專利名稱:提高桑氏鏈霉菌kj40產幾丁質酶的培養(yǎng)基及幾丁質酶含菌制劑和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種提高桑氏鏈霉菌KJ40產幾丁質酶的培養(yǎng)基及幾丁質酶含菌制劑和應用。
背景技術：
微生物菌種的生產能力只有在最適發(fā)酵條件下才能得到充分發(fā)揮。優(yōu)良微生物菌種的生產水平受多種因素制約，包括培養(yǎng)基配方、初始pH、培養(yǎng)溫度、接種條件、供氧水平等。發(fā)酵培養(yǎng)基是微生物生長的物質基礎，其組成和配比對菌體生長、抗生物質發(fā)酵單位、提煉工藝、產品質量等都有相當大的影響。發(fā)酵培養(yǎng)基的改良是提高發(fā)酵水平的一個重要的途徑，必須包含滿足微生物的能量、元素和特殊養(yǎng)分，其中各種化合物的種類和濃度對菌體生長繁殖以及產物的質量和產量都有重要的影響。由于微生物種類不同，在發(fā)酵過程中所使用的培養(yǎng)基也有所不同，通常培養(yǎng)基的原料主要有碳源、氮源、無機鹽類、微量元素和水等。碳源是構成微生物細胞和代謝產物中碳素的營養(yǎng)物質，一般占微生物細胞干物質的50%左右。由于各種微生物生理特性的不同，其所能利用的碳源種類也有所不同。常用的碳源有碳水化合物、脂肪、有機酸和醇、碳氫化合物等。氮源是構成微生物細胞和代謝產物中的氮素的營養(yǎng)物質，是微生物發(fā)酵中使用的主要原料之一。有些氮源物質可參與合成抗菌物質前體，可對一些特殊代謝產物的合成起到調節(jié)作用[174175]。常用的氮源有有機源和無機氮源兩大類，有機氮源包括黃豆餅粉、棉籽餅粉、花生餅粉、玉米漿、豆柏、麩皮、酵母粉、蛋白陳、魚粉和酒糟等；無機氮源有尿素、氨水、硫酸氨、氯化氨和硝酸鹽等。微量元素和無機鹽是微生物在生產繁殖和產物合成中所需要的。金屬離子對微生物生理活性的影響大多與其濃度有關，低濃度通常表現為刺激誘導作用，高濃度表現出抑制作用，最適濃度要根據微生物特性和發(fā)酵條件來確定。水是培養(yǎng)基的主要組成成分，對微生物的生產繁殖和產物合成有著重要的作用，它既是構成菌體`細胞的主要成分，又是一切營養(yǎng)物質傳遞的介質。在有些發(fā)酵中，營養(yǎng)缺乏是抗菌物質開始合成的條件，因此培養(yǎng)基中各營養(yǎng)元素的添加量對發(fā)酵生產也至關重要。
在發(fā)酵培養(yǎng)基配方確定的情況下，提高發(fā)酵水平的另一個重要的途徑是選擇合適的培養(yǎng)條件，包括溫度、種齡、接種量、初始pH、溶氧量和發(fā)酵時間等。溫度對菌體生長和代謝產物形成的影響是各種因素綜合表現的結果[m]，如溫度可通過影響發(fā)酵液中溶解氧影響發(fā)酵。從酶反應動力學來看，溫度升高，反應速度隨之加大，代謝加快，產物提前產生，但菌體卻易于衰老進而影響產物合成。接種量大小與菌株種齡和在培養(yǎng)基中的生長繁殖速度有關，接種量大則種子進入發(fā)酵罐后較容易適應，從而縮短菌體繁殖至高峰所需的時間，力口快產物合成速度；但過大的接種量通常會使菌體生長過快而造成營養(yǎng)基質缺乏或溶解氧不足，不利于發(fā)酵；接種量過小則會使發(fā)酵前期菌體生長緩慢，延長發(fā)酵周期，菌絲量少，還可能形成菌絲團，導致發(fā)酵異常。菌體在生長過程中，不同生長階段的生理活性差別較大，發(fā)酵過程中種齡的控制就尤為重要。通常以菌體處于生命力旺盛的對數生長中后期為宜，此時的種子濃度大，質量高，接入適宜的量后，能較快地適應環(huán)境，有利于縮短發(fā)酵周期。每種微生物都有自己生長的最適pH值，在發(fā)酵過程中，pH值的變化不僅能改變體系酶的環(huán)境和營養(yǎng)物質的代謝流，還能使得誘導物和生長因子在活性和非活性之間變化。放線菌生長的最適pH范圍為6-8，一般在培養(yǎng)基中加入一定的緩沖物質來維持穩(wěn)定的pH值。溶解氧是影響微生物發(fā)酵的又一重要因素，會對代謝產物的合成途徑和合成速度產生影響[179]。通常在放線菌發(fā)酵過程中，菌體密度過大會造成發(fā)酵液粘稠，進而引起反應器中溶氧過低，但溶氧過高又會引起菌絲斷裂或結成小球，從而對菌體的生長和產物的合成造成影響，所以需要調整溶氧量來改善這些狀況。發(fā)酵時間的長短也是發(fā)酵生產中一個非常重要的指標，可直接影響代謝產物的產率和質量。
本研究對桑氏鏈霉菌KJ40 (桑氏鏈霉菌KJ40本申請人已于2012年4月25日以菌種形式申請了專利，中國專利申請?zhí)?01210122697.0發(fā)明名稱:桑氏鏈霉菌KJ40菌株及其液體制劑，公開號CN102703343A)產幾丁質酶的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行了優(yōu)化，以期能夠大幅提聞菌株酶活性含量。提聞防治效果。
幾丁質酶作為一種抗菌蛋白是生防菌抑制病原真菌的重要機制之一。合適的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件對于提高幾丁質酶產量必不可少，碳源、氮源、PH值等都與微生物產幾丁質酶密切相關。因此人們在提高微生物的產幾丁質酶量時，必須對發(fā)酵條件進行適當調控，以確定該菌最適的產酶條件，為更強抑制真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長，激發(fā)植物啟動防御反應，使植物產生更多的防御蛋白，增強植物的抗性提供基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種提高桑氏鏈霉菌KJ40產幾丁質酶的培養(yǎng)基及幾丁質酶含菌制劑和幾丁質酶含菌制劑的應用。
本發(fā)明中的桑氏鏈霉菌KJ40本申請人已于2012年4月25日以菌種形式申請了專利，中國專利申請?zhí)?01210122697.0發(fā)明名稱:桑氏鏈霉菌KJ40菌株及其液體制劑，公開號 CN102703343A。
本發(fā)明的技術方案如下:
一種提高桑氏鏈霉菌KJ40產幾丁質酶的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為:溶度為2% (w/V)的膠體幾丁質 100ml/L，黃豆餅粉 0.4wt%，K2HPO4L O (g/L)，KH2PO40.6 (g/L)。
所述的培養(yǎng)基制備的幾丁質酶含菌制劑，將所述桑氏鏈霉菌KJ40種子接入所述培養(yǎng)基中，然后置于恒溫搖床上，于26°C, 140r/min振蕩培養(yǎng)144小時,制成幾丁質酶含菌制劑。
所述的幾丁質酶含菌制劑在制作預防楊樹紫根病藥劑中的應用，將所述幾丁質酶含菌制劑按照體積比50-100倍稀釋，沿楊樹苗木根系幅面灌根，每株100毫升，每年春、夏
季施各用一次。
與產酶基礎培養(yǎng)基(膠體幾丁質200ml，K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，M gS04.7H200.5g，FeSO4 *7H200.0lg, ZnSO40.0Olg，蒸餾水1000ml，pH7.0)相比，本發(fā)明的新配方及發(fā)酵條件生產的幾丁質酶活性提高約80%。用上述幾丁質酶含菌制劑50-100倍(體積比)稀釋度沿楊樹苗木根系幅面灌根，每株100毫升，每年春、夏季施各用一次，可預防楊樹紫根病的發(fā)生。


圖1為發(fā)酵時間對酶活的影響；
圖2為不同碳源對發(fā)酵產酶的影響；
圖3為氮源對發(fā)酵產酶的影響；
圖4為初始pH值對菌株112903產幾丁質酶的影響；
圖5為溫度對產酶活性的影響；
具體實施方式
以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
實施例1
在產酶基礎培養(yǎng)基上，通過添加碳源、氮源、等單因素實驗，確定培養(yǎng)基的成分，設計4因素3水平的正交實驗，獲得菌株在4因素的影響下產酶的最佳配比是:膠體幾丁質(膠體幾丁質水溶液的溶度為2%，w/V) 100ml/L,黃豆餅粉0.4%，K2HPO4L O (g/L)，KH2PO40.6 (g/L)。其中對產酶影響最大的是氮源含量，其次為K2HPO4的含量，相比之下底物濃度和KH2PO4含量對產酶的影響較小。
1.1培養(yǎng)時間與產酶的關系
以產酶基礎培養(yǎng)基(膠體幾丁質200ml，K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，M gS04.7H200.5g，FeSO4.7H200.0lg, ZnSO40.0Olg，蒸餾水1000ml，pH7.0)為初始培養(yǎng)基。將配置好的培養(yǎng)基分裝至IOOml三角瓶中，每瓶20ml，121 °C滅`菌30min，冷卻后每瓶接入Im濃度為107/ml的孢子懸液，每個平行樣品設3次重復，然后置于恒溫搖床上，于25°C，140r/min振蕩培養(yǎng)，每24小時測定一次幾丁質酶活力。測定方法參照DNS法。繪制生防鏈霉菌的產酶曲線。
實驗結果如圖1所示，在產酶基礎培養(yǎng)基中，桑氏鏈霉菌在最初的2d中產酶量比較低，但從第3天到第6天的時間內酶活顯著增加，并在第6天時酶活達到最大。此后隨培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液中幾丁質酶活性開始下降。因此在以后的實驗中，選擇第6天作為最佳酶活力的測定時間。
1.2碳源對鏈霉菌產幾丁質酶的影響
在基礎培養(yǎng)基中添加1%的各種碳源，以基礎培養(yǎng)基為對照。碳源有以下幾種:葡萄糖，N-乙酰-D-氨基葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，乳糖，甘油、淀粉。研究各種碳源對產酶的影響。每瓶接入Im濃度為IOVml的孢子懸液，每個平行樣品設3次重復，然后置于恒溫搖床上，于25°C，140r/min振蕩培養(yǎng)。第六天測定幾丁質酶活力。測定方法參照DNS法。
在基礎培養(yǎng)基中，以100ml/L的膠體幾丁質與0.1%的其它碳源作為復合碳源進行發(fā)酵對比實驗，結果如圖2，以葡萄糖、淀粉、麥芽糖、乳糖、NAG、作為添加碳源時，吸光度達到儀器的極限值，無法估算其中的幾丁質酶含量。添加蔗糖和甘油的培養(yǎng)基發(fā)酵液的酶活力低于以膠體幾丁質作為唯一碳源的酶活力，蔗糖和甘油對產酶有一定的抑制作用，以膠體幾丁質作為唯一碳源時產酶效果最好。
1.3氮源對鏈霉菌產幾丁質酶的影響
在基礎培養(yǎng)基中添加0.2wt%的各種氮源，以基礎培養(yǎng)基為對照，考察不同氮源對產幾丁質酶的影響，無機氮源有(NH4) 2S04、NH4NO3^ KNO3 ;有機氮源有蛋白胨(黃豆餅粉)、牛肉膏。[0029]在基礎培養(yǎng)基中分別添加幾種單一有機或無機氮源，結果見圖3，以蛋白胨為氮源時酶活力最高，其次是牛肉膏；采用單一無機氮源時產酶都較低。
1.4產酶培養(yǎng)基配方的優(yōu)化
表I拮抗菌(桑氏鏈霉菌)發(fā)酵培養(yǎng)基組分正交實驗因素編碼表
權利要求
1.一種提高桑氏鏈霉菌KJ40產幾丁質酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基為:溶度為 2% (w/V)的膠體幾丁質 100ml/L,黃豆餅粉 0.4wt%，K2HPO4L O (g/L)，KH2PO40.6 (g/L)。
2.根據權利要求
1所述的培養(yǎng)基制備的幾丁質酶含菌制劑，其特征在于，將所述桑氏鏈霉菌KJ40種子接入所述培養(yǎng)基中，然后置于恒溫搖床上，于26°C，140r/min振蕩培養(yǎng)144小時，制成幾丁質酶含菌制劑。
3.根據權利要求
2所述的幾丁質酶含菌制劑在制作預防楊樹紫根病藥劑中的應用，其特征在于，將所述幾丁質酶含菌制劑按照體積比50-100倍稀釋，沿楊樹苗木根系幅面灌根，每株100毫升，每年春 、夏季施各用一次。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種提高桑氏鏈霉菌KJ40產幾丁質酶的培養(yǎng)基及幾丁質酶含菌制劑和應用，所述培養(yǎng)基為溶度為2%(w/V)的膠體幾丁質100ml/L，黃豆餅粉0.4wt%，K2HPO41.0(g/L)，KH2PO40.6(g/L)。與產酶基礎培養(yǎng)基相比，本發(fā)明的新配方及發(fā)酵條件生產的幾丁質酶活性提高約80%。用上述幾丁質酶含菌制劑50-100倍(體積比)稀釋度沿楊樹苗木根系幅面灌根，每株100毫升，每年春、夏季施各用一次，可預防楊樹紫根病的發(fā)生。
文檔編號A01N63/02GKCN103088005SQ201310038610
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月31日
發(fā)明者朱天輝, 李姝江, 雷美艷, 張麗娜, 譙天敏 申請人:四川農業(yè)大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan