專利名稱:炎性抑制因子Fwa116的制作方法
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及最新鑒定的多核苷酸和由其編碼的多肽，這種多核苷酸和多肽的生產(chǎn)方法以及這些多核苷酸和多肽的用途。本發(fā)明的多肽已被鑒定為細(xì)胞炎性抑制因子，下文有時(shí)稱為“Fwa116”。本發(fā)明的多核苷酸和多肽是人類來(lái)源的。
發(fā)明背景心腦血管病是威脅人類健康的重大疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年約有260萬(wàn)中國(guó)人死于此病，平均每12秒就有一位同胞被該病奪去生命。在中國(guó)，心腦血管病死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)的比率從1957年的12.1％上升至1990年的35.8％，升高了2.9倍。據(jù)世界銀行預(yù)測(cè)到2020年，全世界心腦血管病死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)的比率將從1990年的28.9％升至36.3％，其中70％的心腦血管病發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。中國(guó)現(xiàn)有高血壓患者1億多人，并以每年350萬(wàn)人的速度遞增；腦中風(fēng)致殘者600萬(wàn)人，并以每年150萬(wàn)的速度遞增；冠心病患者100萬(wàn)人，并以每年50萬(wàn)的速度遞增；此外，還有心肌病患者300萬(wàn)人。因此，心腦血管病的防治對(duì)減輕人類經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，確保人體健康具有十分重要的意義。
心腦血管病的治療經(jīng)歷了四個(gè)大的階段1920年代，循環(huán)動(dòng)力學(xué)的研究揭示了心臟是一個(gè)“泵”，由此奠定了心力衰竭的治療基礎(chǔ)；60-70年代，對(duì)心血管病危險(xiǎn)因素的認(rèn)識(shí)及處理，使西方國(guó)家心臟病的發(fā)病率下降了近40％1970年，對(duì)心肌細(xì)胞電生理學(xué)的研究，提供了抗心律失常、電生理檢查及治療的新方法；80年代末到90年代初，對(duì)血管生物學(xué)的認(rèn)識(shí)，產(chǎn)生了心臟介入治療的新方法。
心衰、抗心律失常、及介入治療對(duì)搶救心腦血管病人的生命，提高其生活質(zhì)量起到了積極作用。然而，由于這些方法僅針對(duì)癥狀進(jìn)行治療，沒(méi)有從根本上觸及病因，所以治療針對(duì)性不強(qiáng)。雖然延長(zhǎng)了病人的壽命，但沒(méi)有真正達(dá)到預(yù)防和治愈的目的。因此，在分子生物學(xué)的水平進(jìn)行研究，查明心腦血管病的致病因素及發(fā)病機(jī)理，有望在該病的治療方面取得突破性進(jìn)展，達(dá)到從根本上遏制心腦血管病的目的。
cDNA文庫(kù)是生物工程領(lǐng)域的重要研究工具之一。通常從細(xì)胞中提取mRNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶合成mRNA的DNA拷貝(即cDNA，Complementary DNA)。單鏈cDNA分子在DNA聚合酶的作用轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA分子，然后再插入載體，轉(zhuǎn)化到宿主菌中長(zhǎng)成克隆。這樣的每個(gè)克隆只包含特定的mRNA信息，這樣的一套克隆就稱為cDNA文庫(kù)。
由于cDNA不含內(nèi)含子，從cDNA文庫(kù)中可以直接篩選到相應(yīng)的表達(dá)基因，故相對(duì)基因庫(kù)而言，cDNA文庫(kù)具有操作簡(jiǎn)單、使用方便的優(yōu)點(diǎn)。人體不同細(xì)胞表達(dá)基因的差異決定了其組織和器官表型的差異，從人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)中分離和鑒定特異表達(dá)基因，特別是分離和鑒定疾病相關(guān)基因，是研究遺傳性心血管病的有效方法之一。
發(fā)明概述按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種新的成熟多肽Fwa116以及具有生物學(xué)活性并在診斷或治療上有用途的Fwa116的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的多肽是人類來(lái)源的。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA，以及具有生物學(xué)活性并在診斷學(xué)或治療學(xué)上有用途的該核酸分子的片段、類似物和衍生物。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用重組技術(shù)生產(chǎn)Fwa116多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的重組原核和/或真核宿主細(xì)胞。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了將Fwa116多肽或編碼Fwa116多肽的多核苷酸用于治療的方法。例如，治療心血管炎癥性動(dòng)脈粥樣硬化。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了這些多肽的抗體。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了所述多肽的拮抗劑，其可用來(lái)抑制這些多肽的作用。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了與本發(fā)明核酸序列中的突變、以及與本發(fā)明的多肽異常表達(dá)有關(guān)的疾病或疾病易感性的診斷方法。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了將本發(fā)明的多肽或編碼這種多肽的多核苷酸、在體外用于科學(xué)研究、DNA合成以及人工構(gòu)建DNA載體的方法。
根據(jù)本文的教導(dǎo)，上述方面及相關(guān)方面對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)。從文庫(kù)中獲取Fwa116的基因片段，通過(guò)EST拼接得到Fwa116的全長(zhǎng)cDNA序列。進(jìn)而研究Fwa116基因在不同組織的表達(dá)與分布，研究Fwa116多肽的活性與功能。
發(fā)明詳述按照本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸(多核苷酸)序列，其編碼具有推定的、如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的成熟多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從成人主動(dòng)脈的cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的。其定位于人體細(xì)胞的第17號(hào)染色體上。其包含一個(gè)開放閱讀框架，可以編碼具有409個(gè)氨基酸殘基的多肽。同源性分析表明Fwa116多肽與cdk5激活劑結(jié)合蛋白C53的同源性為70％。
推測(cè)的Fwa116多肽由409個(gè)氨基酸組成。其序列特征為(A)從13至18Aa(GVSWAE)，從157至162Aa(GTEPSV)，從193至198Aa(GTDSGI)，從204至209Aa(GIDWGI)，從222至227Aa(GIDWGD)為N-豆蔻?；稽c(diǎn)(5個(gè))；(B)從15至18Aa(SWAE)，從57至60Aa(SRKE)，從113至116Aa(SLGE)，從131至134Aa(SPTE)，從150至153Aa(TVYE)，從156至159Aa(TGTE)，從161至164Aa(SVVE)，從235至238Aa(TVLE)，從255至258Aa(TLLE)，從316至319Aa(SVLE)為酪蛋白激酶II位點(diǎn)(10個(gè))；(C)從41至43Aa(SLK)，從57至59Aa(SRK)，從77至79Aa(SCK)，從339至341Aa(SPR)，從404至406Aa(SKR)，從408至410Aa(SGR)為蛋白激酶C位點(diǎn)(6個(gè))；(D)從148至151Aa(NSTV)為N-糖基化位點(diǎn)；(E)從270至291Aa(LMELEIFLAQRAVELSEEADVL)，從277至298Aa(LAQRAVELSEEADVLSVSQFQL)為亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(2個(gè))；(F)從405至408Aa(KRYS)為cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶位點(diǎn)。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈的，如果是單鏈的，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼成熟多肽的編碼序列可以和SIQ ID NO1(全長(zhǎng)2546個(gè)核苷酸)所示的編碼序列(1002至2261位核苷酸)相同；或者，由于遺傳密碼的豐余性或簡(jiǎn)并性，編碼序列也可以不同與SIQ ID NO1所示的編碼序列。
編碼SIQ ID NO2所示成熟多肽的多核苷酸可以包括成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和附加的編碼序列，如編碼多肽前導(dǎo)序列或分泌序列的多核苷酸；成熟多肽的編碼序列(以及任選的附加編碼序列)和非編碼序列，如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列5’和/或3’端的非編碼序列。
因此，術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”包括僅含有多肽編碼序列的多核苷酸以及含有附加的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼推定的、具有SIQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽片段、類似物及衍生物。所述變異體可以是天然產(chǎn)生的該多核苷酸的等位基因變異體，或者是非天然產(chǎn)生的變異體。正如本領(lǐng)域已知的，等位基因變異體是一段多核苷酸的另一種形式，其可以帶有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或添加，而實(shí)質(zhì)上不改變所編碼多肽的功能。
因此，本發(fā)明包括能夠編碼與SIQ ID NO2所示成熟多肽具有相同氨基酸序列的多核苷酸，還包括能夠編碼SIQ ID NO2所示成熟多肽之片段、衍生物和類似物的多核苷酸變異體。這些變異體包括缺失變異體、取代變異體、添加或插入變異體。
本發(fā)明也包括這樣的多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可以在相同的閱讀框架中，與有助于多肽由宿主細(xì)胞表達(dá)及分泌的多核苷酸(如產(chǎn)生前導(dǎo)序列的多核苷酸)相融合。前導(dǎo)序列作為分泌序列而控制多肽從細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)。具有前導(dǎo)序列的多肽是前體蛋白(preprotein)，由宿主細(xì)胞切割其前導(dǎo)序列后可以產(chǎn)生成熟多肽。本發(fā)明的多核苷酸也可以編碼蛋白原(proprotein)，蛋白原是具有原序列(prosequence)的成熟蛋白，是5’端附加了氨基酸殘基的成熟蛋白，是一種無(wú)活性形式。切除原序列后，可以產(chǎn)生有活性的成熟蛋白。
因此，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼一種成熟蛋白，也可以編碼具有原序列的蛋白，還可以編碼既有原序列(prosequence)又有前導(dǎo)序列(presequence)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多核苷酸還包括在同一讀框中與標(biāo)記序列融合的編碼序列，標(biāo)記序列可用于純化本發(fā)明的多肽。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞為細(xì)菌時(shí)，標(biāo)記序列可以是由pQE-9載體提供的、用于純化融合產(chǎn)物的六組氨酸?；蛘?，當(dāng)宿主為哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如COS-7細(xì)胞)時(shí)，標(biāo)記序列可以是血細(xì)胞凝集素(HA)，HA標(biāo)記對(duì)應(yīng)于從流感血凝集蛋白衍生的一個(gè)表位(Wilson，I.，等，細(xì)胞，37767(1984))。
術(shù)語(yǔ)“基因”是指與產(chǎn)生多肽有關(guān)的DNA片段，其包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，以及在各個(gè)編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
本發(fā)明全長(zhǎng)基因的片段可以用作cDNA文庫(kù)的雜交探針，用來(lái)分離全長(zhǎng)基因和與該基因有高度同源性或相似生物活性的其它基因。所說(shuō)的探針優(yōu)選具有至少30個(gè)堿基，并且可以含有50個(gè)或更多個(gè)堿基。所述探針也可以用來(lái)鑒別相應(yīng)于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆和含有完整基因的一個(gè)或多個(gè)基因組克隆。其中，完整基因包括調(diào)節(jié)序列、啟動(dòng)子序列、外顯子和內(nèi)含子。例如可以根據(jù)已知的DNA序列合成寡核苷酸探針，進(jìn)而分離出基因的編碼部分。與本發(fā)明基因序列互補(bǔ)的、標(biāo)記的寡核苷酸探針可以用來(lái)從人類cDNA、基因組DNA或mRNA文庫(kù)中篩選與其雜交的文庫(kù)成員。
本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的多核苷酸雜交的核酸序列。條件是兩個(gè)序列間具有至少85％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％的同源性。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的多核苷酸雜交的多核苷酸。本文所用術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指僅在序列間具有至少95％，優(yōu)選具有至少97％的同源性時(shí)雜交才會(huì)發(fā)生。與上述序列雜交的多核苷酸可以編碼與本發(fā)明成熟多肽具有相同生物學(xué)功能或活性的多肽。
此外，與本發(fā)明的多核苷酸具有同源性并能夠雜交的多核苷酸可以具有至少20個(gè)堿基，優(yōu)選至少30個(gè)堿基，更優(yōu)選至少50個(gè)堿基，其可以保留或不保留活性。這樣的多核苷酸可以用作SEQ ID NO1的探針，用于回收多核苷酸、作為診斷探針或作為PCR引物。
因此，本發(fā)明涉及與編碼SEQ ID NO2所示多肽的多核苷酸具有至少85％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％同源性的多核苷酸及其片段(所述片段具有至少30個(gè)堿基，優(yōu)選至少50個(gè)堿基)，以及由這些多核苷酸編碼的多肽。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)發(fā)明，本發(fā)明涉及推定的、具有SIQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽及其片段、類似物和衍生物。
術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類似物”，當(dāng)涉及由SIQ ID NO1編碼的多肽或者具有如SIQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽時(shí)，是指基本上保留了所述多肽生物學(xué)功能或活性的多肽。所說(shuō)的類似物可以包括蛋白原，蛋白原經(jīng)部分切除后可以產(chǎn)生有活性的成熟多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
所說(shuō)的多肽(SIQ ID NO2)及其片段、衍生物或類似物可以是(i)一種多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守的氨基酸殘基)取代，并且被取代的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼子編碼的，或者(ii)一種多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含取代基，或者(iii)一種多肽，其中成熟多肽與另一種化合物融合，如與增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙烯乙二醇)融合，或者(iv)一種多肽，其中成熟多肽與附加氨基酸殘基融合，例如與前導(dǎo)或分泌序列融合，又如與用來(lái)純化成熟多肽的序列融合。通過(guò)本文的教導(dǎo)，這樣的片段、衍生物及類似物可視為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離形式提供的，并且優(yōu)選將其純化成均一(同質(zhì))物質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“分離的”是指所述物質(zhì)脫離了原始環(huán)境(例如，如果該物質(zhì)是天然存在的，則指天然環(huán)境)。例如，一種在活體動(dòng)物中天然存在的多核苷酸或多肽不是分離的，但從天然系統(tǒng)中部分或全部共存物質(zhì)中分離出同樣的多核苷酸或多肽則是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分，這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，只要這種載體或者組合物不是其天然環(huán)境的一部分。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2所示的多肽(特別是成熟多肽)以及與SEQ IDNO2的多肽具有至少85％的同源性，更優(yōu)選90％的同源性，最優(yōu)選95％的同源性的多肽。本發(fā)明還包括上述多肽的片段，多肽片段通常包含至少30個(gè)，優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸。
如本領(lǐng)域所熟知的，兩個(gè)多肽之間的“同源性”是通過(guò)將一個(gè)多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代與另一個(gè)多肽比較而確定的。
通過(guò)多肽合成，本發(fā)明的多肽片段(或部分多肽)可用于生產(chǎn)全長(zhǎng)多肽。此片段可用作產(chǎn)生全長(zhǎng)多肽的中間體。同樣的，本發(fā)明的多核苷酸片段可以用于合成本發(fā)明的全長(zhǎng)多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，涉及含有本發(fā)明多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體基因工程化的宿主細(xì)胞，以及通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法。
宿主細(xì)胞是用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)而產(chǎn)生的。所說(shuō)的載體可以是克隆或表達(dá)載體。載體可以是質(zhì)粒、病毒顆粒和噬菌體等形式。工程宿主細(xì)胞可以在經(jīng)改良適于激活啟動(dòng)子、篩選轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增本發(fā)明Fwa116基因的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件(如溫度和pH值)是由不同的宿主細(xì)胞決定的，這些對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
通過(guò)重組技術(shù)，本發(fā)明的多核苷酸可以用于生產(chǎn)多肽。多核苷酸可以包含在任何一種適于表達(dá)多肽的載體中。這樣的載體包括染色體來(lái)源的、非染色體來(lái)源的和合成的DNA序列。例如SV40衍生物，細(xì)菌質(zhì)粒，噬菌體DNA，桿狀病毒，酵母質(zhì)粒，從質(zhì)粒和噬菌體DNA結(jié)合得到的載體，病毒DNA(如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒、和假狂犬病病毒)。此外，還可以使用其它載體，只要其可以在宿主中復(fù)制并存活。
可以用多種方法將合適的DNA序列插入到載體中。一般來(lái)說(shuō)，是用本領(lǐng)域已知的方法將DNA序列插入到適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)中。
表達(dá)載體中的DNA序列可以與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列(啟動(dòng)子)連接，以指導(dǎo)mRNA的合成。啟動(dòng)子的例子有LTR或SV 40啟動(dòng)子，大腸桿菌的lac或trp，噬菌體λPL啟動(dòng)子，以及已知其它的、控制原核或真核細(xì)胞或其病毒中基因表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體也以包含指導(dǎo)翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體還可以包含用于擴(kuò)增表達(dá)的合適序列。
此外，優(yōu)選的表達(dá)載體包含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因，以便為轉(zhuǎn)化后宿主細(xì)胞的篩選提供表型特征。例如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或者如用于大腸桿菌的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性。
含有上述合適的DNA序列以及合適的啟動(dòng)子或者調(diào)控序列的載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗鳎允蛊浔磉_(dá)蛋白質(zhì)。
作為合適宿主的代表性例子有細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞如Drosorphila S2和Spodoptera Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細(xì)胞等。通過(guò)本文的教導(dǎo)，選擇合適的宿主可視作在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明還包括含有以上廣泛描述的一種或多種序列的重組構(gòu)建體。構(gòu)建體包括正向或反向插入了本發(fā)明核酸序列的載體，如質(zhì)?；虿《据d體。在更為理想的實(shí)施方案中，構(gòu)建體還包含了可操作地與所述序列連接的調(diào)節(jié)序列，如啟動(dòng)子。許多合適的載體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并可以通過(guò)商業(yè)途徑獲得。例如，細(xì)菌載體pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNHSA、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)；真核載體pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。此外，還可以使用其它的質(zhì)?；蜉d體，只要它們能夠在宿主中復(fù)制并存活。
可以用帶有CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)或其它選擇標(biāo)記的載體從基因中選擇啟動(dòng)子區(qū)。兩個(gè)合適的載體是PKK232-8和PCM7。特別提到的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、和trp。真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期，SV胸苷激酶，早期和晚期SV40、來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-I。選擇適當(dāng)?shù)妮d體與啟動(dòng)子可視作在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)，或低等真核細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)，或者是原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞)。通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔法可以實(shí)現(xiàn)構(gòu)建體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學(xué)中的基本方法，(1986))。
宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體可以經(jīng)由常規(guī)方式產(chǎn)生由重組序列編碼的產(chǎn)物。而且，本發(fā)明的多肽可以用常規(guī)的多肽合成儀合成。
在合適啟動(dòng)子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或其它細(xì)胞中表達(dá)。用來(lái)源于本發(fā)明DNA構(gòu)建體的RNA，通過(guò)無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可以產(chǎn)生目的蛋白。Sambrook等人在《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》中(1989，第二版，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室)描述了可用于原核和真核宿主的、合適的克隆及表達(dá)載體。
通過(guò)向載體中插入增強(qiáng)子序列，可以提高高等真核生物細(xì)胞對(duì)編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，一般約10至300bp，它作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子的例子有復(fù)制起點(diǎn)上游100至270bp的SV40增強(qiáng)子、多形瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子。
一般地，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和篩選標(biāo)記基因(如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和啤酒糖酵母的TRP1基因)，以及從高度表達(dá)的基因中得到、能夠指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子可以從編碼糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白等的操縱子中得到。異源序列以恰當(dāng)?shù)姆绞脚c翻譯起始序列及終止序列裝配。優(yōu)選地，與能夠指導(dǎo)蛋白向細(xì)胞周質(zhì)或細(xì)胞外培養(yǎng)基分泌的前導(dǎo)序列裝配。異源序列可以編碼含有N-末端識(shí)別肽的融合蛋白，該識(shí)別肽具有理想的特征，如穩(wěn)定表達(dá)的重組產(chǎn)物或者簡(jiǎn)化純化步驟。
將編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)基因，合適的翻譯起始和終止信號(hào)，以及有功能的啟動(dòng)子一起插入，可以構(gòu)建適用于細(xì)菌的表達(dá)載體。所說(shuō)載體包含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記和一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，以維持載體并在必要時(shí)在宿主中擴(kuò)增載體。適合轉(zhuǎn)化的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的多個(gè)種。
作為代表性但非限制性的例子，用于細(xì)菌的表達(dá)載體可以含有源自市售載體的選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)，這些市售載體包含公知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件。這樣的市售載體包括，pKK223-3(Pharmacia Fine化學(xué)品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國(guó))。這些pBR322“骨架”部分與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列相結(jié)合。
轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株，待其生長(zhǎng)至合適的細(xì)胞密度后，用恰當(dāng)?shù)姆椒?例如溫度變換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間。常用離心法收獲細(xì)胞，用物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞，保留得到的粗產(chǎn)物以進(jìn)一步純化?？梢杂萌我环N常規(guī)的方法破碎微生物細(xì)胞，所述方法包括凍融法、超聲處理、機(jī)械破碎或使用細(xì)胞裂解劑，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子有由Gluzman(細(xì)胞，23175(1981))描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系和能夠表達(dá)相容載體的其它細(xì)胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包含復(fù)制起點(diǎn)、適合的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。從SV40病毒基因組中得到的DNA序列，如SV40復(fù)制起點(diǎn)、早期啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、剪接及多聚腺苷酸化位點(diǎn)可用來(lái)提供所需要的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。
可以用多種方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的多肽，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、植物凝集素層析和高效液相色譜層析(HPLC)。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的，或是化學(xué)合成的，或是用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如細(xì)菌、酵母、高等植物、培養(yǎng)的昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)制備的。根據(jù)重組方法中使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本發(fā)明的多肽也可以包含一個(gè)起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以用作人類疾病的治療和診斷的研究試劑和材料。Fwa116具有抑制炎癥的作用，可以被用于治療心血管炎癥性動(dòng)脈粥樣硬化疾病，如腦中風(fēng)、冠心病、心絞痛和心肌梗塞。還可以被用于防治腫瘤。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了鑒定本發(fā)明多肽興奮劑或拮抗劑的方法。方法之一是在某種化合物存在的情況下，將表達(dá)Fwa116受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或膜制劑與Fwa116多肽一起培養(yǎng)，檢測(cè)該化合物增強(qiáng)或阻斷Fwa116多肽與受體相互作用后產(chǎn)生第二信使的能力。第二信使系統(tǒng)包括但不限于蛋白酪氨酸激酶系統(tǒng)(PTK)、cAMP、鳥苷酸環(huán)化酶、離子通道或磷酸肌醇水解作用。鑒定多肽拮抗劑的另一種方法是競(jìng)爭(zhēng)抑制法。該法將某化合物不存在時(shí)，與受體結(jié)合的Fwa116多肽分子數(shù)設(shè)為對(duì)照，通過(guò)檢測(cè)該化合物存在時(shí)，與受體結(jié)合的Fwa116多肽分子數(shù)的變化來(lái)確定潛在的拮抗劑。
潛在的拮抗劑包括抗體，或者在某些情況下包括與本發(fā)明多肽結(jié)合的寡肽，它們與所述多肽結(jié)合并有效地消除其功能。
另一個(gè)潛在的拮抗劑化合物是用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建體。通過(guò)三股螺旋形成反義DNA或RNA從而控制基因的表達(dá)，上述方法均基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，可以依據(jù)編碼本發(fā)明成熟多肽的核酸序列5’端，設(shè)計(jì)長(zhǎng)約10至40個(gè)堿基對(duì)的反義RNA。又如設(shè)計(jì)一種與轉(zhuǎn)錄涉及的基因區(qū)互補(bǔ)的DNA(三螺旋-參見Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學(xué)，241456，(1988)；和Dervan等，科學(xué)，2511360(1991))，從而阻止轉(zhuǎn)錄以及本發(fā)明多肽的產(chǎn)生。反義RNA在體內(nèi)和mRNA雜交，并阻斷mRNA分子翻譯成為本發(fā)明的多肽(反義-Okano，J.神經(jīng)化學(xué)雜志，56560(1991)；作為基因表達(dá)反義抑制劑的脫氧寡核苷酸(CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))?？梢詫⑸鲜龉押塑账醾魉椭良?xì)胞，從而在體內(nèi)表達(dá)反義RNA和DNA以抑制本發(fā)明多肽的產(chǎn)生。
拮抗劑還包括一些小分子，這些小分子通過(guò)與本發(fā)明的多肽結(jié)合而阻止多肽與其受體的相互作用，從而阻斷其正常的生物活性。小分子包括但不限于小肽或類肽分子。
本發(fā)明的多肽、其興奮劑和拮抗劑可以與合適的載體結(jié)合形成藥物組合物。這樣的組合物包含治療有效量的多肽和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。載體包括但不限于鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及上述物質(zhì)的組合。其配方應(yīng)與給藥的方式相宜。
本發(fā)明還提供了一種藥物包裝或試劑盒，其內(nèi)裝有一個(gè)或多個(gè)容器，容器內(nèi)裝有本發(fā)明藥物組合物的一種或多種組分。與之同時(shí)提供的可以是經(jīng)政府藥物管理機(jī)構(gòu)審核的、有關(guān)藥品或生物制品制造、使用及銷售的信息。本發(fā)明的藥物組合物還可以與其它的治療化合物結(jié)合使用。
藥物組合物可以按常規(guī)方式給藥，如口服、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或真皮內(nèi)途徑。以治療和/或預(yù)防特定疾病有效的劑量施用藥物組合物。通常以至少大約10微克/千克體重的量給藥。在大多數(shù)情況下，以不超過(guò)每天約8毫克/千克體重的量給藥。在大多數(shù)情況之下，考慮到用藥途徑和癥狀等因素，給藥劑量從每日大約10微克/千克到1毫克/千克體重。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，可以通過(guò)在體內(nèi)表達(dá)的方式使用本發(fā)明的多肽及其激活劑和拮抗劑，這種方式常被稱作“基因治療”。
因此，可以在體外用編碼本發(fā)明多肽的核酸(DNA或者RNA)對(duì)患者細(xì)胞進(jìn)行基因工程化處理，再將工程化的細(xì)胞提供給需要治療的患者。上述方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，可以用含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程化處理。
類似的，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法在體內(nèi)基因工程化細(xì)胞，以便在體內(nèi)表達(dá)多肽。例如，用含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞，以使其能夠產(chǎn)生含有目的基因的感染性病毒顆粒。將這種生產(chǎn)細(xì)胞用于患者，從而在體內(nèi)工程化細(xì)胞并表達(dá)所說(shuō)的多肽。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，通過(guò)上述方法或其它方式施用本發(fā)明的多肽對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
可以得到逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于莫洛尼氏(Moloney)鼠白血病病毒、脾壞死病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒如勞氏(Rous)肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、長(zhǎng)臂猿白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳房腫瘤病毒。
所述載體包含一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子?？墒褂玫暮线m啟動(dòng)子包括但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV 40啟動(dòng)子；人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(Miller等，生物技術(shù)，Vol.7，No.9，980-990(1989)描述)；或其它啟動(dòng)子(例如真核細(xì)胞啟動(dòng)子，包括但不限于組蛋白、pol III和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。其它可采用的病毒啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子、胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子和β19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。通過(guò)本文的教導(dǎo)，選擇載體上合適的啟動(dòng)子對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列應(yīng)當(dāng)有合適的啟動(dòng)子控制?？梢允褂玫暮线m的啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子(如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子)；或者異源啟動(dòng)子(如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子)；呼吸合胞體病毒(RSV)啟動(dòng)子；可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(如MMT啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子)；熱休克啟動(dòng)子；清蛋白啟動(dòng)子；ApoAI啟動(dòng)子；人類珠蛋白啟動(dòng)子；病毒胸苷激酶啟動(dòng)子(如單純皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子)；反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(包括上文描述的修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs)；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和人類生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。啟動(dòng)子也可以是編碼所述多肽的基因的天然啟動(dòng)子。
可以用反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞以產(chǎn)生生產(chǎn)細(xì)胞?？杀晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DNA細(xì)胞系(Miller、人類基因治療，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部?jī)?nèi)容本文-并參考)。載體可以用任何本領(lǐng)域已知的方法轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。這些方法包括但不限于電穿孔、使用脂質(zhì)體和CaPO4沉淀。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以包埋在脂質(zhì)體中，或者偶聯(lián)到脂類上，然后引入宿主中。
生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，該顆粒包含能夠編碼所述多肽的核酸序列?？梢杂眠@些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼所述多肽的核酸序列?？梢员晦D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于胚胎莖干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞、以及造血莖干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及Fwa116基因在診斷或檢測(cè)中的用途，通過(guò)檢測(cè)Fwa116核酸序列中的突變可以診斷出相關(guān)疾病或?qū)膊〉囊赘行浴?br>可以用多種技術(shù)在DNA水平上檢測(cè)出攜帶Fwa116基因突變的個(gè)體?？梢詮幕颊叩募?xì)胞，如來(lái)自血液，尿，唾液，活組織檢查和尸體解剖材料的細(xì)胞?；蚪MDNA可以直接用于檢測(cè)，或者在分析前可以用PCR擴(kuò)增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或cDNA也可用于相同目的。例如，與本發(fā)明多核苷酸互補(bǔ)的PCR引物可于鑒別和分析突變。如通過(guò)與正常的基因型相比較，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小改變來(lái)檢測(cè)缺失及插入?？梢越?jīng)與可以用放射性標(biāo)記的RNA或反義DNA與擴(kuò)增后的核酸序列雜交，以鑒別點(diǎn)突變。用RNaseA消化或通過(guò)解鏈溫度的差異，可以辨別完全配對(duì)序列和錯(cuò)配的雙鏈。
通過(guò)DNA測(cè)序可以直接揭示對(duì)照基因和攜帶突變基因之間的序列差異。此外，克隆的DNA片段可以作為探針檢測(cè)特異的DNA區(qū)段。當(dāng)與PCR結(jié)合使用時(shí)，這種方法的靈敏性大大提高，例如，將測(cè)序引物和雙鏈PCR產(chǎn)物、或者由改良的PCR法產(chǎn)生的單鏈模板分子一起使用。常規(guī)的自動(dòng)測(cè)序法用放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記來(lái)確定核酸序列。
基于DNA序列差異的遺傳試驗(yàn)可以通過(guò)檢測(cè)在含有或不含變性劑的凝膠中，DNA片段電泳遷移率的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝膠電泳顯示。不同序列的DNA片段可以在變性甲酰胺梯度凝膠上進(jìn)行區(qū)分，根據(jù)其特定的熔點(diǎn)或部分解鏈溫度，不同的DNA片段將停滯在凝膠的不同位置(參見Myers等，科學(xué)，2301242(1985))。
用RNase和S1保護(hù)的核酸酶保護(hù)分析法或化學(xué)裂解法也可以檢測(cè)特殊位置上的序列變化，(如Cotton等，PNAS，美國(guó)，854397-4401(1985))。
因此，可以用雜交、核糖核酸酶保護(hù)、化學(xué)裂解、直接DNA測(cè)序、或使用限制酶(如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP))和基因組DNA的Southern印跡法來(lái)檢測(cè)DNA序列的差異。
除了更常規(guī)的凝膠電泳和DNA測(cè)序之外，突變也可以用原位分析法檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明涉及一種通過(guò)檢測(cè)不同組織中Fwa116多肽含量的改變而進(jìn)行的診斷分析方法。這是基于與正常對(duì)照組織相比，某組織中該多肽的過(guò)量表達(dá)可以檢測(cè)疾病或疾病易感性的存在。檢測(cè)取自宿主的樣品中本發(fā)明多肽之含量的分析方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，方法包括放射免疫測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定、Western印跡分析、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定和“夾心”測(cè)定，優(yōu)選ELISA檢測(cè)。ELISA測(cè)定包括首先制備本發(fā)明多肽的特異性抗體，優(yōu)選單克隆抗體。然后制備該單克隆抗體的報(bào)導(dǎo)抗體。將報(bào)導(dǎo)抗體與一種可檢測(cè)試劑相結(jié)合，所說(shuō)試劑如放射性試劑、熒光試劑或者辣根過(guò)氧化物酶。從宿主取樣，并將其在與樣品中蛋白質(zhì)結(jié)合的固體支持物(如聚苯乙烯皿)中溫育。通過(guò)和非特異性蛋白質(zhì)(如牛血清清蛋白)一起溫育，將覆蓋皿中任何自由的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。接下來(lái)，在單克隆抗體和結(jié)合到聚苯乙烯皿上的本發(fā)明任何多肽結(jié)合期間，將單克隆抗體在皿中溫育。用緩沖液將所有未結(jié)合的單克隆抗體洗掉。此時(shí)，將和辣根過(guò)氧化物酶連接的受體抗體放入皿中，結(jié)果導(dǎo)致受體抗體和任何結(jié)合到本發(fā)明多肽上的單克隆抗體結(jié)合。然后將未結(jié)合的單克隆抗體洗掉。接著向皿中加入過(guò)氧化物酶底物，和標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，在給定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的顏色的量即是給定體積的患者樣品中存在的蛋白質(zhì)的量。
也可以用競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法檢測(cè)多肽含量。方法包括將Fwa116多肽的特異性抗體結(jié)合到固相支持物上，然后標(biāo)記(如放射性標(biāo)記)本發(fā)明的多肽，將取自宿主的樣品通過(guò)固相支持物，然后通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記量，確定樣品競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗體的量，從而確定樣品中本發(fā)明多肽的含量。
本發(fā)明的多核苷酸序列對(duì)染色體的鑒別也極有價(jià)值。該序列特異性地靶向于人染色體的特定位置，并與之雜交。目前，僅有少數(shù)幾種基于實(shí)際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多形性)的染色體標(biāo)識(shí)試劑可用于標(biāo)記染色的體位置?；诒景l(fā)明DNA的染色體作圖是將這些序列和疾病相關(guān)基因關(guān)聯(lián)的首要的步驟。
簡(jiǎn)言之，通過(guò)由cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)可以進(jìn)行序列的染色體定位。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析基因的3’非翻譯區(qū)，可以快速選擇引物。引物不應(yīng)跨越基因組DNA的第一個(gè)外顯子，否則將使擴(kuò)增復(fù)雜化。然后，將引物用于PCR以篩選含有單個(gè)的人染色體的體細(xì)胞雜和體。只有含有與該引物相應(yīng)的基因的雜和體才會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜合體的PCR作圖是將特定DNA定位于特定染色體的快捷方法。根據(jù)本發(fā)明，用相同的寡核苷酸引物和來(lái)自特定染色體或大基因組克隆的一組片段，依照類似方法可以完成亞定位。可以用于染色體作圖的其它作圖方法包括原位雜交、用標(biāo)記的、經(jīng)流式分選的染色體進(jìn)行預(yù)篩選以及用雜交進(jìn)行預(yù)篩選，從而構(gòu)建染色體特異性的cDNA文庫(kù)。
cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以實(shí)現(xiàn)更精確的染色體位置。該技術(shù)可以采用50或60個(gè)堿基長(zhǎng)短的cDNA。詳見Verma等人的綜述，人類染色體基本技術(shù)手冊(cè)，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦完成了基因在染色體上的精確定位，則可以將該基因在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)聯(lián)系起來(lái)。這些數(shù)據(jù)可以在例如V.McKusick，人類孟德爾式遺傳中找到(可通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)在Johns Hopkins大學(xué)的Welch醫(yī)學(xué)文庫(kù)中得到)。然后通過(guò)連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳)，確定基因與已定位到染色體相同區(qū)域的疾病之間的關(guān)系。
隨后需要確定患病個(gè)體和正常個(gè)體之間cDNA或者基因組序列的差異。如果在部分或全部患病個(gè)體中觀察到突變，但在正常個(gè)體中觀察不到，則所述突變可能是疾病的病因。
所說(shuō)的多肽、其片段、其衍生物或類似物，或表達(dá)上述物質(zhì)的細(xì)胞可用作免疫原而產(chǎn)生抗體?？贵w可以是多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合的、單鏈和人源化的抗體，以及Fab片段或Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。本領(lǐng)域已知的多種方法均可用于產(chǎn)生這些抗體和片段。
通過(guò)向動(dòng)物體(優(yōu)選非人體)直接注射或者施用本發(fā)明的多肽可以獲得相應(yīng)的抗體。這樣獲得的抗體會(huì)與所述多肽結(jié)合。這樣，即使是編碼多肽片段的序列也可以產(chǎn)生能夠結(jié)合整個(gè)天然多肽的抗體。進(jìn)而用這種抗體從表達(dá)該多肽的組織中分離多肽。
為了制備單克隆抗體，可以采用任何一種通過(guò)連續(xù)的細(xì)胞系培養(yǎng)而生產(chǎn)抗體的技術(shù)。例如雜交瘤技術(shù)(Kohler和Milstein，1975，自然，256495-497)、三體雜交瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，今日免疫學(xué)，472)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，等，1985，單克隆抗體和癌癌癥治療，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
可以將所述生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利4,946,778)加以改進(jìn)，以生產(chǎn)抗本發(fā)明多肽(具免疫原性)的單鏈抗體。也可以用轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)抗本發(fā)明多肽(具免疫原性)的人源化抗體。
為了更清楚地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，現(xiàn)參照下列附圖和實(shí)施例對(duì)其進(jìn)行解釋。附圖和實(shí)施例是為了說(shuō)明而不以任何方式限制本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示了Fwa116在正常組織的分布。β-actin作對(duì)照。其中A、Fwa116；B、B-actin。
圖2顯示了Fwa116在不同腫瘤細(xì)胞株中的分布。其中A、Fwa116；B、β-actin。
圖3顯示了氧化低密度脂蛋白和金雀異黃素濃度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Fwa116的影響。A、反應(yīng)結(jié)果；B、上樣量。
圖4顯示了Fwa116在正常、亞急性心衰和慢性心衰動(dòng)物主動(dòng)脈中的表達(dá)情況。A、正常動(dòng)物主動(dòng)脈；B、亞急性心衰動(dòng)物主動(dòng)脈；C、慢性心衰動(dòng)物主動(dòng)脈。
圖5顯示了Fwa116在正常、亞急性心衰和慢性心衰動(dòng)物心臟血管中的表達(dá)情況。A、正常動(dòng)物心臟血管；B、亞急性心衰動(dòng)物心臟血管；C、慢性心衰動(dòng)物心臟血管。
圖6顯示了Fwa116在人正常心肌組織和急性心肌梗塞室壁瘤組織中的表達(dá)情況。A、人正常心肌組織；B、人急性心肌梗塞室壁瘤組織。
圖7顯示了過(guò)度表達(dá)Fwa116基因誘發(fā)ECV304細(xì)胞增殖的情況。
實(shí)施例實(shí)施例一、成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)的構(gòu)建1.1RNA的提取RNA gentsTotal RNA Isolation System kit購(gòu)自美國(guó)Promega公司(CatNo.Z5110)。操作如下稱取0.3g液氮中保存的成人主動(dòng)脈組織，加入10ml變性液(4M異硫氰酸胍、25mM檸檬酸三鈉)和1ml 2M乙酸鈉(pH4.0)勻漿。加入等體積水飽和酚和0.2倍體積氯仿，劇烈振蕩15秒，冰上放置15分鐘。10000rpm，4℃離心20分鐘。取上清，加等體積異丙醇，-20℃放置2小時(shí)，離心。再用變性液5ml懸浮沉淀，重復(fù)上述步驟。用1ml冰預(yù)冷的75％乙醇洗滌沉淀，室溫下蒸發(fā)痕量乙醇5-10分鐘，用焦碳酸二乙脂(diethyl pyrocarbonate，以下簡(jiǎn)稱DEPC)處理的去離子水溶解RNA。
1.2mRNA的分離成熟的mRNA的3′端有一條由20-250個(gè)腺苷酸組成的Poly(A)。根據(jù)該特征，可用親和層析法分離mRNA和其它的RNA。本實(shí)驗(yàn)使用的oligo(dT)纖維素含有12-18個(gè)核苷酸(T)的多聚鏈。在多鹽條件下，帶有oligo(A)尾巴的mRNA與oligo(dT)結(jié)合并留在柱子上，而無(wú)oligo(A)尾巴的rRNA與tRNA被洗掉，然后用低鹽液洗脫掛在柱子上的mRNA。
Quick prepmicro mRNA purification kit購(gòu)自瑞典Pharmacia公司。在1.5ml無(wú)RNA酶的離心管1#內(nèi)加入1ml oligo(dT)纖維素懸液；另取1.5ml離心管2#，加入用上樣緩沖液稀釋的總RNA 1ml；管2#和管2#室溫離心1分鐘，12,000rpm；吸去管1#上清，將管2#的上清加入管1#，輕搖5-10分鐘；室溫離心10秒，12,000rpm；用1ml高鹽緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA，0.5M NaCl)洗滌5次，離心；用1ml低鹽緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA，0.1M NaCl)洗滌5次，離心；用0.3ml低鹽緩沖液懸浮oligo(dT)沉淀并轉(zhuǎn)移到微量離心柱，12，000rpm，離心5秒；用0.5ml低鹽緩沖液洗滌3次，離心；用2×0.2ml洗脫液收集mRNA；用分光光度計(jì)測(cè)定光密度，計(jì)算OD260/280的比值；得到300μl mRNA，加入7.5μl糖原，30μl 2.5M乙酸鉀(pH5.0)，750μl無(wú)水乙醇在-70℃保存?zhèn)溆?；使用前離心5分鐘，75％乙醇洗滌，DEPC水溶解mRNA。
1.3cDNA的合成合成步驟參照Z(yǔ)AP ExpressTmcDNA Synthesis Kit*and ZAP ExpressTmcDNAGigapackII Gold Cloning Kit*(美國(guó)Stregene公司，Catalog No.200403和200404)的說(shuō)明書。
在0.5ml離心管中依次加入5μl10×第一鏈緩沖液，3μl甲基化的dNTP混合物，2μl Xho I連接子oligo(dT)18引物(1.4μg/μl)，32.5μl用DEPC處理的去離子水，1μlRNA酶抑制劑(40u/μl)，5μg mRNA，置室溫10分鐘。再加入1.5μl莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶(50u/μl)，總反應(yīng)體積50μl。從中取出5μl轉(zhuǎn)入另一離心管，加入0.5μl α-32P三磷酸脫氧腺苷(dATP)(800ci/mmol)以鑒定第一鏈合成質(zhì)量。上述反應(yīng)均在37℃進(jìn)行。
得到的DNA/RNA雜交分子在DNA聚合酶I的作用下，以第一鏈為模板合成第二鏈。在冰浴中依次加入45μl第一鏈cDNA，20μl 10X第二鏈緩沖液，6μl dNTP混合物，114μl去離子水，2μl[α-32p]dATP(800ci/mmol)，2μl RNA酶H(1.5u/μl)，1μl DNA聚合酶I(9.0u/μl)，總體積200μl。混勻，16℃孵育2.5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用酚∶氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀。
1.4cDNA與載體的連接從試劑盒中取出9μl EcoRI連接子(序列分別為5’-AATTCGGCACGAG-3′和3’-GCCGTGCTC-5’)溶解沉淀。取1μl電泳，鑒定第一和第二鏈合成質(zhì)量。在剩余的8μl第二鏈cDNA中依次加入1μl 10X連接酶緩沖液，1μl 10mmol/Lγ-三磷酸腺苷(γ-ATP)，1μl T4DNA連接酶(4u/μl)，8℃水浴16小時(shí)后，70℃孵育30分鐘。用限制酶XhoI消化1.5小時(shí)。瓊脂糖凝膠(Sepharose)Cl-2B過(guò)柱分離，除去小于400堿基的核苷酸，以提高全長(zhǎng)cDNA在cDNA文庫(kù)中的比例。
1.5cDNA克隆入ZAP噬菌體載體ZAP噬菌體載體(美國(guó)Stratagene公司)上的多克隆位點(diǎn)允許插入長(zhǎng)達(dá)10Kb的核酸片段，進(jìn)入宿主后質(zhì)粒部分可從載體上切開，形成質(zhì)粒載體Bluescript。該載體多克隆位點(diǎn)兩側(cè)有T7和T3噬菌體的啟動(dòng)子，可以用于序列分析和探針合成。插入載體的cDNA片段可以表達(dá)具抗原性和生物活性的融合蛋白。實(shí)驗(yàn)詳述如下在離心管內(nèi)加入100ng cDNA，0.5μl 10X連接酶緩沖液，0.5μl 10mmol/L γ-ATP(pH7.5)，1ul ZAP噬菌體載體(1ug/ul)，0.5ul T4DNA連接酶(4u/ul)，加去離子水至總體積5μl。12℃連接16小時(shí)。
連接產(chǎn)物需包裝外殼蛋白以產(chǎn)生有轉(zhuǎn)染活性的重組噬菌體?？焖?gòu)?70℃取出包裝蛋白，溶解后，在25ul包裝蛋白內(nèi)加1ul連接反應(yīng)物，混勻，22℃反應(yīng)2小時(shí)，加入500ul SM緩沖液(0.1M NaCl，0.08M MgSO4.7H2O，0.05M Tris-HCl，0.01％明膠)，20ul氯仿。此混合物即為原始的cDNA文庫(kù)。
1.6計(jì)算陽(yáng)性克隆的效價(jià)取5ul原始的cDNA文庫(kù)，用45ul SM緩沖液稀釋。將10ul稀釋后的溶液，加入200ul感受態(tài)XL1-Blue MRF′宿主菌中(OD600＝0.5)。37℃水浴20-30分鐘，加入3ml上層瓊脂糖，混勻，鋪于NZY(0.09M NaCl，0.08M MgSO4.7H2O，0.5％酵母提取液，1％NZY)平板上，倒置，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)算平板上的克隆數(shù)。
cDNA文庫(kù)的效價(jià)用噬菌斑成斑數(shù)(pfu/ml)表示。pfu/ml＝(噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù))×1000/稀釋液用量(ul)。容量大于1×106個(gè)克隆的cDNA文庫(kù)，能夠保證其中含有每一個(gè)單拷貝的mRNA.本發(fā)明成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)的庫(kù)容量為2.4×106個(gè)獨(dú)立重組克隆。
1.7cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增和保存構(gòu)建的cDNA文庫(kù)可直接用于篩選，但不穩(wěn)定。因?yàn)榉且吧偷氖删w易失活，故需要擴(kuò)增以方便多次篩選。取5×104個(gè)噬菌體轉(zhuǎn)染XL1-Blue MRF′宿主菌，鋪板，37℃孵育8-10小時(shí)，然后在150mm平皿中加入8ml SM緩沖液，4℃培養(yǎng)過(guò)夜。離心，收集上清，即得到擴(kuò)增后的cDNA文庫(kù)。加入0.3％氯仿，4℃保存。長(zhǎng)期保存需加入7％的二甲基亞砜(DMSO)，-70℃凍存。
實(shí)施例二、新全長(zhǎng)cDNA的克隆2.1隨機(jī)克隆的多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增cDNA文庫(kù)鋪盤，噬菌斑密度為200-500個(gè)克隆/培養(yǎng)皿(150mm)，挑取清亮的單個(gè)噬菌斑轉(zhuǎn)入含有75ul SM緩沖液和5ul氯仿的無(wú)菌離心管中，置于4℃。用前混勻離心，取上清液5ul，用ZAP噬菌體載體3′端引物(5′CCAAGCTCGAAATTAACCCTCAC 3′)和5′端引物(5′CAGTCAATTGTAATACGACTCACT 3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體積50ul。擴(kuò)增參數(shù)為94℃預(yù)變性3分鐘；再94℃45秒，55℃30秒，72℃3分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5-10分鐘。根據(jù)1％瓊脂糖凝膠中電泳帶的亮度估算PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。
2.2表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的序列測(cè)定ABI377自動(dòng)測(cè)序儀(ABI PRISMTM377DNA sequencer)和自動(dòng)測(cè)序試劑盒(BigDyeTMTerminator Ready Reaction Mix)購(gòu)自美國(guó)PE公司。依照推薦的使用條件，用雙脫氧鏈終止法測(cè)序。
用非放射性CY5熒光素(CY5-fluoroscein)作標(biāo)記物，通用測(cè)序引物T3(5′ATTAAC CCT CAC TAA AGG GA 3′)和T7(5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG3′)進(jìn)行測(cè)序，每份樣品中引物用量為5pmol/ul。測(cè)序模板為PCR產(chǎn)物，用量約30-100ng。PCR擴(kuò)增參數(shù)為94℃3-5分鐘；再94℃30秒，50℃15秒，72℃1分鐘，20個(gè)循環(huán)；94℃30秒，72℃1分鐘，15個(gè)循環(huán)；再72℃延伸5分鐘。DNA產(chǎn)物在8mol/L尿素、6％聚丙烯酰胺凝膠板上電泳。電壓1500V，功率34W，電泳250-300分鐘(ALF ExpressTMDNA sequence，瑞典Pharmacia公司)。
2.3EST的生物信息學(xué)分析用美國(guó)生物信息中心的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將每個(gè)cDNA克隆的EST與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).根據(jù)BLAST的判斷標(biāo)準(zhǔn)(國(guó)內(nèi)外大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的通用標(biāo)準(zhǔn))同源序列小于100-200個(gè)堿基，Score值小于100的序列為新的EST。
本發(fā)明Fwa116的EST為新EST。
2.4EST引物步移法測(cè)序2.4.1ZAP噬菌體的體內(nèi)環(huán)化ZAP噬菌體載體能將目的片段在宿主內(nèi)直接從λ噬菌體載體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒，環(huán)化為PBK-CMV(帶有CMV病毒早期啟動(dòng)子)噬菌粒。環(huán)化步驟參照說(shuō)明書(ZAPExpress cDNA Synthesis kit and ZAP Express cDNA GigapacktmGold Doning kit)。
用3ul保存在4℃攜帶新EST的噬菌體和1ul輔助噬菌體(一類自身復(fù)制能力極低的噬菌體突變體，可以為寄主細(xì)胞中質(zhì)粒DNA的復(fù)制與包裝提供蛋白酶和外殼蛋白質(zhì))共轉(zhuǎn)染300ul大腸桿菌XL1-BlueMRF’株(OD600＝1.0)。獲得單鏈DNA后，再轉(zhuǎn)染大腸桿菌XLOLR株(試劑盒提供)，在試管內(nèi)加5ml LB培養(yǎng)液，25ul卡那霉素，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。
2.4.2質(zhì)粒的提取和鑒定用德國(guó)QIAGEN公司的“QIAPrep Spin Miniprep kit″提取質(zhì)粒。2400rpm，4℃離心10分鐘，收集過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌。棄上清，加入25ul緩沖液P1(100ul/ml RNaseA，50mM Tris/HCl，10mM EDTA，pH8.0)懸浮細(xì)菌，移至滅菌的1.5ml離心管內(nèi)。加250ul緩沖液P2(200mM NaOH，1％SDS)，顛倒上清幾次，充分混勻。加350ul緩沖液P3(3.0M KAc，pH5.5)，立刻搖管4-6次。12000rpm，離心10分鐘(SORVALLMc12V臺(tái)式離心機(jī))。收集上清，將其移至底部套有收集管的微型純化柱(QLA prepSpin Miniprep)內(nèi)，12000rpm，離心30-60秒。加0.75ul緩沖液TE(10mM Tris/HCl，lmM EDTA，pH8.0)，離心30-60秒。去掉收集管，在QLAprep微型純化柱底部套一個(gè)滅菌的離心管，加50ul緩沖液EB(10mM Tris-HCl pH8.5)或去離子水，在柱床內(nèi)保留1分鐘后離心1分鐘，收集純化的DNA。
在離心管內(nèi)加入3ul酶切緩沖液(10×)，1ul NotI內(nèi)切酶(15u/ul)，1ul ECoRI內(nèi)切酶(15u/ul)，1ul BSA，2ul DNA，22ul去離子水，總體積30ul。37℃溫育4-6小時(shí)。酶切后鑒定質(zhì)粒大小。
2.4.3新的全長(zhǎng)cDNA的測(cè)定用美國(guó)PE公司的ABI 377自動(dòng)測(cè)序儀和測(cè)序試劑盒BigDyeTMTerminator ReadyReaction Mix測(cè)定PBK-CMV陽(yáng)性克隆的序列。
反應(yīng)液中有BD 4ul，BOB 2ul(400mM Tris-HCl，pH9.0，10mM MgCl2)，引物2ul(5pmol/ul)，DNA模板30-100ng，用H2O補(bǔ)足至終體積20ul。用步移法(逐級(jí)引物法)測(cè)定cDNA全長(zhǎng)序列，即下一輪的測(cè)序引物由上輪測(cè)序所得產(chǎn)物的末端堿基確定。用oligo 14.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物。
結(jié)果如SEQ ID NO1所示，F(xiàn)wa116 cDNA全長(zhǎng)2546個(gè)堿基對(duì)。根據(jù)kozak規(guī)律，推測(cè)其起始密碼子為1002至1004位核苷酸(ATG)。終止密碼子為2259至2261位核苷酸(TGA)，其開放讀碼框架為1002至2261位核苷酸。BLAST分析的結(jié)果表明該基因定位于17號(hào)染色體。
蛋白同源性分析顯示Fwa116成熟多肽與cdk5激活劑結(jié)合蛋白C53蛋白的同源性為70％。推測(cè)的Fwa116蛋白由409個(gè)氨基酸組成。其序列特征為(A)從148至151Aa(NYTV)為N-糖基化位點(diǎn)。(B)從405至408Aa(KRYS)為cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶位點(diǎn)。(C)從13至18Aa GVSWAE)，157至162Aa(GTEPSV)，193至198Aa(GTDSGI)，204至209Aa(GIDWGI)，222至227(GIDWGD)為豆蔻?；稽c(diǎn)。(D)從41至43Aa(SLK)，57至59Aa(SRK)，77至79Aa(SCK)，339至341Aa(SPR)，404至406Aa(SKR)，408至410Aa(SGR)為蛋白激酶C位點(diǎn)。(E)從15至18Aa(SWAE)，57至60Aa(SRKE)，113至116Aa(SLGE)，131至134Aa(SPTE)，150至153Aa(TVYE)，156至159Aa(TGTE)，161至164Aa(SVVE)，235至238Aa(TVLE)，255至258(TLLE)，316至319(SVLE)為酪蛋白激酶II位點(diǎn)。(F)270至291Aa(LMELEIF，LAQRAVE，LSEEADVL)及277至298Aa(LAQRAVE，LSEEADV，LSVSQFQL)為亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例三、Fwa116在正常組織的分布3.1實(shí)驗(yàn)材料含12種組織mRNA的多組織膜(MTN膜)購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，用其檢測(cè)Fwa116基因在正常組織中的分布。β-actin是一種管家基因，在多種組織中表達(dá)均一，本實(shí)驗(yàn)中用作對(duì)照。
3.2Northern雜交方法參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(盧圣棟主編，中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，第二版，1999)147-149，202-205，207-213頁(yè)。詳述如下3.2.1總RNA提取稱取0.5g正常成人心臟組織于50ml離心管中，加入10ml GTC，勻漿。加等體積水飽和酚及0.2體積氯仿，劇烈振蕩15秒，冰上放置20分鐘。4℃，12000rpm離心25分鐘。取上清置于另一離心管，加等體積異丙醇，-20℃沉淀1小時(shí)。4℃12000rpm離心25分鐘，棄上清。用5ml GTC重新溶解沉淀后，重復(fù)其它操作。用1ml預(yù)冷的75％乙醇洗滌，晾干，用DEPC處理過(guò)的水溶解。測(cè)OD(光密度)260及OD280。
3.2.2甲醛變性凝膠電泳稱取0.6g瓊脂糖凝膠加入52.2ml DEPC處理過(guò)的水中，加熱溶解，待膠冷到65℃，加入6.0ml 10×MOPS，1.8ml甲醛，灌膠。取4.5ul(40-60ug)總RNA，加入2.0ul 10×MOPS，3.5ul甲醛，10ul甲酰胺，混勻，65℃變性15分鐘，冰上冷卻2分鐘。加入2.0ul上樣緩沖液，混勻。50伏預(yù)電泳5分鐘，上樣。待染料全部進(jìn)入膠后，電壓降為40伏，每10分鐘混合電泳緩沖液1次。
3.2.3轉(zhuǎn)膜待溴酚蘭泳動(dòng)到凝膠底部，停止電泳，照相。用DEPC處理過(guò)的水洗膠數(shù)次，用50mM NaOH處理45分鐘，用20×SSC處理45分鐘。尼龍膜先用去離子水浸濕，再用20×SSC處理45分鐘。在膠托上鋪一層濾紙，用20×SSC浸濕，除去氣泡；將膠倒置于膠托上，其上面放一中間挖空的塑料薄片。小心將膜置于膠上，除去氣泡，在膜上鋪兩張20×SSC浸濕的濾紙，除去氣泡。在濾紙上鋪上10cm高的吸水紙，壓一500克的重物。轉(zhuǎn)膜16小時(shí)，中間換吸水紙2-3次。小心取下膜，照相，用6×SSC泡膜5分鐘。紫外交聯(lián)，80℃烤膜1小時(shí)，4℃保存?zhèn)溆谩?br>3.2.4制備雜交模板上游引物5’-C GTCGACGCTCTTCACCACCACAAAGGATG-3’，斜體所示為保護(hù)堿基，黑體所示為SalI酶切位點(diǎn)，劃線部分與Fwa116核酸序列982-1001位互補(bǔ)；下游引物5’-AA GCGGCCGCTGTCACAGAGAGGTTCCCATCA-3’，斜體所示為保護(hù)堿基，黑體所示為NotI酶切位點(diǎn)，劃線部分與Fwa116核酸序列2242-2263位互補(bǔ)。
PCR反應(yīng)體系10倍緩沖液5.0ul，脫氧核糖核酸2.0ul，上游、下游引物各3.0ul，Taq酶1.0ul，F(xiàn)wa116測(cè)序質(zhì)粒(模板)2.0ul，無(wú)菌水34ul。PCR參數(shù)94℃預(yù)變性3分鐘94℃ 3分鐘，94℃ 20秒，60℃ 30秒，72℃ 80秒，30個(gè)循環(huán)。72℃ 7分鐘。用醋酸銨/乙醇(1∶5)純化PCR產(chǎn)物，溶于50ul TE，用瓊脂糖定量，將其稀釋至25ng/μl。
3.2.5雜交標(biāo)記探針在0.5ml離心管中加入PCR產(chǎn)物(在98℃加熱4分鐘變性，冰上冷卻2分鐘)25ng，5×標(biāo)記緩沖液10ul，dNTP(無(wú)dCTP)2.0ul，BSA 2.0ul，Klenow酶1.0ul，[α-32P]dCTP 5.0ul，用無(wú)核酸酶的水補(bǔ)至總體積50ul。室溫反應(yīng)1-3小時(shí)。
預(yù)雜交將膜用6×SSC浸5分鐘，貼于雜交管壁，除去氣泡。加入6ml購(gòu)于Clontech的雜交液，68℃ 1小時(shí)。
雜交倒掉雜交液，加入預(yù)熱的雜交液6ml，加入探針(探針需在98℃加熱4分鐘變性，冰上冷卻2分鐘)，68℃ 3小時(shí)。
洗膜先用200ml洗液I(2×SSC，0.05％ SDS)在室溫洗膜四次，每次10分鐘。再用200ml洗液II(0.1×SSC，0.1％ SDS)在50℃洗20分鐘，56℃洗20分鐘。
壓片用濾紙吸去液體，用保鮮膜包好，貼于一張與X光片相同大小的濾紙上，壓片。-70℃曝光適當(dāng)時(shí)間。洗片。
結(jié)果如圖1所示，F(xiàn)wa116基因廣泛分布于各種組織，上面的帶為3.4kb轉(zhuǎn)錄本，下面的為1.8kb轉(zhuǎn)錄本。3.4kb轉(zhuǎn)錄本在肝臟，外周血白細(xì)胞中高表達(dá)，1.8kb轉(zhuǎn)錄本在心臟，骨骼肌，腎臟，肝臟中相對(duì)高表達(dá)。
實(shí)施例四、Fwa116基因在不同腫瘤細(xì)胞株中的分布4.1實(shí)驗(yàn)材料含8種腫瘤細(xì)胞系的mRNA的雜交膜購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，用其檢測(cè)Fwa116基因在不同腫瘤細(xì)胞株中的分布。β-actin作為本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。
4.2Northern雜交參見實(shí)施例3.2。
結(jié)果如圖2所示β-actin在若干種腫瘤組織中的表達(dá)水平均-(圖2B)；在所檢查的8種腫瘤細(xì)胞株中，均表達(dá)Fwa116基因，最高的三種依次為成淋巴白血病細(xì)胞株，Burkitt’s淋巴瘤Raji株和早幼粒白血病。
實(shí)例五、氧化低密度脂蛋白對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Fwa116的影響氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的分子危險(xiǎn)因素，可誘發(fā)多種基因表達(dá)，造成血管內(nèi)皮損害及炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)擬研究ox-LDL與人血管內(nèi)皮細(xì)胞中Fwa116表達(dá)的關(guān)系。
5.1氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的制備采用密度梯度離心，獲取密度在1.019-1.063之間的低密度脂蛋白(LDL)，用Cu2+氧化24小時(shí)，0.22um濾膜過(guò)濾，4℃避光保存。測(cè)TBARS值并進(jìn)行瓊脂糖電泳，TBARS值大于10nmol/mg以及電泳遷移率增加表明氧化成功。
5.2人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)將人血管內(nèi)皮細(xì)胞凍存管從液氮中取出，迅速放入37℃水浴，待其完全融化，將細(xì)胞懸液接種于25cm培養(yǎng)瓶中。瓶?jī)?nèi)預(yù)先加入5ml含10％FES的RPMI或DMEM。37℃，CO2濃度5％，孵育箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，次日更換培養(yǎng)液。
5.3傳代培養(yǎng)待細(xì)胞生長(zhǎng)至基本融合覆蓋率約為80％)時(shí)，棄原培養(yǎng)液，用1×PBS(pH7.4)沖洗細(xì)胞表面2次，加入0.125％胰蛋白酶，37℃消化5-10分鐘。顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓并有部分漂浮時(shí)，加入少許含10％FBS的培養(yǎng)液終止消化。并用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞表面，收集消化液，1000rpm離心30秒，棄上清，加入含10％FBS的培養(yǎng)液吹打?；靹颍〕?.1ml用1×PBS稀釋至1.0ml，計(jì)數(shù)，按每毫升100，000個(gè)細(xì)胞將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，瓶?jī)?nèi)預(yù)先加入5ml含10％FBS的RPMI或DMEM。37℃，CO2濃度為5％，孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。按此法將細(xì)胞傳3代至所需數(shù)量。待細(xì)胞生長(zhǎng)至基本融合(覆蓋率約為80％)，棄原培養(yǎng)液，換成含0.4％FBS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時(shí)，使細(xì)胞處于生長(zhǎng)靜止期。
5.4 ox-LDL與大豆金雀異黃素刺激細(xì)胞用200ug/ml濃度的ox-LDL分別刺激細(xì)胞12小時(shí)，18小時(shí)，36小時(shí)。12小時(shí)，同時(shí)加入大豆金雀異黃素至終濃度為100uM。37℃，CO2濃度為5％，孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，留取上清后，GTC收獲細(xì)胞。收集3瓶細(xì)胞，備作Northern雜交。
5.5Northern雜交收集上述步驟的細(xì)胞3瓶。其余步驟參見實(shí)施例3.2。
結(jié)果如圖3所示，ox-LDL可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞Fwa116的表達(dá)。ox-LDL與抗氧化劑大豆金雀異黃素同時(shí)作用于細(xì)胞后，F(xiàn)wa116表達(dá)增高10倍以上。
上述結(jié)果提示氧化低密度脂蛋白誘發(fā)的Fwa116表達(dá)是氧化低密度脂蛋白引起的抗氧化代償反應(yīng)，F(xiàn)wa116可能是一個(gè)抗氧化因子。大豆金雀異黃素的抗氧化作用，對(duì)動(dòng)脈硬化的保護(hù)作用可能是通過(guò)上調(diào)Fwa116基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，使Fwa116產(chǎn)物上調(diào)有可能保護(hù)血管，對(duì)抗動(dòng)脈硬化的一些危險(xiǎn)因素。
實(shí)施例六、Fwa116基因在正常、慢性心衰和亞急性心衰動(dòng)物心臟中的表達(dá)6.1慢性心衰模型的建立50只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(250-300克/只)購(gòu)自本院動(dòng)物房。標(biāo)準(zhǔn)塊料由北京動(dòng)物中心提供，飲水為自來(lái)水，水與飼料由動(dòng)物隨意攝取。
稱重，根據(jù)體重以氯胺酮和安定腹腔內(nèi)注射全麻大鼠。行氣管內(nèi)插管并接小型動(dòng)物呼吸機(jī)。在心電監(jiān)護(hù)儀的監(jiān)護(hù)下左側(cè)開胸，以6-10手術(shù)縫線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，關(guān)胸。以心電監(jiān)護(hù)儀上有明顯ST段升高為結(jié)扎成功的標(biāo)志。待其蘇醒后撤除呼吸機(jī)。術(shù)后飼養(yǎng)條件同術(shù)前，50天后模型即建成。
6.2亞急性心衰模型的建立10只雄性Wistar大鼠(250克/只)購(gòu)自解放軍301醫(yī)院，飼養(yǎng)條件同慢性心衰模型。
腹腔注射去甲腎上腺素30mg/日/只，連續(xù)注射4天，第5天模型即可以使用。
6.3RNA-RNA原位雜交原位雜交技術(shù)基子堿基互補(bǔ)的原理，通過(guò)探針特異性地與細(xì)胞內(nèi)特定的mRNA或DNA雜交，而顯現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)的基因及表達(dá)產(chǎn)物。該反應(yīng)靈敏度極高，而且可檢測(cè)出組織分化過(guò)程中僅瞬間表達(dá)的基因。雜交試劑盒DIG RNA Labeling kit(Cat.No.1175025)購(gòu)自德國(guó)Boehringer Mannheim公司。
6.3.1探針制各特異引物PCR，將200-300bp的Fwa116核酸片段(1371至1632位核苷酸)克隆入T Vector。重組質(zhì)粒擴(kuò)增后純化；用T7和SP6引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用特異引物和載體T7和SP6引物PCR確定基因插入方向，測(cè)序(mRNA和Anti-mRNA)。加T7 RNA聚合酶合成反義探針，SP6 RNA聚合酶正義探針(檢查雜交系統(tǒng)的可靠性)。
6.3.2探針標(biāo)記先用酚/氯仿抽提被轉(zhuǎn)錄的線形DNA，再用酒精沉淀。將無(wú)RNA酶的離心管置冰上，向管內(nèi)加入1μl純化的線性DNA，2μl NTP標(biāo)記混合液，2μl 10×轉(zhuǎn)錄緩沖液，1μl RNA酶抑制劑，2μl(40U)SP6或T7TNA聚合酶，共20μl。混勻，稍加離心，加入20u不含RNA的DNA酶I，37℃ 15分鐘。加入2μl 0.2mol/L EDTA(pH8.0)以終止聚合反應(yīng)。
在上述物質(zhì)中加入2.5μl 4mol/L LiCl、和75μl酒精(-20℃)的充分混勻，-70℃放置至少30分鐘(或-20℃放置至少2h)。12,000rpm離心，70％冷乙醇洗滌，干燥后。加100μl DEPC水和20u RNase，37℃靜置30分鐘后分裝，-20℃保存。
6.3.3玻片處理及標(biāo)本制備徹底清洗玻片，高壓消毒30分鐘，將玻片在含有多聚賴氨酸(0.01％)的溶液中浸蘸幾下，干燥，4℃?zhèn)溆谩?br>取鼠主動(dòng)脈和心臟血管(正常、亞急性心衰和慢性心衰動(dòng)物模型)制作新鮮標(biāo)本，0.4cm×0.4cm，用1×PBS沖洗兩次，置于冰凍切片機(jī)固定頭上。行8-10um切片，置有1mg/ml多聚賴氨酸的載玻片上晾干，4％多聚甲醛固定15-20分鐘。1×PBS沖冼2次，每次5分鐘。
6.3.4雜交前處理用0.2N HCl浸泡25分鐘。0.3％的Triton X-100浸泡5分鐘。用1×PBS洗兩次，每次5分鐘。用4％的多聚甲醛后固定6分鐘。用1×PBS洗兩次，每次5分鐘。在1000ml 0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0)溶液中加入5ml乙酸酐，待其完全溶解將切片置于10分鐘。以上反應(yīng)在室溫進(jìn)行。
6.3.5雜交反應(yīng)雜交液含有5ml去離子甲酰胺，2.5ml 20×SSC，500ul 100×Denhardt’s液(10g聚蔗糖，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清白蛋白，500ml消毒雙蒸水)，500ul10％SDS，100ul 10mg/ml變性的鯡魚精子DNA，400ul經(jīng)DEPC處理的水。
將切片從乙?；芤褐袚瞥?，用濾紙吸干標(biāo)本四周液體，用在標(biāo)本周圍畫一小圈。加預(yù)雜交液30ul在小圈內(nèi)，濕盒內(nèi)42℃溫育2小時(shí)。甩去預(yù)雜交液，用25ul雜交液覆蓋Parafilm膜，濕盒內(nèi)42℃溫育16小時(shí)，封閉濕盒。
6.3.6雜交后處理將玻片從溫盒取出，去掉Parafilm膜。2×SSC室溫沖洗三次，每次10分鐘。1×SSC室溫沖洗三次，每次10分鐘。0.1×SSC沖洗15分鐘，兩次，50℃。
若本底過(guò)高，則將玻片置于含20μg/ml RNA酶的溶液(0.5mol/L NaCl，10mmol/L Tris Cl，pH8.0)中，37℃消化30分鐘。再用不含RNA酶的溶液37℃沖洗30分鐘，洗膜。
6.3.7顯色反應(yīng)玻片浸泡于清洗液(1M順丁烯二酸，0.15M NaCl；0.3％(V/V)Tween-20)。在100ml封閉液(試劑盒中的阻斷劑按10％(W/V)加入順丁烯二酸緩沖液(0.1mol/L順丁烯二酸，0.15mol/L NaCl)，使用時(shí)1∶10稀釋)中溫育30分鐘。加20ml抗體溶液，溫育30分鐘。用100ml清洗液洗兩次，每次15分鐘。加20ml檢測(cè)液(0.1MTris-HCl，0.1M NaCl，pH9.5)平衡2-5分鐘。在10ml新配制的顯色液(10ml檢測(cè)液中加200ul NBT/BCIP)中溫育，避光，勿搖動(dòng)。用消毒雙蒸水或TE沖洗。
結(jié)果如圖4和5所示，正常大鼠心臟血管及主動(dòng)脈內(nèi)皮表達(dá)Fwa116基因(圖4A，5A)，但較低。在亞急性心衰模型，心臟血管及主動(dòng)脈內(nèi)皮均高表達(dá)Fwa116基因(圖4B，5B)。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，造成室壁瘤-慢性心衰模型大鼠，主動(dòng)脈及心臟血管高表達(dá)Fwa116基因(圖4C，5C)。
實(shí)例七、免疫組織化學(xué)分析7.1實(shí)驗(yàn)材料人急性心肌梗塞并發(fā)癥室壁瘤組織。
7.2免疫組織化學(xué)分析用重組正確的原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染E.coli B121感受態(tài)細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，經(jīng)10％變性聚丙烯酰胺電泳，確定目的基因條帶，選用超聲和電洗脫法，從包涵體中獲取融合蛋白經(jīng)Western印跡鑒定目的蛋白后，免疫動(dòng)物獲得的血清即為本實(shí)驗(yàn)的一抗。
石蠟切片5微米，貼附于包被有多聚賴氨酸的APES玻片上，75℃烤片2小時(shí)。二甲苯脫蠟后經(jīng)梯度酒精后切片入水。3％H2O2內(nèi)10分鐘。蒸餾水洗三遍，放入EDTA抗原修復(fù)液內(nèi)(pH8.0)，置微波爐中烘烤(96℃-98℃)10分鐘。室溫冷卻20-30分鐘，蒸餾水洗三遍。入1×PBS緩沖液5分鐘。10％正常兔血清20分鐘。加適當(dāng)稀釋的一抗，4℃內(nèi)孵育過(guò)夜。1×PBS洗三次后，加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫10分鐘。1×PBS洗三次，加酶聯(lián)鏈霉親和素三抗，室溫10分鐘。1×PBS洗三次，DAB顯色。蒸餾水三次，蘇木素淺染胞核、脫水、封片。
結(jié)果如圖6所示，人急性心肌梗塞室壁瘤組織血管內(nèi)皮高表達(dá)Fwa116基因。
實(shí)施例八、過(guò)度表達(dá)Fwa116基因誘發(fā)ECV304細(xì)胞增殖8.1實(shí)驗(yàn)材料ECV304細(xì)胞株(購(gòu)自ATCC)8.2細(xì)胞培養(yǎng)與Fwa116基因轉(zhuǎn)染8.2.1ECV304細(xì)胞培養(yǎng)6孔培養(yǎng)皿板，每個(gè)孔5×105個(gè)細(xì)胞，在0.5ml RPMI1640培養(yǎng)液(GIBCO)及10％胎牛血清中。
8.2.2 Fwa116基因轉(zhuǎn)染Fwa116基因開放讀碼框架被構(gòu)建到pcDNA3.1/Myc-His(-)A(CLONTECH)載體上。細(xì)胞生長(zhǎng)20小時(shí)后，按照Clonfectin試劑盒(CLONTECH，美國(guó))的方法把攜帶Fwa116基因的載體導(dǎo)入ECV304細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用G418(200μg/ml)挑選穩(wěn)定表達(dá)Fwa116基因的克隆?？蛰d體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照。用Northern blot選出表達(dá)Fwa116基因最高的克隆，繁殖，用以觀察細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。穩(wěn)定并高表達(dá)的Fwa116基因的克隆細(xì)胞被接種到24孔培養(yǎng)板。以含有10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液來(lái)哺育細(xì)胞。每48小時(shí)換液一次。每24小時(shí)從每組取3個(gè)孔進(jìn)行以蛋白酶消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。
胰蛋白酶消化方法倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用1XPBS洗細(xì)胞2次(0.5ml/cm2培養(yǎng)皿)，加入含0.125％胰蛋白酶的1XPBS消化細(xì)胞5分鐘，反復(fù)用吸管吹打，混勻。然后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
細(xì)胞計(jì)數(shù)方法將細(xì)胞滴入血球計(jì)數(shù)板內(nèi)，放置在光學(xué)顯微鏡(Nikon日本)上數(shù)細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)的計(jì)算公式為細(xì)胞數(shù)的計(jì)算公式為細(xì)胞數(shù)/毫升＝4大格細(xì)胞數(shù)/4×10,000×稀釋倍數(shù)結(jié)果細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果(×104)
如圖7所示，從第四天開始，高表達(dá)Fwa116基因的細(xì)胞增殖比空載體對(duì)照細(xì)胞增高2倍。(P＜0.05)實(shí)施例九、細(xì)胞存活(MTT)試驗(yàn)將ECV304細(xì)胞5000/孔培養(yǎng)在96孔板中，分別于接種后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)，用20μl MTT(5ng/ml，Sigma)染色，用美國(guó)Bio-Rad酶標(biāo)儀于490nm處進(jìn)行觀察，著色細(xì)胞為存活細(xì)胞。
結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見下表
均數(shù)±SD，n＝3*與對(duì)照組(轉(zhuǎn)空載體克隆)比較P＜0.05如圖8所示，高表達(dá)Fwa116基因的細(xì)胞比空載體對(duì)照細(xì)胞增殖明顯。
本發(fā)明并不限于上述具體的實(shí)施例，實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的某些方面。功能上等同的方法和物質(zhì)已包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實(shí)上，根據(jù)本文的描述和附圖，基于本發(fā)明的各種改變對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。這樣的改變已包括在本發(fā)明權(quán)利要求
的范圍內(nèi)。
SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院<120>炎性抑制因子Fwa116<130>PD0202028<150>CN01109262.9<151>2001-02-28<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2546<212>DNA<213>成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)<400>1ggcacgagct gaagcggaag tggaggaaag atggaggacc atcagcacgt gcccatcgac 60atccagacca gcaagctgct cgattggctg gtggacagaa ggcactgcag cctgaaatgg 120cagagtctgg tgctgacgat ccgcgagaag atcaatgctg ccatccagga catgccagag 180agcgaagaga tcgcccagct gctgtctggg tcctacattc actactttca ctgcctaaga 240atcctggacc ttctcaaagg cacagaggcc tccacgaaga atatttttgg ccgatactct 300tcacagcgga tgaaggattg gcaggagatt atagctctgt atgagaagga caacacctac 360ttaggtaaag tggcccggcc tgggagccct ggtatccatg gggaagccca ctctcagagt 420tctgagatac caggcttata ggaggcacag tctgtgagtg ggaagagact ggagtgtaga 480tgttgcccat ttgtaggtgg taaaatcaat tgtttttgat ggaattgatt ttccctgagt 540ggagtgctgg gggaaggagg aggtccaggc cggtagtggc cattcgccgt gcctcagcga 600gcaggtgtgt gtgggtcctc caccactcac ctcttggtta gcgggagtgt gctgccccca 660cccccacccc cgcaccccca ttctacacaa ggcagaagag gcacgggttt tcctgggagc 720gaatatcaag tgcctgagag caactacagg actaactgtg tttgggttgg gtgtagtata 780aataataata atggctaata tttcctgagc atctactaaa tgcaaggaat tgtgcttggt 840
gtgtcatgtg gattctctct tgcatcttca tgataaatgt tattgtcgct gttttaccga 900tgagggttgg attagagggg ttaaacaact tgtcttaggc tccacagctg ggaacaagtg 960gggctgggaa gctgacttcg tgctcttcac caccacaaag gatgtgtgtg catcctgggg 1020catgcctgcc tcatgtgggg gtgtcctggg ctgaatttcc tgggcacttc tcagtggaac 1080tctctagcct cctggttcgg aatgtcaact atgagatccc ctcactgaag aagcagattg 1140ccaagtgcca gcagctgcag caagaataca gccgcaagga ggaggagtgc caggcagggg 1200ctgccgagat gcgggagcag ttctaccact cctgcaagca gtatggcatc acgggcgaaa 1260atgtccgagg agaactgctg gccctggtga aggacctgcc gagtcagctg gctgagattg 1320gggcagcggc tcagcagtcc ctgggggaag ccattgacgt gtaccaggcg tctgtggggt 1380ttgtgtgtga gagccccaca gagcaggtgt tgccaatgct gcggttcgtg cagaagcggg 1440gaaactcaac ggtgtacgag tggaggacag ggacagagcc ctctgtggtg gaacgacccc 1500acctcgagga gcttcctgag caggtggcag aagatgcgat tgactggggc gactttgggg 1560tagaggcagt gtctgagggg actgactctg gcatctctgc cgaggctgct ggaatcgact 1620ggggcatctt cccggaatca gattcaaagg atcctggagg tgatgggata gactggggag 1680acgatgctgt tgctttgcag atcacagtgc tggaagcagg aacccaggct ccagaaggtg 1740ttgccagggg cccagatgcc ctgacactgc ttgaatacac tgagacccgg aatcagttcc 1800ttgatgagct catggagctt gagatcttct tagcccagag agcagtggag ttgagtgagg 1860aggcagatgt cctgtctgtg agccagttcc agctggctcc agccatcctg cagggccaga 1920ccaaagagaa gatggttacc atggtgtcag tgctggagga tctgattggc aagcttacca 1980gtcttcagct gcaacacctg tttatgatcc tggcctcacc aaggtatgtg gaccgagtga 2040ctgaattcct ccagcaaaag ctgaagcagt cccagctgct ggctttgaag aaagagctga 2100tggtgcagaa gcagcaggag gcacttgagg agcaggcggc tctggagcct aagctggacc 2160tgctactgga gaagaccaag gagctgcaga agctgattga agctgacatc tccaagaggt 2220acagcgggcg ccctgtgaac ctgatgggaa cctctctgtg acaccctccg tgttcttgcc 2280tgcccatctt ctccgctttt gggatgaaga tgatagccag ggctgttgtt ttggggcctt 2340
tcaaggcaaa agaccaggct gactggaaga tggaaagcca caggaaggaa gcggcacctg 2400atggtgatct tggcactctc catgttctct acaagaagct gtggtgattg gccctgtggt 2460ctaccaggcg aaaaccacag attctccttc tagttagtat agcggactta ataaaagagg 2520aaaaaacaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2546<210>2<211>419<212>PRT<213>成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)<400>2Met Cys Val His Pro Gly Ala Cys Leu Pro His Val Gly Val Ser Thr1 5 10 15Ala Glu Phe Pro Gly His Phe Ser Val Glu Leu Ser Set Leu Leu Val20 25 30Arg Asn Val Asn Thr Glu Ile Pro Ser Leu Lys Lys Gln Ile Ala Lys35 40 45Cys Gln Gln Leu Gln Gln Glu Thr Ser Arg Lys Glu Glu Glu Cys Gln50 55 60Ala Gly Ala Ala Glu Met Arg Glu Gln Phe Thr His Ser Cys Lys Gln65 70 75 80Thr Gly Ile Thr Gly Glu Asn Val Arg Gly Glu Leu Leu Ala Leu Val85 90 95Lys Asp Leu Pro Ser Gln Leu Ala Glu Ile Gly Ala Ala Ala Gln Gln100 105 110Ser Leu Gly Glu Ala Ile Asp Val Thr Gln Ala Ser Val Gly Phe Val115 120 125
Cys Glu Ser Pro Thr Glu Gln Val Leu Pro Met Leu Arg Phe Val Gln130 135 140Lys Arg Gly Asn Ser Thr Val Thr Glu Thr Arg Thr Gly Thr Glu Pro145 150 155 160Ser Val Val Glu Arg Pro His Leu Glu Glu Leu Pro Glu Gln Val Ala165 170 175Glu Asp Ala Ile Asp Thr Gly Asp Phe Gly Val Glu Ala Val Ser Glu180 185 190Gly Thr Asp Ser Gly Ile Ser Ala Glu Ala Ala Gly Ile Asp Thr Gly195 200 205Ile Phe Pro Glu Ser Asp Ser Lys Asp Pro Gly Gly Asp Gly Ile Asp210 215 220Thr Gly Asp Asp Ala Val Ala Leu Gln Ile Thr Val Leu Glu Ala Gly225 230 235 240Thr Gln Ala Pro Glu Gly Val Ala Arg Gly Pro Asp Ala Leu Thr Leu245 250 255Leu Glu Thr Thr Glu Thr Arg Asn Gln Phe Leu Asp Glu Leu Met Glu260 265 270Leu Glu Ile Phe Leu Ala Gln Arg Ala Val Glu Leu Ser Glu Glu Ala275 280 285Asp Val Leu Ser Val Ser Gln Phe Gln Leu Ala Pro Ala Ile Leu Gln290 295 300Gly Gln Thr Lys Glu Lys Met Val Thr Met Val Ser Val Leu Glu Asp305 310 315 320Leu Ile Gly Lys Leu Thr Ser Leu Gln Leu Gln His Leu Phe Met Ile
325 330 335Leu Ala Ser Pro Arg Thr Val Asp Arg Val Thr Glu Phe Leu Gln Gln340 345 350Lys Leu Lys Gln Ser Gln Leu Leu Ala Leu Lys Lys Glu Leu Met Val355 360 365Gln Lys Gln Gln Glu Ala Leu Glu Glu Gln Ala Ala Leu Glu Pro Lys370 375 380Leu Asp Leu Leu Leu Glu Lys Thr Lys Glu Leu Gln Lys Leu Ile Glu385 390 395 400Ala Asp Ile Ser Lys Arg Thr Ser Gly Arg Pro Val Asn Leu Met Gly405 410 415Thr Ser Leu
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，所說(shuō)的多核苷酸為SEQ ID NO1所示序列中從1002至2261位的核苷酸。
2.一種載體，所說(shuō)的載體包含權(quán)利要求
1的多核苷酸。
3.一種宿主細(xì)胞，所說(shuō)的宿主細(xì)胞由權(quán)利要求
2的載體轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染過(guò)。
專利摘要
本發(fā)明公開了炎性抑制因子Fwa116多肽和編碼這種多肽的多核苷酸。本發(fā)明也公開了用重組技術(shù)生產(chǎn)Fwa116多肽的方法和針對(duì)這種多肽的抗體和拮抗劑。本發(fā)明還公開了含有Fwa116多肽的藥物組合物以及Fwa116在治療腦中風(fēng)、冠心病、心絞痛、心肌梗塞等心血管炎癥性動(dòng)脈粥樣硬化疾病和防治腫瘤方面的用途。本發(fā)明還提供了通過(guò)檢測(cè)樣品中Fwa116核酸序列中的突變，或者Fwa116多肽含量及Fwa116基因產(chǎn)物自身抗體水平的改變而進(jìn)行診斷和測(cè)定的方法。本發(fā)明的炎性抑制因子是人類來(lái)源的。
文檔編號(hào)C07K14/47GKCN1232642SQ02805510
公開日2005年12月21日 申請(qǐng)日期2002年2月28日
發(fā)明者惠汝太, 陳敬洲, 劉寶華, 劉玉清, 張銀輝 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan