專利名稱:一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)篩選藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以革蘭氏陰性菌外膜孔蛋白為靶點(diǎn)篩選藥物的方法，尤其是涉及一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)篩選藥物的方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，人們對(duì)病原細(xì)菌的控制主要是通過(guò)幾種不同殺菌機(jī)制的抗生素藥物來(lái)進(jìn)行的，目前常用抗生素的殺菌作用機(jī)制主要有以下4種(I)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成抑制細(xì)胞壁的合成會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞破裂死亡，以這種方式作用的抗菌藥物包括青霉素類和頭孢菌素類。(2)干擾蛋白質(zhì)的合成干擾蛋白質(zhì)的合成意味著細(xì)胞存活所必需的酶不能被合成。干擾蛋白質(zhì)合成的抗生素包括福霉素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和氯霉素。(3)抑制核酸的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制抑制核酸的功能阻止了細(xì)胞分裂和/或所需酶的合成。以這種方式作用的抗生素包括萘啶酸和二氯基吖啶。(4)與細(xì)胞膜相互作用一些抗菌素與細(xì)胞的細(xì)胞膜相互作用而影響膜的滲透性，這對(duì)細(xì)胞具有致命的作用。以這種方式作用的抗生素有多粘菌素和短桿菌素。
由于抗生素的大規(guī)模應(yīng)用和不合理的臨床使用，而使得細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，不僅導(dǎo)致藥物失去抗菌作用，甚至致使“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)，這使得感染性疾病治療及疫情控制面臨困境，已在全球范圍成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危機(jī)。但因具新型抗菌機(jī)制的藥物的研發(fā)日益困難，且針對(duì)已有抗菌機(jī)制開發(fā)的藥物的生命周期大大縮短等原因，近年來(lái)罕有新型抗菌藥物上市。因此，本領(lǐng)域非常有必要尋找與細(xì)菌介導(dǎo)的感染性疾病相關(guān)的新的藥物作用靶點(diǎn)和開發(fā)新的藥物或研制新型疫苗，為更有效地控制和治療感染性疾病提供新的途徑。
已知大多數(shù)感染性疾病及歷史上大規(guī)模爆發(fā)的傳染病都是由革蘭氏陰性菌引起，研究認(rèn)為這主要與其復(fù)雜的外膜有關(guān)。革蘭氏陰性菌外膜主要由外膜孔蛋白、脂質(zhì)及脂多糖等成分組成，其中外膜孔蛋白為主要成分，約占50%，主要由具β_桶狀結(jié)構(gòu)的孔蛋白(porin)和脂蛋白兩類蛋白組成，外膜孔蛋白是革蘭氏陰性菌特有的成分，直接與外環(huán)境接觸，不僅在維持外膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞表面識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)(尤其是鐵的運(yùn)輸)等生理功能方面起重要作用，而且更為重要的是，某些外膜孔蛋白還與病原菌的毒力有關(guān)，且研究認(rèn)為病原菌的毒力與機(jī)體內(nèi)鐵的調(diào)控有關(guān)。鐵是病原菌感染發(fā)病和機(jī)體的免疫防御這一相互作用過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，病原菌經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化已發(fā)展了多種機(jī)制從宿主體內(nèi)奪取鐵來(lái)增強(qiáng)其毒力和致病性，同時(shí)損傷機(jī)體的免疫防御能力，是病原菌感染以及致病的關(guān)鍵因素之
O
中國(guó)專利公開號(hào)CN1699573A，
公開日2005年11月23日，公開了一種溶藻酸弧菌外膜孔蛋白W基因與制備方法及其應(yīng)用，提供一種新的溶藻酸弧菌ompW蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列和溶藻酸弧菌ompW蛋白的氨基酸序列及其利用重組技術(shù)制備溶藻酸弧菌ompW基因的方法，提供溶藻酸弧菌和副溶血弧菌ompW蛋白和編碼序列的應(yīng)用，其步驟為將編碼具有溶藻酸弧菌ompW蛋白活性多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成溶藻酸ompW蛋白表達(dá)載體,將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞,形成溶藻酸弧菌ompW蛋白的重組細(xì)胞，培養(yǎng)重組細(xì)胞，分離。不足之處是用于篩選藥物可靠性差、篩選藥物效率低，不適用于作為靶點(diǎn)篩選細(xì)菌介導(dǎo)的感染性疾病的新藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的藥物篩選方法可靠性差、效率低、不適用于作為靶點(diǎn)篩選細(xì)菌介導(dǎo)的感染性疾病的新藥物的不足，提供了一種操作簡(jiǎn)單、篩選可靠性好、效率高的以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為新型靶點(diǎn)的篩選藥物的方法，用于篩選細(xì)菌介導(dǎo)的感染性疾病的新藥物。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是
一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)篩選藥物的方法，所述方法包括下列步驟
(1)基因的克隆及重組載體的構(gòu)建；
(2)重組載體的轉(zhuǎn)化、篩選誘導(dǎo)表達(dá)得外膜孔蛋白OmpW高表達(dá)菌；
(3)以高表達(dá)菌的外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞水平的藥物篩選，用5(Γ80μg/ml的待篩選化合物作用于高表達(dá)菌，培養(yǎng)O. 5-lh，采用Western-blot分析檢測(cè)高表達(dá)菌外膜孔蛋白OmpW的表達(dá)量變化，Ompff的表達(dá)量降低，待篩選化合物具有藥物作用，Ompff的表達(dá)量不變或增加，待篩選化合物不具有藥物作用。
作為優(yōu)選，步驟(I)中利用大腸桿菌K12的ompW基因序列設(shè)計(jì)合成引物，引物合成后，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板擴(kuò)增基因0耶1經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定并回收目的基因，利用T4-DNA連接酶將目的基因與載體連接得重組載體。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找大腸桿菌K12的ompW基因序列(序列號(hào)No. _415772),然后根據(jù)pLLP-OmPA載體和pET_28a載體分別設(shè)計(jì)引物對(duì)ompW-pL-F/ompW-pL-R和引物對(duì)ompW-pE-F/ompW-pE-R,見(jiàn)表I。
作為優(yōu)選,所述載體為質(zhì)?；蛘沉］d體。
作為優(yōu)選，步驟(2)中篩選是指采用氨芐青霉素抗性平板篩選外膜孔蛋白OmpW表達(dá)量高的菌株，誘導(dǎo)表達(dá)是指將外膜孔蛋白OmpW表達(dá)量高的菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入IPTG誘導(dǎo)得到相應(yīng)的外膜孔蛋白OmpW高表達(dá)菌。
作為優(yōu)選，誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為0. 3^0. 4mmol/l。
本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明確立了以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)的藥物篩選方法，通過(guò)高表達(dá)菌外膜孔蛋白OmpW的表達(dá)量變化來(lái)判斷待測(cè)化合物是否具有藥物特性，操作簡(jiǎn)單，可靠性高；(2)本發(fā)明通過(guò)克隆基因和構(gòu)件重組載體，然后經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)得到外膜孔蛋白OmpW高表達(dá)量高的高表達(dá)菌，待測(cè)化合物作用于高表達(dá)菌來(lái)進(jìn)行細(xì)胞水平的藥物篩選，靈敏度高，效率高。


圖1是正常菌及經(jīng)吞噬細(xì)胞處理后外膜孔蛋白樣品的SDS-PAGE (上部分)及以O(shè)mpff抗體為一抗的Western-blot分析圖譜(下部分)；
圖2是正常菌及經(jīng)血漿處理后外膜孔蛋白樣品的SDS-PAGE (上部分)及以O(shè)mpW抗體為一抗的Western-blot分析圖譜(下部分)；
圖3是以O(shè)mpW抗血清為一抗對(duì)經(jīng)血漿被補(bǔ)體消化的菌外膜孔蛋白樣品進(jìn)行Western-blot 分析圖譜；圖4是正常菌與補(bǔ)體滅活的血漿孵育Ih后的菌的外膜孔蛋白以O(shè)mpW抗體為一抗的ffestern-blot 分析圖譜；
圖5是正常菌及OmpW基因敲除菌(Nompimi SDS-PAGE及Western-blot分析驗(yàn)證圖
譜；
圖6是正常菌及OmpW基因敲除菌(komPW、的生長(zhǎng)曲線圖；
圖7是THP-1細(xì)胞分別與FITC標(biāo)記的野生型及OmpW基因敲除菌(Λο耶/f)孵育Ih后細(xì)胞觀察圖；
圖8是熒光亮點(diǎn)計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析圖；
圖9是小鼠巨噬細(xì)胞分別與FITC標(biāo)記的野生型及OmpW基因敲除菌(&ompW、孵育Ih后細(xì)胞觀察圖；
圖10是熒光亮點(diǎn)計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析；
圖11是小鼠巨噬細(xì)胞與野生型及OmpW基因敲除菌(進(jìn)行孵育Ih后裂解細(xì)胞的裂解液涂平板示意圖；
圖12是平板計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析圖。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說(shuō)明。
實(shí)施例1 :
以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)篩選藥物的方法
(1)基因的克隆及重組載體的構(gòu)建以質(zhì)粒為載體，引物合成后，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板擴(kuò)增基因omPW,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定并回收目的基因，利用T4-DNA連接酶將目的基因與載體連接；
(2)重組載體的轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)得高表達(dá)菌采用氨芐青霉素抗性平板篩選外膜孔蛋白表達(dá)量高的菌株，然后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入O. 3mmol/l的IPTG誘導(dǎo)得到相應(yīng)的外膜孔蛋白OmpW聞表達(dá)囷；
(3)進(jìn)行以高表達(dá)菌的外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)的藥物的篩選，用50μ g/ml的待篩選化合物作用于高表達(dá)菌，培養(yǎng)O. 5h，采用Western-blot分析檢測(cè)高表達(dá)細(xì)胞OmpW的表達(dá)量變化，Ompff的表達(dá)量降低，待篩選化合物具有藥物作用，Ompff的表達(dá)量不變或增加，待篩選化合物不具有藥物作用。
實(shí)施例2:
以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)篩選藥物的方法
(1)基因的克隆及重組載體的構(gòu)建以粘粒為載體，引物合成后，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板擴(kuò)增基因omPW,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定并回收目的基因，利用T4-DNA連接酶將目的基因與載體連接；
(2)重組載體的轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)得高表達(dá)菌采用氨芐青霉素抗性平板篩選外膜孔蛋白表達(dá)量高的菌株，然后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入O. 5mmol/l的IPTG誘導(dǎo)得到相應(yīng)的外膜孔蛋白OmpW聞表達(dá)囷；
(3)進(jìn)行以高表達(dá)菌的外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)的藥物的篩選，用80μ g/ml的待篩選化合物作用于高表達(dá)菌，培養(yǎng)O. 5h，采用Western-blot分析檢測(cè)高表達(dá)細(xì)胞OmpW的表達(dá)量變化，Ompff的表達(dá)量降低，待篩選化合物具有藥物作用，Ompff的表達(dá)量不變或增加，待篩選化合物不具有藥物作用。
實(shí)施例3:
以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)篩選藥物的方法
(1)基因的克隆及重組載體的構(gòu)建以質(zhì)粒為載體，引物合成后，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板擴(kuò)增基因omPW,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定并回收目的基因，利用T4-DNA連接酶將目的基因與載體連接；
(2)重組載體的轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)得高表達(dá)菌采用氨芐青霉素抗性平板篩選外膜孔蛋白表達(dá)量高的菌株，然后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入O. 4mmol/l的IPTG誘導(dǎo)得到相應(yīng)的外膜孔蛋白OmpW聞表達(dá)囷；
(3)進(jìn)行以高表達(dá)菌的外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)的藥物的篩選，用65μ g/ml的待篩選化合物作用于高表達(dá)菌，培養(yǎng)45分鐘，采用Western-blot分析檢測(cè)高表達(dá)細(xì)胞OmpW的表達(dá)量變化，Ompff的表達(dá)量降低，待篩選化合物具有藥物作用，Ompff的表達(dá)量不變或增加，待篩選化合物不具有藥物作用。
高表達(dá)菌經(jīng)新鮮的人血漿處理后，部分高表達(dá)菌被補(bǔ)體系統(tǒng)裂解消化，存活高表達(dá)菌的OmpW表達(dá)量顯著增加(如圖2所示)，而被補(bǔ)體消化的高表達(dá)菌中檢測(cè)不到OmpW (如圖3所示);而當(dāng)高表達(dá)菌與補(bǔ)體滅活的血漿處理后，OmpW的表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化(如圖4所示)。此外，高表達(dá)菌被吞噬后仍存活的高表達(dá)菌的OmpW表達(dá)量也明顯增加(如圖1所示)，該結(jié)果表明OmpW在 抗先天免疫過(guò)程中具有重要作用，用于篩選治療細(xì)菌感染的藥物可靠性高。
為進(jìn)一步證實(shí)OmpW抗免疫作用，構(gòu)建了基因敲除菌(Λο耶F)。經(jīng)提取膜蛋白樣品并進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot分析表明ompW未見(jiàn)表達(dá)(如圖5所示)。另夕卜，比較分析菌和正常菌外膜孔蛋白，發(fā)現(xiàn)兩外膜孔蛋白Fiu和CirA的表達(dá)量明顯增加(如圖5所示),而二者均為TonB依賴的受體蛋白，可攝取各種含鐵化合物(如enterochelin、aerobactin等)。這表明細(xì)菌在缺失OmpW后,通過(guò)上調(diào)表達(dá)Fiu和CirA來(lái)維持對(duì)鐵攝取和需求的平衡。而這很可能也是的生長(zhǎng)未受明顯影響的原因。的生長(zhǎng)曲線表明敲除后生長(zhǎng)未受明顯影響(如圖6所示)。
在構(gòu)建了 Λο耶r之后，進(jìn)一步分析了人單核巨噬細(xì)胞(THP-1細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)時(shí)經(jīng)PMA誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞)和取自小鼠的巨噬細(xì)胞對(duì)與正常菌的吞噬率差異。實(shí)驗(yàn)從以下2各方面進(jìn)行分析
I)將正常及菌利用熒光試劑進(jìn)行標(biāo)記，分別取相同數(shù)量的此二種細(xì)菌與等量的巨噬細(xì)胞在37°c下進(jìn)行孵育。Ih后，充分洗滌細(xì)胞，并利用臺(tái)盼藍(lán)淬滅極少數(shù)仍粘附在細(xì)胞膜上的熒光。最后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量。結(jié)果顯示，菌的吞噬率顯著高于正常菌(如圖7、圖8、圖9和圖10所示)。
2)正常及菌與巨噬細(xì)胞孵育Ih后，充分洗滌細(xì)胞，利用純水裂解細(xì)胞，取適量裂解液涂平板，觀察并計(jì)數(shù)細(xì)菌的菌落數(shù)。結(jié)果證實(shí)巨噬細(xì)胞對(duì)菌的吞噬率高于正常菌(如圖11和圖12所示)，該結(jié)果表明，OmpW可促進(jìn)細(xì)菌抗吞噬作用，用于篩選治療細(xì)菌感染藥物效率高。
權(quán)利要求
1.一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)篩選藥物的方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟(1)基因的克隆及重組載體的構(gòu)建；(2)重組載體的轉(zhuǎn)化、篩選和誘導(dǎo)表達(dá)得外膜孔蛋白OmpW高表達(dá)菌；(3)以高表達(dá)菌的外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞水平的藥物篩選，用5(Γ80μg/ml的待篩選化合物作用于高表達(dá)菌，培養(yǎng)O. 5-lh，采用Western-blot分析檢測(cè)高表達(dá)菌的外膜孔蛋白OmpW的表達(dá)量變化，Ompff的表達(dá)量降低，待篩選化合物具有藥物作用，Ompff的表達(dá)量不變或增加，待篩選化合物不具有藥物作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)篩選藥物的方法，其特征在于步驟(I)中利用大腸桿菌K12的ompW基因序列設(shè)計(jì)合成引物，引物合成后，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板擴(kuò)增基因ompW，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定并回收目的基因，利用T4-DNA連接酶將目的基因與載體連接得重組載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)篩選藥物的方法，其特征在于，所述載體為質(zhì)?；蛘沉］d體。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1或2或3所述的一種以大腸桿菌外膜孔蛋白為靶點(diǎn)篩選藥物的方法，其特征在于步驟(2)中篩選是指采用氨芐青霉素抗性平板篩選外膜孔蛋白OmpW表達(dá)量高的菌株，誘導(dǎo)表達(dá)是指將外膜孔蛋白OmpW表達(dá)量高的菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入IPTG誘導(dǎo)得到相應(yīng)的外膜孔蛋白OmpW高表達(dá)菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)篩選藥物的方法，其特征在于誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為O. 3^0. 4mmol/l。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種以革蘭氏陰性菌外膜蛋白為靶點(diǎn)篩選藥物的方法，尤其是涉及一種以大腸桿菌外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)篩選藥物的方法，旨在為了解決現(xiàn)有技術(shù)的藥物篩選方法可靠性差、效率低的不足，所述方法包括下列步驟(1)基因的克隆及重組載體的構(gòu)建；(2)重組載體的轉(zhuǎn)化、篩選及誘導(dǎo)表達(dá)得高表達(dá)菌；(3)以高表達(dá)菌的外膜孔蛋白OmpW為靶點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞水平的藥物篩選。該方法具有操作簡(jiǎn)單、篩選可靠性好、效率高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/02GKCN103031358SQ201210275708
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年8月6日
發(fā)明者潘建義, 吳賢斌, 鄒海杰 申請(qǐng)人:浙江理工大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan