專利名稱:一種高產(chǎn)多糖的紫芝及其發(fā)酵生產(chǎn)工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物技術領域：
，涉及一株高產(chǎn)多糖的紫芝菌及其發(fā)酵方法與在生產(chǎn)靈芝多糖中的應用。
背景技術：
靈芝是藥用、保健價值極高的大型擔子真菌。靈芝屬已知品種約有100多種，其中以赤芝和紫芝的用途最為廣泛。近年來國內(nèi)外對赤芝菌種、產(chǎn)品開發(fā)及其藥理方面的研究均做了大量工作。研究表明靈芝具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、安定、催眠、鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、保肝解毒以及增強心肌收縮力和擴張冠狀動脈的功效；靈芝多糖、肽聚糖具有降血糖、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌與代謝的保健作用。靈芝在臨床上可用于治療神經(jīng)衰弱，有效率為96％；用于治療慢性病毒性肝炎，總有效率為95.18％(靈芝的研究及進展-11，何來英等，衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所)。
紫芝是中國傳統(tǒng)的靈芝之精品，但紫芝人工較難馴化培養(yǎng)，因而市場上的紫芝產(chǎn)品較少見。2001年4月衛(wèi)生部下達文件鼓勵包括紫芝在內(nèi)的三個靈芝品種的藥用真菌的研究與產(chǎn)品開發(fā)。
目前，國內(nèi)外對靈芝多糖的研究一般都停留在子實體多糖的提取和液態(tài)菌絲體多糖的提取上。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，用生物發(fā)酵技術培養(yǎng)靈芝的菌絲體已形成產(chǎn)業(yè)化規(guī)模。我國在這方面的科研成果主要體現(xiàn)在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體的培養(yǎng)條件以及液態(tài)培養(yǎng)過程中菌絲體代謝產(chǎn)物的研究上，但大多以赤芝多糖為研究對象，較少涉及對紫芝的研究。對紫芝半固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)條件的研究還未見報道，特別是以紫芝為研究對象對其半固態(tài)培養(yǎng)過程中菌絲體代謝產(chǎn)物及次生代謝產(chǎn)物的研究更為少見。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)多糖的紫芝菌和對該菌株進行半固態(tài)發(fā)酵的方法。
本發(fā)明所提供的紫芝菌為紫芝菌(Ganoderma sinense)YTZ9k1 CGMCC No.0742，已于2002年04月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.0742。本發(fā)明的紫芝菌YTZ9k1，是采用Co60人工誘變的方法選育篩選出的，經(jīng)中國科學院微生物研究所鑒定為紫芝菌(GanodermasinenseJ.D.Zhao，L.W.Hsu & X.Q.Zhang)。
本發(fā)明所提供的發(fā)酵紫芝菌YTZ9k1 CGMCC NO.0742的方法，包括母種培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)；其中母種和一級種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有土豆20-35％、葡萄糖5-10％、蛋白胨2-5％的馬鈴薯培養(yǎng)基，二級種子和生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有黃豆10-20％、玉米粉5-10％、硫酸鎂0.5-1％、磷酸二氫鉀0.5-1％、碳酸鈣0.5-1％的大豆培養(yǎng)基。
在實際操作中，母種培養(yǎng)的接種量為1-2％；一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)的接種量均為5-10％。母種和一級種子培養(yǎng)的溫度均為28±2℃；二級種子培養(yǎng)的溫度為27±2℃；生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為26±2℃。母種和一級種子培養(yǎng)的時間均為5-7天；二級種子培養(yǎng)的時間為7-10天；生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)的時間為12-15天。母種和一級種子培養(yǎng)的相對濕度均為85-90％；二級種子培養(yǎng)的相對濕度為80-85％；生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)的相對濕度為75-85％。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種自紫芝菌YTZ9k1 CGMCC No.0742中分離的靈芝多糖及其分離方法。
本發(fā)明所提供的靈芝多糖是用下述方法得到的將紫芝菌YTZ9k1 CGMCC No.0742的菌絲粉水浸提后，用己酸鉛去除蛋白質(zhì)，80％乙醇沉淀多糖，然后丙酮、己醇交替洗滌多糖，再用蒸餾水加熱溶解多糖，加無水乙醇，使含醇量達20％，離心去除雜質(zhì)，得到多糖液，繼續(xù)加無水乙醇，使含醇量達80％，靜置過夜后，經(jīng)4000rpm離心20分鐘，得靈芝粗多糖，用水溶解多糖后，流動水透析糖液3天，然后依次加無水乙醇，使含醇量達到50％、60％、70％、80％靜置過夜，自然風干，得到產(chǎn)品。
本發(fā)明的紫芝菌YTZ9K1是一株高產(chǎn)多糖的紫芝菌株，用本發(fā)明的半固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)的紫芝菌YTZ9K1的菌絲體多糖、菌絲體代謝產(chǎn)物以及次生代謝產(chǎn)物具有較高的營養(yǎng)價值和保健功效，每100克菌絲粉可獲得靈芝多糖高達14克左右，比原菌種以及報道過的靈芝多糖的產(chǎn)量提高了50-100％，具有廣闊的市場前景。
本發(fā)明將紫芝菌絲體發(fā)酵從普通應用的工業(yè)化液態(tài)深層發(fā)酵技術發(fā)展成為半固態(tài)淺層發(fā)酵技術，根據(jù)紫芝菌YTZ9K1的半固態(tài)發(fā)酵的生長、發(fā)酵條件及發(fā)酵動力學的研究，設計了一條較完整的年產(chǎn)10噸級的半自動化半固態(tài)菌絲發(fā)酵工藝生產(chǎn)線，其工藝流程如圖1所示。



圖1為紫芝菌YTZ9k1 CGMCC NO.0742的發(fā)酵工藝流程圖具體實施方式
實施例1、紫芝菌CGMCC NO.0742菌絲體的發(fā)酵生產(chǎn)1、培養(yǎng)基配方1)母種馬玲薯培養(yǎng)基；土豆20-35％、葡萄糖5-10％、蛋白胨2-5％。120℃，高壓(1.4公斤/平方厘米)滅菌30分鐘。
2)一級種子培養(yǎng)基同母種培養(yǎng)基。
3)二級種子大豆培養(yǎng)基黃豆10-20％，玉米粉5-10％；硫酸鎂0.5-1％；磷酸二氫鉀0.5-1％；碳酸鈣0.5-1％。120℃，高壓(1.4公斤/平方厘米)滅菌30分鐘。
4)生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基黃豆10-20％，玉米粉5-10％；硫酸鎂0.5-1％；磷酸二氫鉀0.5-1％；碳酸鈣0.5-1％。120℃，高壓(1.4公斤/平方厘米)滅菌90分鐘。
2、發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵包括以下步驟1)母種培養(yǎng)將紫芝菌CGMCC NO.0742按1-2％的比例在超凈工作臺中接種于母種馬玲薯培養(yǎng)基中，28±2℃，濕度85-90％，培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)5-7天；2)一級種子擴大培養(yǎng)將母種按5-10％的比例在超凈工作臺中接種于一級培養(yǎng)馬玲薯培養(yǎng)基中，28±2℃，濕度85-90％，培養(yǎng)箱內(nèi)搖床培養(yǎng)5-7天；3)二級種子擴大培養(yǎng)將一級種子按5-10％的比例在超凈工作臺中接種于二級培養(yǎng)大豆培養(yǎng)基中，27±2℃，濕度80-85％，無菌間內(nèi)搖床培養(yǎng)7-10天；4)生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)將二級種子按5-10％的比例在無菌間內(nèi)接種于生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，26±2℃，濕度75-85％，無菌間內(nèi)靜置培養(yǎng)12-15天，得到大量紫芝菌CGMCCNO.0742的菌絲體。
實施例2、靈芝多糖的分離和純化靈芝多糖的分離和純化步驟是通過發(fā)酵制備的紫芝菌YTZ9k1 CGMCC No.0742菌絲粉經(jīng)水浸提后，用己酸鉛去除蛋白質(zhì)，80％乙醇沉淀多糖，然后丙酮、己醇交替洗滌多糖，再用蒸餾水加熱溶解多糖，加無水乙醇，使含醇量達20％，離心去除雜質(zhì)，得到多糖液，繼續(xù)加無水乙醇，使含醇量達80％，靜置過夜后，經(jīng)4000rpm離心20分鐘，得紫芝粗多糖，用水溶解多糖后，流動水透析糖液3天，然后依次加無水乙醇，使含醇量達到50％、60％、70％、80％靜置過夜，自然風干，得到產(chǎn)品。
權利要求
1.紫芝菌(Ganoderma sinense)YTZ9kl CGMCC No.0742。
2.一種發(fā)酵紫芝菌YTZ9kl CGMCC NO.0742的方法，包括母種培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)；其中母種和一級種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有土豆20-35％、葡萄糖5-10％、蛋白胨2-5％的馬鈴薯培養(yǎng)基，二級種子和生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有黃豆10-20％、玉米粉5-10％、硫酸鎂0.5-1％、磷酸二氫鉀0.5-1％、碳酸鈣0.5-1％的大豆培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權利要求
2所述的方法，其特征在于所述母種培養(yǎng)的接種量為1-2％；所述一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)的接種量均為5-10％。
4.根據(jù)權利要求
2所述的方法，其特征在于所述母種和一級種子培養(yǎng)的溫度均為28±2℃；二級種子培養(yǎng)的溫度為27±2℃；生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為26±2℃。
5.根據(jù)權利要求
2所述的方法，其特征在于所述母種和一級種子培養(yǎng)的時間均為5-7天；二級種子培養(yǎng)的時間為7-10天；生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)的時間為12-15天。
6.根據(jù)權利要求
2所述的方法，其特征在于所述母種和一級種子培養(yǎng)的相對濕度均為85-90％；二級種子培養(yǎng)的相對濕度為80-85％；生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)的相對濕度為75-85％。
7.一種自紫芝菌YTZ9kl CGMCC No.0742中分離靈芝多糖的方法，是將紫芝菌絲粉經(jīng)水浸提后，用己酸鉛去除蛋白質(zhì)，80％乙醇沉淀多糖，然后丙酮、己醇交替洗滌多糖，再用蒸餾水加熱溶解多糖，加無水乙醇，使含醇量達20％，離心去除雜質(zhì)，得到多糖液，繼續(xù)加無水乙醇，使含醇量達80％，靜置過夜后，經(jīng)4000rpm離心20分鐘，得紫芝粗多糖，用水溶解多糖后，流動水透析糖液3天，然后依次加無水乙醇，使含醇量達到50％、60％、70％、80％靜置過夜，自然風干，得到產(chǎn)品。
8.自紫芝菌YTZ9kl CGMCC No.0742中分離的靈芝多糖，它是用下述方法得到的將紫芝菌絲粉經(jīng)水浸提后，用己酸鉛去除蛋白質(zhì)，80％乙醇沉淀多糖，然后丙酮、己醇交替洗滌多糖，再用蒸餾水加熱溶解多糖，加無水乙醇，使含醇量達20％，離心去除雜質(zhì)，得到多糖液，繼續(xù)加無水乙醇，使含醇量達80％，靜置過夜后，經(jīng)4000rpm離心20分鐘，得靈芝粗多糖，用水溶解多糖后，流動水透析糖液3天，然后依次加無水乙醇，使含醇量達到50％、60％、70％、80％靜置過夜，自然風干，得到產(chǎn)品。
9.紫芝菌(Ganoderma sinense)YTZ9kl CGMCC No.0742在生產(chǎn)紫芝多糖中的應用。
10.紫芝菌(Ganoderma sinense)YTZ9kl CGMCC No.0742在生產(chǎn)靈芝多糖中的應用。
11.紫芝菌(Ganoderma sinense)YTZ9kl CGMCC No.0742在生產(chǎn)紫芝菌絲粉中的應用。
專利摘要
本發(fā)明公開了一株紫芝菌及其發(fā)酵方法與應用。紫芝菌YTZ9kl CGMCC No.0742的發(fā)酵包括母種培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)；其中母種和一級種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有土豆20-35%、葡萄糖5-10%、蛋白胨2-5%的馬鈴薯培養(yǎng)基，二級種子和生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有黃豆10-20%、玉米粉5-10%、硫酸鎂0.5-1%、磷酸二氫鉀0.5-1%、碳酸鈣0.5-1%的大豆培養(yǎng)基。紫芝菌YTZ9K1是一株高產(chǎn)多糖的紫芝菌株，每100克菌絲粉可獲得靈芝多糖高達14克左右，比原菌種以及報道過的靈芝多糖的產(chǎn)量提高了50-100%，具有廣闊的市場前景。
文檔編號C12N1/14GKCN1202238SQ02134967
公開日2005年5月18日 申請日期2002年10月26日
發(fā)明者林萍 申請人:東莞市英芝堂生物工程有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan