成300 μ g/ ml ο
2、操作步驟
酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取18個(gè)2ml離心管，分成6組(每組3個(gè)，平行樣)，編號，按下表分別加入標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸、去離子水、0. 4mol/L碳酸鈉溶液和福林-酚試劑，混勻后，放入40°C水浴保溫20min， 然后在分光光度計(jì)上進(jìn)行比色測定(波長660nm)，以濃度為0 μ g/ml酪氨酸溶液做空白對照。最后，以酪氨酸濃度為X軸，以讀值為Y軸，畫標(biāo)準(zhǔn)曲線。
權(quán)利要求
1.一種截短芽孢桿菌的桿菌溶素基因，該基因具有如SEQ ID NO :1所示的核酸序列。
2.一種截短芽孢桿菌的桿菌溶素蛋白，該蛋白具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
3.一種制備重組桿菌溶素的方法，包括以下步驟1)根據(jù)SEQID NO :1所示的核酸序列進(jìn)行全基因合成，從而得到SEQ ID N0:1所示的核酸序列的截短芽孢桿菌的桿菌溶素基因；2)用步驟1)獲得的核酸序列與表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行重組，對重組子進(jìn)行驗(yàn)證以確定重組表達(dá)質(zhì)粒的序列正確；3)用步驟幻獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；4)培養(yǎng)宿主細(xì)胞獲得桿菌溶素包涵體蛋白；5)將步驟4)得到的桿菌溶素包涵體蛋白通過復(fù)性液進(jìn)行復(fù)性，得到有活性的可溶的重組桿菌溶素。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的制備重組桿菌溶素的方法，其特征在于步驟幻中所述的復(fù)性液包含 ρΗ7· 5 的 IM Tris-Cl、50mM ZnCl2、IOOmMCaCl2 和 0. 25M Argo
5.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的制備重組桿菌溶素的方法，其特征在于所述表達(dá)載體為原核表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的制備重組桿菌溶素的方法，其特征在于所述原核表達(dá)載體為 pET^b。
7.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的制備重組桿菌溶素的方法，其特征在于所述的宿主細(xì)胞表達(dá)所述重組表達(dá)質(zhì)粒，并且校正大腸桿菌密碼子偏好性。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的制備重組桿菌溶素的方法，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌 Rosetta-gami II (DE3)。
9.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的制備重組桿菌溶素的方法，其特征在于培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基為含抗生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為35°C 37°C，培養(yǎng)時(shí)間為4 5小時(shí)，誘導(dǎo)溫度為35°C 37°C，誘導(dǎo)時(shí)間為3 5小時(shí)，誘導(dǎo)物IPTG終濃度為0. 5 ImM。
10.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的制備重組桿菌溶素的方法，其特征在于步驟幻中所述的活性通過下述方法測定取桿菌溶素溶液200 μ 1，以濃度為2%酪蛋白底物緩沖液為底物， 40°C恒溫水浴20min，加入福林-酚試劑Iml保溫顯色20min后，在波長660nm處進(jìn)行比色測定，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酪氨酸含量。
專利摘要
本發(fā)明涉及重組桿菌溶素的表達(dá)和應(yīng)用。本發(fā)明運(yùn)用基因工程技術(shù)只截取桿菌溶素基因中的成熟肽部分，去掉分泌肽部分，表達(dá)純化大量穩(wěn)定的重組桿菌溶素包涵體，并對其進(jìn)行復(fù)性，得到了有活性的穩(wěn)定的桿菌溶素?；谏鲜龇椒?，本發(fā)明提供一種具有如SEQ ID NO1所示的核酸序列的截短芽孢桿菌的桿菌溶素基因。本發(fā)明還提供了一種具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的截短芽孢桿菌的桿菌溶素蛋白。本發(fā)明還提供了基于上述序列制備重組桿菌溶素的方法。通過本發(fā)明的方法得到的桿菌溶素具有易純化、產(chǎn)量大、活性高的特點(diǎn)。
文檔編號C12N15/31GKCN102168095SQ201010609553
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月28日
發(fā)明者劉希, 王晶, 龔俊 申請人:北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan