專利名稱:微囊藻毒素檢測(cè)芯片、試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微囊藻毒素檢測(cè)芯片，本發(fā)明還涉及具有該檢測(cè)芯片的試劑盒及應(yīng)用該試劑盒進(jìn)行微囊藻毒素檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
藍(lán)藻又名“藍(lán)綠藻”，在一些營(yíng)養(yǎng)豐富的水體中，某些藍(lán)藻常于夏季大量繁殖形成 “水華”。在引起水質(zhì)惡化的同時(shí)，某些“水華”種類還會(huì)產(chǎn)生具有生物毒性的次生代謝產(chǎn)物， 稱為“藍(lán)藻毒素”。這些藍(lán)藻毒素的釋放直接對(duì)魚類、人畜產(chǎn)生危害。藍(lán)藻毒素依據(jù)其最終導(dǎo)致的病癥的不同可以分為四大類神經(jīng)毒素、肝毒素、細(xì)胞毒素以及刺激性毒素(irritant toxins) 0在這四類毒素中，肝毒素即微囊藻毒素(microcystin)對(duì)公眾的健康危害最大， 嚴(yán)重的會(huì)引起其死亡。因此，圍繞如何檢測(cè)、控制和消除藍(lán)藻毒素，各國(guó)的科學(xué)工作者開展了大量的研究工作。
對(duì)于微囊藻毒素的檢測(cè)，早期通過構(gòu)建相應(yīng)的生物模型進(jìn)行生物毒性實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)水體中是否有藍(lán)藻毒素存在。然而，較低的靈敏度、較高的實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)以及生物毒性實(shí)驗(yàn)帶來的一系列倫理問題，使得人們不得不選擇別的方法來對(duì)毒素進(jìn)行診斷。隨著微量樣品分析儀器(如，HPLC、MALDI-T0F)的發(fā)展，依托這些儀器開發(fā)出多種用于檢測(cè)自然水體中藍(lán)藻毒素的方法。這些方法分析過程簡(jiǎn)單快捷并且具有很高的靈敏度。然而，由于分析儀器對(duì)樣品的前處理有著很高的要求，因此在實(shí)際運(yùn)用中，樣品的處理變得既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，并且昂貴的分析儀器和標(biāo)準(zhǔn)品也使得許多實(shí)驗(yàn)室無法開展對(duì)藍(lán)藻毒素的診斷。同時(shí)，依靠免疫學(xué)和生物化學(xué)的方法開發(fā)出的診斷手段也逐漸運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)室或自然環(huán)境水體中藍(lán)藻毒素的檢測(cè)。 如，對(duì)肝毒素(microcystin和nodularin)進(jìn)行檢測(cè)的ELISA方法、比色法(蛋白磷酸酶抑制劑)和細(xì)胞毒性診斷。然而，前述多種診斷方法，均以釋放至水體中的微囊藻毒素為檢測(cè)對(duì)象，不能在毒素從藻細(xì)胞內(nèi)釋放到水體之前對(duì)其進(jìn)行預(yù)判斷。無法通過這些方法對(duì)潛在的產(chǎn)毒微囊藻進(jìn)行預(yù)檢。從而降低了生物監(jiān)測(cè)的時(shí)效性，大大影響有害藻華的監(jiān)測(cè)/預(yù)警。 類似的公開文獻(xiàn)可以參考專利號(hào)為ZL200310109105. 2的中國(guó)發(fā)明專利《水中痕量微囊藻毒素的檢測(cè)方法》(授權(quán)公告號(hào)CN100387985C)；申請(qǐng)?zhí)枮?00710070274. 8的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開《水體中微囊藻毒素的檢測(cè)方法》(公開號(hào)101169414A)；還可以參考《水生生物學(xué)報(bào)》2003年04期，第27卷第4期中王曉峰等所著的“用蛋白磷酸酶抑制法比色法檢測(cè)水中微囊藻毒素類物質(zhì)”。
近年來，隨著生物芯片技術(shù)的日趨成熟，高效、快速、準(zhǔn)確、靈敏的生物芯片被應(yīng)用到越來越多的領(lǐng)域如基因序列分析、雜交、基因突變檢測(cè)及多態(tài)性分析、基因分型、疾病檢測(cè)、食品微生物檢測(cè)等；該技術(shù)可同時(shí)將大量不同的探針固定于同一支持物上，因而可以一次性對(duì)同一樣品進(jìn)行大量序列檢測(cè)和核酸分析；運(yùn)用生物芯片技術(shù)可以克服其它常用傳統(tǒng)技術(shù)存在的問題，滿足在實(shí)際檢測(cè)工作中的快速、高通量、自動(dòng)化檢測(cè)的要求；鑒于生物芯片的這些優(yōu)點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)先后開發(fā)了多種生物芯片用于基因突變及多態(tài)性分析、基因插入或缺失、臨床診斷、微生物鑒別等多個(gè)領(lǐng)域。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種具有特異性探針的微囊藻毒素檢測(cè)芯片。
本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問題是提供一種具有特異性探針的微囊藻毒素檢測(cè)芯片的試劑盒。
本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問題是提供一種高通量、高靈敏度的微囊藻毒素檢測(cè)方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種微囊藻毒素檢測(cè)芯片，包括基片及結(jié)合于基片上的探針，其特征在于所述的探針為六條，分別包括如下基因序列
g、5，_TTTTTTTTTTTTTTTGTTCCTGTGCCRTGAGCTTC_-3，；[0010]h、5，_TTTTTTTTTTTTTTTTGACCAAGTAATCCCAGAAC_-3，；[0011]i、5，_TTTTTTTTTTTTTTTCTTGAGTCATTTCGGGTTGG_-3，；[0012]j、5，_TTTTTTTTTTTTTTTATTCGGGACGATTGAGGTAT_-3，；[0013]k、5，_TTTTTTTTTTTTTTTTTACTAAACGGATTGGAGA_3，；[0014]1、5，_TTTTTTTTTTTTTTTCATTCAAAGGATTAGGCACA_-3，。
一種具有上述的微囊藻毒素檢測(cè)芯片的試劑盒。該試劑盒還具有核酸提取劑、雜交液。
一種利用上述的試劑盒進(jìn)行微囊藻毒素檢測(cè)的方法，其特征在于包括如下步驟
①樣品DNA提取將水樣離心，棄上清，以核酸提取劑結(jié)合吸附柱法提取離心所得水樣中宏基因組的DNA;
②雜交將雜交液溶化后和宏基因組DNA混勻，變性后，冰浴，把芯片放入雜交盒， 蓋上蓋片，通過加樣孔注入變性冰浴后的雜交液，蓋緊雜交盒蓋，于雜交儀中雜交；
③清洗雜交完的芯片通過洗干儀清洗并離心；
④芯片掃描及結(jié)果判讀清洗后離心的芯片通過微陣列芯片掃描儀，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，給出檢測(cè)結(jié)果。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于微囊藻毒素檢測(cè)芯片與微陣列芯片掃描儀和微囊藻毒素檢測(cè)芯片檢測(cè)系統(tǒng)配套使用。進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，將富集后的樣品宏基因組DNA置于芯片上，當(dāng)目標(biāo)DNA與特異性探針結(jié)合時(shí)，通過檢測(cè)各檢測(cè)位點(diǎn)的熒光情況對(duì)目標(biāo)水體中是否存在微囊藻毒素基因進(jìn)行定性分析。芯片具有多組微囊藻合成基因的特異性探針， 通過多組探針的相互矯正達(dá)到對(duì)水體中微囊藻毒素進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的目的；其次，由于一張芯片上可以點(diǎn)4個(gè)探針陣列，每個(gè)陣列可以檢測(cè)一個(gè)樣本，因此可以同時(shí)檢測(cè)4個(gè)來自于不同采集地的樣本，達(dá)到快速檢測(cè)多個(gè)樣品的目標(biāo)，同時(shí)，也可以一次性對(duì)某個(gè)樣本進(jìn)行 4次的重復(fù)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行快速校正；結(jié)合生物芯片和分子雜交技術(shù)，剔除了繁瑣的PCR擴(kuò)增，縮短了檢測(cè)時(shí)間，可以高通量、高靈敏度的快速進(jìn)行檢測(cè)。


圖1為實(shí)施例中芯片結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
①樣品DNA提取將水樣離心，棄上清，以核酸提取劑結(jié)合吸附柱法提取離心所得水樣中宏基因組的DNA
②雜交將雜交液溶化后和宏基因組DNA混勻，變性后，冰浴，把芯片放入雜交盒， 蓋上蓋片，通過加樣孔注入變性冰浴后的雜交液，蓋緊雜交盒蓋，于雜交儀中雜交；
③清洗雜交完的芯片通過洗干儀清洗并離心；
④芯片掃描及結(jié)果判讀清洗后離心的芯片通過微陣列芯片掃描儀，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，給出檢測(cè)結(jié)果。
其中，核酸提取劑恥丨(^61^，仏5]公司生產(chǎn)的!^8丨0嫩spin kit。雜交儀、洗干儀和掃描儀三部分共同構(gòu)成微囊藻水華檢測(cè)芯片檢測(cè)分析系統(tǒng)，雜交儀、洗干儀和掃描儀均為博奧生物有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品型號(hào)分別為晶芯 Biamixer Π芯片雜交儀、晶芯 Slide Washer 8芯片洗干儀和晶芯 LuxScan 10K-A微陣列芯片掃描儀。
雜交液是不包含變性產(chǎn)物(宏基因組DNA)的雜交液，由多種試劑配制的混合溶液以用于芯片的雜交過程。具體的組成比例如下(以SyL為例)
權(quán)利要求
1.一種微囊藻毒素檢測(cè)芯片，包括基片及結(jié)合于基片上的探針，其特征在于所述的探針為六條，分別包括如下基因序列a、5，-TTTTTTTTTTTTTTTGTTCCTGTGCCRTGAGCTTC-3，；b、5，-TTTTTTTTTTTTTTTTGACCAAGTAATCCCAGAAC-3，； C、5，-TTTTTTTTTTTTTTTCTTGAGTCATTTCGGGTTGG-3，；d、5，-TTTTTTTTTTTTTTTATTCGGGACGATTGAGGTAT-3，；e、5，-TTTTTTTTTTTTTTTTTACTAAACGGATTGGAGA-3，；f、5，-TTTTTTTTTTTTTTTCATTCAAAGGATTAGGCACA-3，。
2.一種具有權(quán)利要求
1所述的微囊藻毒素檢測(cè)芯片的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的試劑盒，其特征在于該試劑盒還具有核酸提取劑、雜交液。
4.一種利用權(quán)利要求
2所述的試劑盒進(jìn)行微囊藻毒素檢測(cè)的方法，其特征在于包括如下步驟①樣品DNA提取將水樣離心，棄上清，以核酸提取劑結(jié)合吸附柱法提取離心所得水樣中宏基因組的DNA ；②雜交將雜交液溶化后和宏基因組DNA混勻，變性后，冰浴，把芯片放入雜交盒，蓋上蓋片，通過加樣孔注入變性冰浴后的雜交液，蓋緊雜交盒蓋，于雜交儀中雜交；③清洗雜交完的芯片通過洗干儀清洗并離心；④芯片掃描及結(jié)果判讀清洗后離心的芯片通過微陣列芯片掃描儀，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，給出檢測(cè)結(jié)果。
專利摘要
一種微囊藻毒素檢測(cè)芯片，包括基片及結(jié)合于基片上的探針，所述的探針為根據(jù)微囊藻毒素合成基因簇中六個(gè)保守區(qū)域序列涉及的六個(gè)特異性探針。本發(fā)明還公開了具有該檢測(cè)芯片的試劑盒及利用該試劑盒進(jìn)行微囊藻毒素檢測(cè)的方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于結(jié)合生物芯片和分子雜交技術(shù)，剔除了繁瑣的PCR擴(kuò)增，縮短了檢測(cè)時(shí)間，可以高通量、高靈敏度的快速進(jìn)行檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN102199670SQ201110115612
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年4月28日
發(fā)明者嚴(yán)婷婷, 嚴(yán)小軍, 朱鵬, 游玉容, 陳海敏 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan