專利名稱:抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY及其組合制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY及其制備方法，特別是涉及用于預(yù)防和治療非典型肺炎的多種組合的復(fù)合IgY及其制備方法和組合制劑。
目前世界上治療非典型肺炎(SARS)的方法主要是使用抗病毒藥物[如Ribavirin(三氮唑核苷)等]和糖皮質(zhì)激素以及抗生素或中草藥。目前，全世界尚無真正對病毒有確切療效的化學(xué)藥物，而且普遍存在嚴(yán)重的副作用。加拿大衛(wèi)生部根據(jù)加拿大與美國疾病控制及預(yù)防中心專家的臨床經(jīng)驗，以及Ribavirin(三氮唑核苷)對引發(fā)疾病的冠狀病毒無效的測試，加上不少嚴(yán)重的藥物反應(yīng)報告，已于2003年5月1日宣布停止使用Ribavirin(三氮唑核苷)。使用糖皮質(zhì)激素會使人體的免疫系統(tǒng)受損，大劑量使用糖皮質(zhì)激素往往是導(dǎo)致病人最后對藥物毫無反應(yīng)，最后無藥可救而死亡的主要原因。中草藥對非典型肺炎(SARS)只有調(diào)理作用，很難有確切有效的治療效果。
IgY(Immunoglobulin of Yoik)屬IgG類免疫球蛋白，能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合，從而抑制或改變了該抗原(為某些細(xì)菌或病毒)的狀態(tài)或活性，并通過調(diào)理作用，促進分葉核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞對細(xì)菌或病毒的吞噬；它能與病毒結(jié)合，改變病毒表面的構(gòu)象，阻止病毒吸附于易感細(xì)胞，同時，形成的病毒-IgY免疫復(fù)合物會被巨噬細(xì)胞吞噬。
由于IgY能夠特異性與病原體結(jié)合并將其有效抑制，就可以克服抗病毒化學(xué)藥物對病毒實際殺滅作用不大、而對人體毒副作用又十分明顯的致命缺點，從而達到有的放矢地從發(fā)病根源上預(yù)防和治療由變異的冠狀病毒這種病原體引發(fā)的非典型肺炎(SARS)的目的。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種直接抑制非典型肺炎(SARS)主要致病病毒的特異性IgY及其制備方法；本發(fā)明的目的還在于提供一種由可直接抑制非典型肺炎(SARS)主要致病病毒的特異性IgY制成的天然安全又具有特效作用的、預(yù)防和治療非典型肺炎(SARS)的新型組合制劑。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的(1)優(yōu)選引致非典型肺炎(SARS)的主要致病病毒根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的確認(rèn)，冠狀病毒的一個變種是引發(fā)非典型肺炎(SARS)的病原體。但是，在抽取含有冠狀病毒的樣本進行基因分析中發(fā)現(xiàn)，這種病毒變異速度快，僅香港就已發(fā)現(xiàn)4種非典型肺炎(SARS)冠狀病毒的病源。本發(fā)明根據(jù)基因圖譜分析不同國家和地區(qū)的非典型肺炎(SARS)冠狀病毒的基因排序的結(jié)果，按大致相似的原則進行分類組合，選取有明顯差異的幾種非典型肺炎(SARS)冠狀病毒作為代表性的主要致病病毒?，F(xiàn)優(yōu)選香港的4種不同的非典型肺炎(SARS)冠狀病毒以及北京傳播的和加拿大傳播的共6種非典型肺炎(SARS)冠狀病毒作為代表性的非典型肺炎(SARS)病原體。今后，隨著這種冠狀病毒在人傳人的過程中不斷變異，以及對這種冠狀病毒基因排序組合工作的進一步完善和深入，可以及時調(diào)整和變更代表性的非典型肺炎(SARS)的病原體組合。另外，也可以按照不同國家和地區(qū)編組，選取不同的SARS冠狀病毒組合，如香港組(若干型組成)、北京組(若干型組成)、加拿大組(若干型組成)等等。
(2)非典型肺炎(SARS)致病病毒特殊復(fù)合抗原的制備本發(fā)明以香港組為例。將VeroE6細(xì)胞接種于10％FCS DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞終濃度1×105/ml。將15ml上述培養(yǎng)液置于100ml培養(yǎng)瓶中，將此培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞。然后棄掉培養(yǎng)液，將收集到的香港地區(qū)4種不同的SARS冠狀病毒毒株用2％FCS和1％青鏈霉素DMEM培養(yǎng)液稀釋至100 TCID 50/ml。取此稀釋液10ml加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并將此細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，待細(xì)胞病變達++++時收獲病毒。收獲病毒時將培養(yǎng)瓶凍融三次，收集培養(yǎng)上清，放入高速離心機中，以15000rpm轉(zhuǎn)速離心分離，收集上清。再加入甲醛至0.1％的終濃度，在37℃溫度下，經(jīng)過24小時分別滅活這4種培養(yǎng)的SARS病毒。培養(yǎng)好的滅活病毒在4℃或-20℃保存。然后，將培養(yǎng)好的香港地區(qū)4種不同的SARS冠狀病毒按1∶1∶1∶1的比例或其他適當(dāng)比例混合，再按1∶1比例或其他適當(dāng)比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機中以10000～30000rpm轉(zhuǎn)速高速粉碎勻化，通過高速攪拌形成油包水溶液，即制成非典型肺炎(SARS)致病病毒的含多種不同型的全病毒的特殊復(fù)合抗原。
(3)制備免疫蛋應(yīng)用本公司已申請的專利技術(shù)(專利申請?zhí)?0101270.3和021021244.9)，將采用上述方法制備的非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原，分別對產(chǎn)蛋母雞進行免疫；每隔二周再強化注射一次，計免疫三次；第一次免疫20天后，檢取免疫后的母雞所產(chǎn)免疫蛋，并對應(yīng)不同的抗原，對所檢取的免疫蛋進行編碼標(biāo)記。
以上免疫方法和注射頻率可根據(jù)實際情況適當(dāng)調(diào)整和變化；也可應(yīng)用上述同樣的免疫技術(shù)，采用上述抗原，分別對產(chǎn)蛋母鴨或產(chǎn)蛋母鵝或產(chǎn)蛋火雞或產(chǎn)蛋鴕鳥等不同產(chǎn)蛋禽類進行免疫，得到相應(yīng)的免疫蛋。
(4)抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY粗提物的制備首先根據(jù)被免疫的禽類不同以及免疫所用抗原不同，將免疫蛋分類并標(biāo)記編碼，用流動水洗凈免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋機將檢取的免疫蛋打碎，用蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻，測量所得的蛋黃的體積，按此體積的4-6倍加入蒸餾水，進行稀釋并混合均勻，用NaOH溶液調(diào)整pH至5.5-6.0之間；將調(diào)整好pH值的稀釋液進一步充分?jǐn)嚢杈鶆颍缓髮⑵淅鋮s至2-6℃，靜置12小時-24小時；將稀釋液加入高速離心分離機中，離心分離20分鐘；將分離所得的上清再加入超濾器中進行超濾并濃縮10-20倍，按0.1～0.3％的比例將海藻酸鈉加入濃縮后的漿料中，充分?jǐn)嚢?；再加入高速離心機中離心，取上清，去除脂蛋白；將離心分離后的漿料加入超濾機，過超微膜，進行過濾除菌；將過濾除菌后的產(chǎn)品用冷凍干燥機進行冷凍干燥，即制得抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY粗提物干粉成品；最后，將所制備的對應(yīng)不同抗原的特異性IgY粗提物進行編碼標(biāo)記。
(5)抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY的純化采用本公司已公開的專利技術(shù)(專利中請?zhí)?0101270.3，專利公開號1307061)分別過離子交換柱和凝膠交換柱對按以上工藝所制取的抗非典型肺炎(SARS)IgY粗提物進行純化，即得純IgY。
應(yīng)用SDS-PAGE電泳測定法，對按以上工藝所制取的抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY粗提物進行檢測，測得其中純IgY含量為50％以上。
(6)采用本發(fā)明人發(fā)明的特殊免疫激活方法和改進的工藝技術(shù)所制得的抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY參照常規(guī)“ELISA法”(酶聯(lián)免疫吸附試驗)進行活性檢測。
檢測結(jié)果顯示，抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY對香港4種代表性非典型肺炎(SARS)冠狀病毒的抗體結(jié)合效價都達到1∶512以上。
將用以上方法制備的抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY配以蒸餾水或生理鹽水調(diào)配成濃度0.01％以上的溶劑，制成一種新型霧化劑，加入各種霧化器中，經(jīng)過霧化后，供非典型肺炎患者吸入呼吸道和肺部產(chǎn)生作用，就可以有效抑制引起非典型肺炎的致病病毒，從而起著有效的治療作用。
將0.01-80％這種抗非典型肺炎特異性IgY配以99.99-20％的輔料，可制成各種臨床可接受的劑型，如霧化劑、鼻噴劑、滴鼻劑、噴喉劑、口噴劑、口含片等劑型，用于預(yù)防和治療非典型肺炎(SARS)。
作為預(yù)防用的劑型，這種抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY還可以2∶1或3∶1或其他適當(dāng)比例加入用本公司已公開的專利技術(shù)(專利申請?zhí)?0101270.3，專利公開號1307061)制備的抗齲齒菌IgY，制成一種新型的多功效特異性復(fù)合IgY。將這種多功效特異性復(fù)合IgY配以輔料制成噴霧劑或口含片，只要經(jīng)常使用這種噴霧劑噴口腔和咽喉部位，或者經(jīng)常含服這種新型口含片，就可以十分方便、輕松地既預(yù)防非典型肺炎(SARS)，又防止蛀牙、消除口腔炎癥和口臭，達到一舉多得的目的。
目前對非典型肺炎(SARS)無特效藥物，一般采用對癥治療和大量投服抗生素、廣譜抗病毒藥以及免疫抑制劑的糖皮質(zhì)激素。眾所周知，抗生素對病毒并沒有殺滅作用，廣譜抗病毒的抗生素的濫用反而破壞了人體的正常人“菌群平衡”，造成“菌群失調(diào)”。臨床實踐已證實，“菌群失調(diào)”不僅僅是疾病發(fā)生的結(jié)果，也是病毒感染性疾病的促進因素，反過來會使病情加重甚至惡化。免疫抑制劑和激素的大量使用，會直接造成患者免疫系統(tǒng)受損，使免疫機能愈治愈差，極易繼發(fā)細(xì)菌感染，最終更難治愈。
由于本發(fā)明制備的特異性IgY最大特點是直接針對非典型肺炎(SARS)的病原體發(fā)生特異性抑制作用，本發(fā)明又將實際應(yīng)用的劑型和施藥方式設(shè)計成直接施于病原體最集中的肺部和呼吸通道，因而作用直接、目標(biāo)準(zhǔn)確、治本斷源、效果顯著。同時，本發(fā)明從根本上改變了目前治療非典型肺炎(SARS)一般需要大量內(nèi)服療效并不確切的化學(xué)藥品和激素的狀況，避免損害患者的免疫機能，也克服了常規(guī)施藥方式要使大量化學(xué)藥物進入人體循環(huán)后才產(chǎn)生作用而會給人體帶來種種不良影響的弊病。
本發(fā)明所制備的抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY又是一種獨特的純天然生物制劑，使用十分安全，無任何毒副作用，由于它僅僅針對非典型肺炎的致病病原體直接作用，對有益菌都有很好的保護作用；同時，它完全不會誘發(fā)抗藥菌株的產(chǎn)生，也會象一般常規(guī)藥物那樣，將有益菌也和病原體一道殺滅而造成“菌群失調(diào)”；反過來，本發(fā)明的抗非典型肺炎(SARS)病原體的特異性IgY可以在肺炎和呼吸道構(gòu)建一種不易被病毒和致病菌感染的正常菌群生態(tài)，形成一道人體天然保護屏障，達到既治療又預(yù)防的雙重目的。另外，本發(fā)明所制備的特異性IgY是一種多克隆抗體，它可以對幾種不同的病原體都產(chǎn)生抑制作用，這一點對于非典型肺炎(SARS)的病原體一變異的冠狀病毒特別有意義。由于這種新型冠狀病毒特別容易變異，僅在香港目前已發(fā)現(xiàn)有4種之多；如果要研制疫苗，則需要有多種疫苗，才會真正達到有效控制的效果，這就大大增加了預(yù)防這種惡性傳染病的難度。
而本發(fā)明的特異性Ig不僅對直接作為抗原免疫的任意型的非典型肺炎(SARS)的變異冠狀病毒有效果；而且，由于高度保守的哺乳動物蛋白質(zhì)對種系發(fā)生學(xué)上距離較遠(yuǎn)的禽類有較強的免疫原性；因此，只要以某種抗原采用我公司發(fā)明的免疫激活專利技術(shù)(專利中請?zhí)?2121244.9)免疫禽類，所制得的特異性IgY，對凡是與該抗原有“共同抗原決定簇”的病原體都會有強烈的抑制活性。也就是說，既使冠狀病毒發(fā)生了一定的變異，實際上其重要部分是不會變的；本發(fā)明的特異性IgY仍然會針對其重要部分產(chǎn)生作用。因此，照樣會使發(fā)生了新變異的冠狀病毒受到抑制而失活。正因為采用本發(fā)明的方法制備的抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY具有特殊的廣譜抑制能力；所以，可以解決因這種新冠狀病毒變異特別快而給相關(guān)疫苗和新藥的研制帶來相當(dāng)大阻力的難題。
實驗例1將來自香港的4種不同的非典型肺炎(SARS)冠狀病毒依次編碼為香港1型、香港2型、香港3型、香港4型。香港1型冠狀病毒按上述技術(shù)內(nèi)容第2條的方法制作抗原，再用這種抗原免疫母雞，并采用本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容第6條的方法制備抗香港1型冠狀病毒特異性IgY。然后，以香港1型冠狀病毒為檢測抗原，用“ELISA法”(酶聯(lián)免疫吸附試驗)檢測所制得的抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY抗體結(jié)合效價。結(jié)果如下表


實驗例2分別以香港2型冠狀病毒、香港3型冠狀病毒、香港4型冠狀病毒為檢測用抗原，采用“ELISA法”(酶聯(lián)免疫吸附試驗)分別檢測抗香港1型冠狀病毒特異性IgY對這三種檢測抗原的抗體結(jié)合效價。結(jié)果如下表


從以上檢測結(jié)果看出，采用本發(fā)明的方法制取致病病毒抗原，又采用本發(fā)明的免疫激活方法免疫產(chǎn)蛋禽類和制備相應(yīng)的IgY，所制備的抗香港1型冠狀病毒特異性IgY具有理想的廣譜性，不僅如上實驗例1所表明的對直接免疫的香港1型冠狀病毒抗原有很強的抑制作用，所測的抗體結(jié)合效價相當(dāng)高(高達1∶1024)；對其他已發(fā)生變異的并沒有直接免疫的其他三種非典型肺炎(SARS)冠狀病毒也同樣有一定的抑制作用，所檢測到的抗體結(jié)合效價仍屬理想。
實驗例3以香港1型冠狀病毒、香港2型冠狀病毒、香港3型冠狀病毒、香港4型冠狀病毒按1∶1∶1∶1的比例混合均勻，再以本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容(2)的方法步驟制作復(fù)合抗原，并采用本發(fā)明的方法免疫母雞，制備抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY。然后用“ELISA法”(酶聯(lián)免疫吸附試驗)分別以香港1型冠狀病毒、香港2型冠狀病毒、香港3型冠狀病毒、香港4型冠狀病毒以及北京傳播的冠狀病毒作為檢測用抗原，檢測所制得的抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY對這5種不同抗原的抗體結(jié)合效價。檢測結(jié)果如下表




從以上結(jié)果可以看到，以本發(fā)明的方法用多種致病病毒制作含多種病毒成份的特殊復(fù)合抗原，再用這種特殊復(fù)合抗原，應(yīng)用本發(fā)明的免疫激活方法免疫產(chǎn)蛋禽類，所制備的抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY，廣譜性特別好，除了對作為抗原直接免疫的幾型非典型肺炎(SARS)冠狀病毒具有相當(dāng)高的抗體結(jié)合效價外，對沒有作為抗原直接免疫的同種不同型的非典型肺炎(SARS)冠狀病毒也有很好的抑制作用，達到相當(dāng)理想的效果。
實驗例4分別按照本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容(2)的方法制作非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原，然后分別用這種抗原免疫產(chǎn)蛋母雞、產(chǎn)蛋母鴨、產(chǎn)蛋母鵝、產(chǎn)蛋火雞以及產(chǎn)蛋鴕鳥。再分別采用本發(fā)明的方法制備得到(1)抗非典型肺炎(SARS)特異性雞IgY、(2)抗非典型肺炎(SARS)特異性鴨IgY、(3)抗非典型肺炎(SARS)特異性鵝IgY、(4)抗非典型肺炎(SARS)特異性火雞IgY、(5)抗非典型肺炎(SARS)特異性鴕鳥IgY。然后，采用“ELISA法”(酶聯(lián)免疫吸附試驗)分別以香港1型冠狀病毒、香港2型冠狀病毒、香港3型冠狀病毒、香港4型冠狀病毒為檢測抗原，檢測這三種抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY的抗體結(jié)合效價。結(jié)果如下表




從以上試驗結(jié)果可以看出，采用本發(fā)明的方法制作抗原，用免疫激活方法免疫母雞、母鴨、母鵝、產(chǎn)蛋火雞或產(chǎn)蛋鴕鳥，再采用本發(fā)明的方法分別制得抗非典型肺炎(SARS)特異性雞IgY、抗非典型肺炎(SARS)特異性鴨IgY、抗非典型肺炎(SARS)特異性鵝IgY、抗非典型肺炎(SARS)特異性火雞IgY、抗非典型肺炎(SARS)特異性鴕鳥IgY五種不同的IgY，雖然免疫的禽類不同，但是所制得的特異性IgY對引致非典型肺炎的幾種致病病毒都有很好的抑制效果。由于鴨IgY沒有Fc段，如果將鴨IgY制成注射用劑型，注射入人體內(nèi)，人體不易產(chǎn)生排斥反應(yīng)，這是鴨IgY最大的優(yōu)點。雖然免疫產(chǎn)蛋鴕鳥和產(chǎn)蛋火雞所制得的IgY抗體結(jié)合效價從檢測數(shù)據(jù)看稍微低了一些，但是，由于鴕鳥和火雞蛋個體特別大，每個免疫蛋所能提取得到的IgY比雞免疫蛋和鴨免疫蛋以及鵝免疫蛋都多得多，這點對于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，也是十分可取的。
實驗例5非典型肺炎(SARS)初發(fā)病患者使用以本發(fā)明的“抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY”為原料制作的組合霧化劑治療的臨床觀察(1)在剛?cè)朐焊綦x治療的確診病人中隨意選50名初發(fā)患者；(2)采用本發(fā)明制備的“抗非典型肺炎(SARS)IgY組合霧化劑”，藥液打開后，將其倒入PARI型壓縮霧化氣泵中，經(jīng)霧化供患者吸入。在給予持續(xù)鼻導(dǎo)管吸氧和其他相應(yīng)對癥治療措施配合的前提下，每二小時吸入本發(fā)明的IgY組合霧化劑一次，每次持續(xù)5-10分鐘。
(3)每天觀察試驗患者的癥狀變化情況，作詳細(xì)記錄；(4)經(jīng)連續(xù)吸用“抗非典型肺炎(SARS)IgY組合霧化劑”三天后，32名患者高熱逐步減退，畏寒、乏力、全身不適等癥狀減輕。吸用一周后，只有8名患者發(fā)熱持續(xù)，并出現(xiàn)干咳、胸痛，其余患者全部不再發(fā)熱，癥狀明顯減輕，有10名患者癥狀消除。
實驗例6非典型肺炎(SARS)重癥患者使用本發(fā)明的“抗非典型肺炎(SARS)特異性復(fù)合IgY”為原料制作的組合霧化劑治療的臨床觀察結(jié)果(1)任選50名住院隔離治療的中、重癥非典型肺炎(SARS)患者；(2)在照常給予持續(xù)鼻導(dǎo)管吸氣和其他相應(yīng)對癥治療措施配合的前提下，使用壓縮霧化氣泵將本發(fā)明的“抗非典型肺炎(SARS)特異性復(fù)合IgY組合霧化劑”霧化后供患者吸入。每二小時吸入一次，每次持續(xù)5-10分鐘。
(3)每天觀察試驗患者癥狀情況，詳細(xì)記錄。結(jié)果如下表


本發(fā)明的“抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY”能夠有的放矢地直接針對引致非典型肺炎的致病病毒起有效抑制作用，是從發(fā)病根源上解決問題；一方面中和這些病原體，改變這些病原體的活性，并促進人體免疫系統(tǒng)清除這些病原體。特別是，本發(fā)明的特異性IgY具有很強的廣譜抑制能力，即使致病病毒發(fā)生了某些變異，仍然會產(chǎn)生一定的抑制作用。實驗結(jié)果證明，本發(fā)明的“抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY”組合制劑，對非典型肺炎(SARS)的治療效果和目前已采用的同樣是“被動免疫治療”的“血清療法”一樣，效果比較理想；而且，由于本發(fā)明的特異性IgY有較好的廣譜抑制能力，抗體活性也強得多，又不會產(chǎn)生交叉反應(yīng)等副作用，純度高、來源廣，價格又低廉得多，因此，為預(yù)防和治療非典型肺炎(SARS)這種傳染快、危害大的惡性傳染病開辟了一條嶄新的途徑。
實施例1制備100g抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY粗提物及純IgY(1)選具高免疫應(yīng)答能力的良種鴨用肺炎雙球菌制作抗原，分別免疫1000只母鴨，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再強化注射一次，共三次；于第一次注射后第7個月，把這些鴨所產(chǎn)的蛋標(biāo)記后按常規(guī)方法分別提取其中的IgY，以ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附實驗)檢測所制得的IgY的效價；選出其中能制得IgY效價≥256的免疫應(yīng)答能力特別強的鴨200只，再用這批鴨所產(chǎn)的蛋孵出優(yōu)良鴨種，待其長大至2-3個月，作為優(yōu)選的高免疫應(yīng)答能力的特種母鴨，并挑選其中40只；(2)非典型肺炎(SARS)致病病毒復(fù)合抗原的制備本發(fā)明以香港組為例。將Vero E6細(xì)胞接種于10％FCS DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞終濃度1×105/ml。將15ml上述培養(yǎng)液置于100ml培養(yǎng)瓶中，將此培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞。然后棄掉培養(yǎng)液，將收集到的香港地區(qū)4種不同的SARS冠狀病毒毒株用2％FCS和1％青鏈霉素DMEM培養(yǎng)液稀釋至100 TCID 50/ml。取此稀釋液10ml加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并將此細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，待細(xì)胞病變達++++時收獲病毒。收獲病毒時將培養(yǎng)瓶凍融三次，收集培養(yǎng)上清，放入高速離心機中，以15000rpm轉(zhuǎn)速離心分離，收集上清。再加入甲醛至0.1％的終濃度，在37℃溫度下，經(jīng)過24小時分別滅活這4種培養(yǎng)的SARS病毒。培養(yǎng)好的滅活病毒在4℃或-20℃保存。然后，將培養(yǎng)好的香港地區(qū)4種不同的冠狀病毒按1∶1∶1∶1的比例或其他適當(dāng)比例混合，再按1∶1比例或其他適當(dāng)比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機中以10000～30000rpm轉(zhuǎn)速高速粉碎勻化，通過高速攪拌形成油包水溶液，即制成非典型肺炎(SARS)致病病毒的含多種不同型的病毒的特殊復(fù)合抗原。
(3)分別對優(yōu)選的特種母鴨進行強化免疫
用所制取的(SARS)冠狀病毒復(fù)合抗原，采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的強化免疫法，分別對優(yōu)選的特種母鴨進行免疫，每只母鴨每次注射量達到1-2ml抗原，每隔二周再強化注射一次，一個月內(nèi)共免疫三次；第一次免疫20天后，檢取母鴨所產(chǎn)免疫蛋1000只；(4)抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY的制備用打蛋機將檢取的免疫蛋打碎，用蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；測量所得的蛋黃的體積，按此體積的4-6倍加入蒸餾水，進行稀釋并混合均勻；用NaOH溶液調(diào)整pH至5.5-6.0之間；將調(diào)整好pH值的稀釋液進一步充分?jǐn)嚢杈鶆颍缓髮⑵淅鋮s至2-6℃，靜置12小時；將稀釋液加入高速離心分離機中，以8000-12000rpm轉(zhuǎn)速高速離心分離20分鐘；將分離所得的上清再入超濾器中進行超濾并濃縮15倍，按0.2％的比例將海藻酸加入濃縮后的漿料中，充分?jǐn)嚢?；再加入高速離心機離心，取上清，去除脂蛋白；將離心分離后的漿料加入超濾機，過超微膜，進行過濾除菌；將過濾除菌后的產(chǎn)品用冷凍干燥機進行冷凍干燥，即制得抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY粗提物干粉成品；過離子交換柱和凝膠交換柱對抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY粗提物進行純化，即得純IgY。
實施例2抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY霧化劑的制備抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY干粉300g加入小型攪拌機中充分混和；按以下配方調(diào)配30升抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY組合溶液抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY 300g阿斯巴甜 36g香橙香精 90g水蜜桃香精 30g生理鹽水 加至30升先調(diào)制生理鹽水25升，然后加入阿斯巴甜和香精，攪拌均勻后，再邊攪拌邊緩緩加入IgY；接著，加生理鹽水至30升，充分?jǐn)嚢杈鶆颍粶y量溶液的pH值，用1.0N NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5；經(jīng)細(xì)菌過濾除菌，然后采用無菌瓶灌裝抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY噴霧劑，每支裝20ml。
實施例3制備抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY手撳定量壓力噴霧罐抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY干粉300g加入小型攪拌機中充分混和；
按以下配方調(diào)配200升抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY組合溶液；抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY 300g阿斯巴甜 240g香橙香精 600g水蜜桃香精 200g薄荷香精 1400g蒸餾水 加至200升先取蒸餾水180升，然后分別加入阿斯巴甜、香精，攪拌均勻，再邊攪拌邊緩緩加入IgY；接著加蒸餾水至200升，充分?jǐn)嚢杈鶆?，測量溶液pH值，根據(jù)所測的pH值用1.0N NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5；溶液調(diào)配好后，必須在壓力罐生產(chǎn)線上灌裝手動定量壓力噴霧罐20000支，每支噴霧罐灌足10ml后，必須再充入壓力氮氣或者氟里昂作為助推劑(拋射劑)，裝上定量閥門，密封，即得。
實施例4制備抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY定量常壓噴霧罐抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性純IgY干粉300重量份，加入小型攪拌機中充分混和；按以下配方調(diào)配200重量份抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY組合溶液；抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY 300重量份阿斯巴甜 240重量份香橙香精 600重量份水蜜桃香精 200重量份薄荷香精 1400重量份蒸餾水 加至200體積份先取蒸餾水180體積份，然后分別加入阿斯巴甜、香精，攪拌均勻，再邊攪拌邊緩緩加入復(fù)合IgY；接著加蒸餾水至200體積份，充分?jǐn)嚢杈鶆?，測量溶液pH值，根據(jù)所測的pH值用1.0N NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5間；經(jīng)細(xì)菌過濾除菌，灌裝手撳定量常壓噴霧罐20000支，每支10ml，每支灌裝滿10ml。
實施例5制備抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎癥定量常壓噴霧罐抗非典型肺炎(SARS)特異性復(fù)合IgY干粉150重量份，抗齲齒菌IgY干粉150重量份，加入小型攪拌機中充分混和，制成抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎癥復(fù)合IgY干粉300重量份；按以下配方調(diào)配200重量份抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎癥復(fù)合IgY組合溶液；抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎癥復(fù)合IgY 300重量份阿斯巴甜 240重量份香橙香精 600重量份水蜜桃香精 200重量份薄荷香精 1400重量份蒸餾水 加至200體積份先取蒸餾水180體積份，然后分別加入阿斯巴甜、香精，攪拌均勻，再邊攪拌邊緩緩加入復(fù)合IgY；接著加蒸餾水至200體積份，充分?jǐn)嚢杈鶆?，測量溶液pH值，根據(jù)所測的pH值用1.0N NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5間；經(jīng)細(xì)菌過濾除菌，灌裝手撳定量常壓噴霧罐20000支，每支10ml，每支灌裝滿10ml。
權(quán)利要求
1.一種抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY，其特征在于該抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY的制備方法包括下列步驟優(yōu)選引致非典型肺炎(SARS)的主要致病病毒，制備非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原；制備免疫蛋；制備抗非典型肺炎(SARS)各種致病病毒特異性IgY粗提物；抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY粗提物的純化；制備抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY。
2.如權(quán)利要求
1所述的抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY，其特征在于該抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY的制備方法包括下列步驟篩選引致非典型肺炎(SARS)的主要致病病毒，在篩選和分類組合各種致病病毒的基礎(chǔ)上，分別制備單一或復(fù)合的非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原將Vero E6細(xì)胞接種于FCSDMEM培養(yǎng)液中，將上述培養(yǎng)液置于培養(yǎng)瓶中，將此培養(yǎng)瓶放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞，然后棄掉培養(yǎng)液，將各組別的SARS致病病毒毒株分別用FCS和青鏈霉素DMEM培養(yǎng)液稀釋，取稀釋液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞病變達++++時收獲病毒，放入高速離心機中高速離心分離，收集上清，再滅活所培養(yǎng)的SARS致病病毒，將培養(yǎng)好的各組別的病毒單獨或按適當(dāng)比例混合，再按1∶1比例或其他適當(dāng)比例分別加入福氏佐劑，置入高速勻漿機中高速粉碎勻化，通過高速攪拌形成油包水溶液，即制成單一或復(fù)合非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原；制備免疫蛋用各種單一或復(fù)合非典型肺炎(SARS)致病病毒抗原或非典型肺炎(SARS)繼發(fā)感染細(xì)菌抗原，分別對產(chǎn)蛋禽類進行免疫，每隔二周再強化注射一次，一個月計免疫三次，第一次免疫20天后，檢取免疫后的禽類所產(chǎn)免疫蛋，并對相應(yīng)不同的抗原，對所檢取的免疫蛋進行編碼標(biāo)記；制備抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY粗提物用流動水洗凈免疫蛋，再用酒精擦洗消毒，用打蛋機將檢取的免疫蛋打碎，用蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻，測量所得的蛋黃的體積，按此體積的4-6倍加入蒸餾水，進行稀釋并混合均勻，用NaOH溶液調(diào)整pH至5.5-6.0之間，將調(diào)整好pH值的稀釋液進一步充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后將其冷卻至2-6℃，靜置12小時-24小時，將稀釋液加入高速離心分離機中，離心分離20分鐘，將分離所得的上清再加入超濾器中進行超濾并濃縮10-20倍，按0.1～0.3％的比例將海藻酸鈉加入濃縮后的漿料中，充分?jǐn)嚢?，再加入高速離心機中離心，取上清，去除脂蛋白，將離心分離后的漿料加入超濾機，過超微膜，進行過濾除菌，將過濾除菌后的產(chǎn)品用冷凍干燥機進行冷凍干燥，即制得抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY粗提物干粉成品，最后，將所制備的對應(yīng)不同抗原的特異性IgY粗提物進行編碼標(biāo)記；抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY粗提物的純化將以上工藝所制取的抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY粗提物分別先后過離子交換柱和凝膠層析柱，即得純IgY；
3.如權(quán)利要求
1或2所述的抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY，其特征在于該抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY的制備方法中引致非典型肺炎(SARS)的致病病毒是冠狀病毒。
4.如權(quán)利要求
3所述的抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY，其特征在于該冠狀病毒是一種變種的冠狀病毒，包括它的多種變異型，有香港傳播的香港1型冠狀病毒、香港2型冠狀病毒、香港3型冠狀病毒、香港4型冠狀病毒，北京傳播的多種型冠狀病毒，加拿大型冠狀病毒，新加坡傳播的冠狀病毒，越南傳播的冠狀病毒。
5.如權(quán)利要求
1或2所述的抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY，其特征在于該抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY的制備方法中制備免疫蛋所采用的產(chǎn)蛋禽類包括母雞，母鴨，母鵝、火雞、鴕鳥。
6.如權(quán)利要求
2所述的抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY，其特征在于該抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY的制備方法中所述非典型肺炎(SARS)一種或多種致病病毒抗原的制備是這樣的首先按權(quán)利要求
2所述的方法培養(yǎng)優(yōu)選的一種或多種病毒，選擇一種致病病毒時，直接加入福氏佐劑制作單一抗原；選擇多種致病病毒時，則先將培養(yǎng)好的一種以上SARS致病病毒按1-10∶1-10或1-10∶1-10∶1-10或1-10∶1-10∶1-10∶1-10或1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10依此類推的比例均勻混合，然后加入福氏佐劑制成復(fù)合抗原。
7.如權(quán)利要求
1或2所述的抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY，其特征在于該抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY可以制成臨床可接受的劑型。
8.抗香港1型冠狀病毒、香港2型冠狀病毒、香港3型冠狀病毒、香港4型冠狀病毒多種致病病毒特異性IgY，其特征在于這種抗多種致病病毒特異性IgY的制備方法包括下列步驟分別用香港1型冠狀病毒、香港2型冠狀病毒、香港3型冠狀病毒、香港4型冠狀病毒制備抗原，首先將Vero E6細(xì)胞接種于10％FCS DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞終濃度1×105/ml，將15ml上述培養(yǎng)液置于100ml培養(yǎng)瓶中，將此培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞，然后棄掉培養(yǎng)液，將香港1型冠狀病毒、香港2型冠狀病毒、香港3型冠狀病毒、香港4型冠狀病毒毒株分別用2％FCS和1％青鏈霉素DMEM培養(yǎng)液稀釋至100 TCID 50/ml，取此稀釋液10ml加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并將此細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，待細(xì)胞病變達++++時收獲病毒，收獲病毒時將培養(yǎng)液凍融三次，收集培養(yǎng)上清，放入高速離心機中，以15000rpm轉(zhuǎn)速離心分離，收集上清，再加入甲醛至0.1％的終濃度，在37℃溫度下，經(jīng)過24小時分別滅活這4種培養(yǎng)的SARS病毒，培養(yǎng)好的滅活病毒在4℃或-20℃保存，然后，將培養(yǎng)好的滅活的香港1型冠狀病毒、香港2型冠狀病毒、香港3型冠狀病毒、香港4型冠狀病毒，按1-10∶1-10∶1-10∶1-10的比例混合均勻，再按1∶1比例或其他適當(dāng)比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機中以10000～30000rpm轉(zhuǎn)速高速粉碎勻化，通過高速攪拌形成油包水溶液，制得含四種冠狀病毒抗原的復(fù)合抗原；用制得的冠狀病毒復(fù)合抗原對產(chǎn)蛋母雞進行免疫，每隔二周再強化注射一次，計免疫三次，第一次免疫20天后，檢取母雞所產(chǎn)的免疫蛋；用流動水洗凈免疫蛋，再用酒精擦洗消毒，用打蛋機將檢取的免疫蛋打碎，用蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻，測量所得的蛋黃的體積，按此體積的4-6倍加入蒸餾水，進行稀釋并混合均勻，用NaOH溶液調(diào)整pH至5.5-6.0之間，將調(diào)整好pH值的稀釋液進一步充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后將其冷卻至2-6℃，靜置12小時-24小時，將稀釋液加入高速離心分離機中，離心分離20分鐘，將分離所得的上清再加入超濾器中進行超濾并濃縮10-20倍，按0.1～0.3％的比例將海藻酸鈉加入濃縮后的漿料中，充分?jǐn)嚢?，再加入高速離心機中離心，取上清，去除脂蛋白，將離心分離后的漿料加入超濾機，過超微膜，進行過濾除菌，將過濾除菌后的產(chǎn)品用冷凍干燥機進行冷凍干燥，制得抗香港1型冠狀病毒、香港2型冠狀病毒、香港3型冠狀病毒和抗香港4型冠狀病毒特異性復(fù)合IgY粗提物干粉，將以上IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01MPB，先后經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，把粗提物純化，即得抗香港1型冠狀病毒、香港2型冠狀病毒、香港3型冠狀病毒和抗香港4型冠狀病毒特異性復(fù)合純IgY。
9.一種抗北京型冠狀病毒特異性IgY，其特征在于這種抗一種致病病毒的特異性IgY的制備方法包括下列步驟用北京型冠狀病毒制備抗原，首先將Vero E6細(xì)胞接種于10％FCS DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞終濃度1×105/ml，將15ml上述培養(yǎng)液置于100ml培養(yǎng)瓶中，將此培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞，然后棄掉培養(yǎng)液，將北京傳播的有代表性的冠狀病毒毒株用2％FCS和1％青鏈霉素DMEM培養(yǎng)液稀釋至100 TCID 50/ml，取此稀釋液10ml加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并將此細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，待細(xì)胞病變達++++時收獲病毒，收獲病毒時將培養(yǎng)液凍融三次，收集培養(yǎng)上清，放入高速離心機中，以15000rpm轉(zhuǎn)速離心分離，收集上清，再加入甲醛至0.1％的終濃度，在37℃溫度下，經(jīng)過24小時滅活這4種培養(yǎng)的SARS病毒，培養(yǎng)好的滅活病毒在4℃或-20℃保存，再按1∶1比例或其他適當(dāng)比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機中以10000～30000rpm轉(zhuǎn)速高速粉碎勻化，通過高速攪拌形成油包水溶液，制得勻質(zhì)抗原；用所制得的北京型冠狀病毒抗原對產(chǎn)蛋禽類進行免疫，每隔二周再強化注射一次，計免疫三次，第一次免疫20天后，檢取禽類所產(chǎn)的免疫蛋；用流動水洗凈免疫蛋，再用酒精擦洗消毒，用打蛋機將檢取的免疫蛋打碎，用蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻，測量所得的蛋黃的體積，按此體積的4-6倍加入蒸餾水，進行稀釋并混合均勻，用NaOH溶液調(diào)整pH至5.5-6.0之間，將調(diào)整好pH值的稀釋液進一步充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后將其冷卻至2-6℃，靜置12小時-24小時，將稀釋液加入高速離心分離機中，離心分離20分鐘，將分離所得的上清再加入超濾器中進行超濾并濃縮10-20倍，按0.1～0.3％的比例將海藻酸鈉加入濃縮后的漿料中，充分?jǐn)嚢瑁偌尤敫咚匐x心機中離心，取上清，去除脂蛋白，將離心分離后的漿料加入超濾機，過超微膜，進行過濾除菌，將過濾除菌后的產(chǎn)品用冷凍干燥機進行冷凍干燥，制得抗北京型冠狀病毒特異性IgY粗提物干粉，將以上IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01MPB，經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，把粗提物純化，即得抗北京型冠狀病毒特異性純IgY。
10.一種抗加拿大型冠狀病毒特異性IgY，其特征在于該抗加拿大型冠狀病毒特異性IgY的制備方法包括下列步驟用收集到的加拿大地區(qū)傳播的有代表性的非典型肺炎(SARS)致病冠狀病毒制備抗原，首先將Vero E6細(xì)胞接種于10％FCS DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞終濃度1×105/ml，將15ml上述培養(yǎng)液置于100ml培養(yǎng)瓶中，將此培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞，然后棄掉培養(yǎng)液，將加拿大傳播的有代表性的冠狀病毒毒株用2％FCS和1％青鏈霉素DMEM培養(yǎng)液稀釋至100 TCID 50/ml，取此稀釋液10ml加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并將此細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，待細(xì)胞病變達++++時收獲病毒，收獲病毒時將培養(yǎng)液凍融三次，收集培養(yǎng)上清，放入高速離心機中，以15000rpm轉(zhuǎn)速離心分離，收集上清，再加入甲醛至0.1％的終濃度，在37℃溫度下，經(jīng)過24小時滅活這4種培養(yǎng)的SARS病毒，培養(yǎng)好的滅活病毒在4℃或-20℃保存，再按1∶1比例或其他適當(dāng)比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機中以10000～30000rpm轉(zhuǎn)速高速粉碎勻化，通過高速攪拌即制成油包水溶液狀致病病毒抗原；用制得的病毒抗原對產(chǎn)蛋禽類進行免疫，每隔二周再強化注射一次，計免疫三次，第一次免疫20天后，檢取禽類所產(chǎn)的免疫蛋；用流動水洗凈免疫蛋，再用酒精擦洗消毒，用打蛋機將檢取的免疫蛋打碎，用蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻，測量所得的蛋黃的體積，按此體積的4-6倍加入蒸餾水，進行稀釋并混合均勻，用NaOH溶液調(diào)整pH至5.5-6.0之間，將調(diào)整好pH值的稀釋液進一步充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后將其冷卻至2-6℃，靜置12小時-24小時，將稀釋液加入高速離心分離機中，離心分離20分鐘，將分離所得的上清再加入超濾器中進行超濾并濃縮10-20倍，按0.1～0.3％的比例將海藻酸鈉加入濃縮后的漿料中，充分?jǐn)嚢瑁偌尤敫咚匐x心機中離心，取上清，去除脂蛋白，將離心分離后的漿料加入超濾機，過超微膜，進行過濾除菌，即得抗加拿大型冠狀病毒特異性IgY粗提物；將以上IgY粗提物經(jīng)DEAE-SephadexA50柱層析和SephadexG200凝膠柱層析，得到抗加拿大型冠狀病毒特異性純IgY。
11.一種抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY制劑，其特征在于該特異性IgY制劑的制備方法包括下列步驟將用以上方法制備的抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY配以蒸餾水或生理鹽水調(diào)配成濃度0.01％以上的溶劑，制成一種新型霧化劑，加入各種霧化器中，經(jīng)過霧化后供非典型肺炎患者吸入呼吸道和肺部。
12.一種抗非典型肺炎(SARS)特異性鴨IgY，其特征在于該特異性鴨IgY的制備方法包括下列步驟選具高免疫應(yīng)答能力的良種鴨用肺炎雙球菌制作抗原，分別免疫1000只母鴨，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再強化注射一次，共三次；于第一次注射后第7個月，把這些鴨所產(chǎn)的蛋標(biāo)記后按常規(guī)方法分別提取其中的IgY，以ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附實驗)檢測所制得的IgY的效價；選出其中能制得IgY效價≥256的免疫應(yīng)答能力特別強的鴨200只，再用這批鴨所產(chǎn)的蛋孵出優(yōu)良鴨種，待其長大至2-3個月，作為優(yōu)選的高免疫應(yīng)答能力的特種母鴨，并挑選其中40只；非典型肺炎(SARS)致病病毒復(fù)合抗原的制備將Vero E6細(xì)胞接種于10％FCS DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞終濃度1×105/ml。將15ml上述培養(yǎng)液置于100ml培養(yǎng)瓶中，將此培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞，然后棄掉培養(yǎng)液，將收集到的香港地區(qū)4種不同的SARS冠狀病毒毒株用2％FCS和1％青鏈霉素DMEM培養(yǎng)液稀釋至100 TCID50/ml，取此稀釋液10ml加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并將此細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，待細(xì)胞病變達++++時收獲病毒，收獲病毒時將培養(yǎng)瓶凍融三次，收集培養(yǎng)上清，放入高速離心機中，以15000rpm轉(zhuǎn)速離心分離，收集上清，再加入甲醛至0.1％的終濃度，在37℃溫度下，經(jīng)過24小時分別滅活這4種培養(yǎng)的SARS病毒，培養(yǎng)好的滅活病毒在4℃或-20℃保存，然后，將培養(yǎng)好的香港地區(qū)4種不同的冠狀病毒按1∶1∶1∶1的比例或其他適當(dāng)比例混合，再按1∶1比例或其他適當(dāng)比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機中以10000～30000rpm轉(zhuǎn)速高速粉碎勻化，通過高速攪拌形成油包水溶液，即制成非典型肺炎(SARS)致病病毒復(fù)合抗原；分別對優(yōu)選的特種母鴨進行強化免疫用所制取的非典型肺炎(SARS)冠狀病毒復(fù)合抗原，采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的強化免疫法，分別對優(yōu)選的特種母鴨進行免疫，每只母鴨每次注射量達到1-2ml抗原，每隔二周再強化注射一次，一個月內(nèi)共免疫三次；第一次免疫20天后，檢取母鴨所產(chǎn)免疫蛋1000只；抗非典型肺炎(SARS)特異性鴨IgY粗提物的制備用打蛋機將檢取的免疫蛋打碎，用蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；測量所得的蛋黃的體積，按此體積的4-6倍加入蒸餾水，進行稀釋并混合均勻，用NaOH溶液調(diào)整pH至5.5-6.0之間，將調(diào)整好pH值的稀釋液進一步充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后將其冷卻至2-6℃，靜置12小時；將稀釋液加入高速離心分離機中，以8000-12000rpm轉(zhuǎn)速高速離心分離20分鐘；將分離所得的上清再入超濾器中進行超濾并濃縮15倍，按0.2％的比例將海藻酸鈉加入濃縮后的漿料中，充分?jǐn)嚢?；再加入高速離心機離心，取上清，去除脂蛋白，將離心分離后的漿料加入超濾機，過超微膜，進行過濾除菌，將過濾除菌后的產(chǎn)品用冷凍干燥機進行冷凍干燥，即制得抗非典型肺炎(SARS)特異性鴨IgY粗提物干粉成品，過離子交換柱和凝膠交換柱對抗非典型肺炎(SARS)特異性鴨IgY粗提物進行純化，即得純IgY。
13.一種抗非典型肺炎(SARS)特異性鵝IgY，其特征在于該特異性鵝IgY的制備方法包括下列步驟選具高免疫應(yīng)答能力的良種鵝用肺炎雙球菌制作抗原，分別免疫1000只母鵝，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再強化注射一次，共三次；于第一次注射后第7個月，把這些鵝所產(chǎn)的蛋標(biāo)記后按常規(guī)方法分別提取其中的IgY，以ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附實驗)檢測所制得的IgY的效價；選出其中能制得IgY效價≥256的免疫應(yīng)答能力特別強的鵝200只，再用這批鵝所產(chǎn)的蛋孵出優(yōu)良鵝種，待其長大至2-3個月，作為優(yōu)選的高免疫應(yīng)答能力的特種母鵝，并挑選其中40只；非典型肺炎(SARS)致病病毒復(fù)合抗原的制備將Vero E6細(xì)胞接種于10％FCS DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞終濃度1×105/ml。將15ml上述培養(yǎng)液置于100ml培養(yǎng)瓶中，將此培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞，然后棄掉培養(yǎng)液，將收集到的香港地區(qū)4種不同的SARS冠狀病毒毒株用2％FCS和1％青鏈霉素DMEM培養(yǎng)液稀釋至100 TCID50/ml，取此稀釋液10ml加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并將此細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，待細(xì)胞病變達++++時收獲病毒，收獲病毒時將培養(yǎng)瓶凍融三次，收集培養(yǎng)上清，放入高速離心機中，以15000rpm轉(zhuǎn)速離心分離，收集上清，再加入甲醛至0.1％的終濃度，在37℃溫度下，經(jīng)過24小時分別滅活這4種培養(yǎng)的SARS病毒，培養(yǎng)好的滅活病毒在4℃或-20℃保存，然后，將培養(yǎng)好的香港地區(qū)4種不同的冠狀病毒按1∶1∶1∶1的比例或其他適當(dāng)比例混合，再按1∶1比例或其他適當(dāng)比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機中以10000～30000rpm轉(zhuǎn)速高速粉碎勻化，通過高速攪拌形成油包水溶液，即制成非典型肺炎(SARS)致病病毒復(fù)合抗原；分別對優(yōu)選的特種母鵝進行強化免疫用所制取的非典型肺炎(SARS)冠狀病毒復(fù)合抗原，采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的強化免疫法，分別對優(yōu)選的特種母鵝進行免疫，每只母鵝每次注射量達到2-10ml抗原，每隔二周再強化注射一次，一個月內(nèi)共免疫三次；第一次免疫20天后，檢取母鵝所產(chǎn)免疫蛋1000只；抗非典型肺炎(SARS)特異性鵝IgY粗提物的制備用打蛋機將檢取的免疫蛋打碎，用蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；測量所得的蛋黃的體積，按此體積的4-6倍加入蒸餾水，進行稀釋并混合均勻，用NaOH溶液調(diào)整pH至5.5-6.0之間，將調(diào)整好pH值的稀釋液進一步充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后將其冷卻至2-6℃，靜置12小時；將稀釋液加入高速離心分離機中，以8000-12000rpm轉(zhuǎn)速高速離心分離20分鐘；將分離所得的上清再入超濾器中進行超濾并濃縮15倍，按0.2％的比例將海藻酸鈉加入濃縮后的漿料中，充分?jǐn)嚢瑁辉偌尤敫咚匐x心機離心，取上清，去除脂蛋白，將離心分離后的漿料加入超濾機，過超微膜，進行過濾除菌，將過濾除菌后的產(chǎn)品用冷凍干燥機進行冷凍干燥，即制得抗非典型肺炎(SARS)特異性鵝IgY粗提物干粉成品，過離子交換柱和凝膠交換柱對抗非典型肺炎(SARS)特異性鵝IgY粗提物進行純化，即得純IgY。
14.一種抗非典型肺炎(SARS)特異性鴕鳥IgY，其特征在于該特異性鴕鳥IgY的制備方法包括下列步驟選具高免疫應(yīng)答能力的良種產(chǎn)蛋鴕鳥用肺炎雙球菌制作抗原，分別免疫1000只產(chǎn)蛋鴕鳥，每次注射1ml抗原，在第一次注射后，每隔二周再強化注射一次，共三次；于第一次注射后第7個月，把這些產(chǎn)蛋鴕鳥所產(chǎn)的蛋標(biāo)記后按常規(guī)方法分別提取其中的IgY，以ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附實驗)檢測所制得的IgY的效價；選出其中能制得IgY效價≥256的免疫應(yīng)答能力特別強的產(chǎn)蛋鴕鳥200只，再用這批產(chǎn)蛋鴕鳥所產(chǎn)的蛋孵出優(yōu)良鴕鳥種，待其長大至2-3個月，作為優(yōu)選的高免疫應(yīng)答能力的特種產(chǎn)蛋鴕鳥，并挑選其中40只；非典型肺炎(SARS)致病病毒復(fù)合抗原的制備將Vero E6細(xì)胞接種于10％FCS DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞終濃度1×105/ml。將15ml上述培養(yǎng)液置于100ml培養(yǎng)瓶中，將此培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和培養(yǎng)箱中培養(yǎng)成單層細(xì)胞，然后棄掉培養(yǎng)液，將收集到的香港地區(qū)4種不同的SARS冠狀病毒毒株用2％FCS和1％青鏈霉素DMEM培養(yǎng)液稀釋至100 TCID50/ml，取此稀釋液10ml加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并將此細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置在37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，待細(xì)胞病變達++++時收獲病毒，收獲病毒時將培養(yǎng)瓶凍融三次，收集培養(yǎng)上清，放入高速離心機中，以15000rpm轉(zhuǎn)速離心分離，收集上清，再加入甲醛至0.1％的終濃度，在37℃溫度下，經(jīng)過24小時分別滅活這4種培養(yǎng)的SARS病毒，培養(yǎng)好的滅活病毒在4℃或-20℃保存，然后，將培養(yǎng)好的香港地區(qū)4種不同的冠狀病毒按1∶1∶1∶1的比例或其他適當(dāng)比例混合，再按1∶1比例或其他適當(dāng)比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿機中以10000～30000rpm轉(zhuǎn)速高速粉碎勻化，通過高速攪拌形成油包水溶液，即制成非典型肺炎(SARS)致病病毒復(fù)合抗原；分別對優(yōu)選的特種產(chǎn)蛋鴕鳥進行強化免疫用所制取的非典型肺炎(SARS)冠狀病毒復(fù)合抗原，采用皮下注射和翅靜脈注射相結(jié)合的強化免疫法，分別對優(yōu)選的特種產(chǎn)蛋鴕鳥進行免疫，每只產(chǎn)蛋鴕鳥每次注射量達到5-20ml抗原，每隔二周再強化注射一次，一個月內(nèi)共免疫三次；第一次免疫20天后，檢取產(chǎn)蛋鴕鳥所產(chǎn)免疫蛋1000只；抗非典型肺炎(SARS)特異性鴕鳥IgY粗提物的制備用打蛋機將檢取的免疫蛋打碎，用蛋黃篩篩濾去蛋清，留下蛋黃，攪拌均勻；測量所得的蛋黃的體積，按此體積的4-6倍加入蒸餾水，進行稀釋并混合均勻，用NaOH溶液調(diào)整pH至5.5-6.0之間，將調(diào)整好pH值的稀釋液進一步充分?jǐn)嚢杈鶆颍缓髮⑵淅鋮s至2-6℃，靜置12小時；將稀釋液加入高速離心分離機中，以8000-12000rpm轉(zhuǎn)速高速離心分離20分鐘；將分離所得的上清再入超濾器中進行超濾并濃縮15倍，按0.2％的比例將海藻酸鈉加入濃縮后的漿料中，充分?jǐn)嚢?；再加入高速離心機離心，取上清，去除脂蛋白，將離心分離后的漿料加入超濾機，過超微膜，進行過濾除菌，將過濾除菌后的產(chǎn)品用冷凍干燥機進行冷凍干燥，即制得抗非典型肺炎(SARS)特異性鴕鳥IgY粗提物干粉成品，過離子交換柱和凝膠交換柱對抗非典型肺炎(SARS)特異性鴕鳥IgY粗提物進行純化，即得純IgY。
15.一種抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY制劑，其特征在于該制劑中每升含有抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY 1-100克。
16.一種抗非典型肺炎(SARS)霧化劑的制備方法，其特征在于該方法為抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY干粉300重量份加入小型攪拌機中充分混和；按以下配方調(diào)配30000重量份抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY組合溶液抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY 300重量份阿斯巴甜 36重量份香橙香精 90重量份水蜜桃香精 30重量份生理鹽水 加至30000重量份先調(diào)制生理鹽水25000重量份，然后加入阿斯巴甜和香精，攪拌均勻后，再邊攪拌邊緩緩加入IgY；接著，加生理鹽水至30000重量份，充分?jǐn)嚢杈鶆?；測量溶液的pH值，用1.0NNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5；經(jīng)細(xì)菌過濾除菌，然后采用無菌瓶灌裝抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY噴霧劑，每支裝20ml。
17.一種抗非典型肺炎(SARS)噴霧劑的制備方法，其特征在于該方法為抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY干粉300重量份加入小型攪拌機中充分混和；按以下配方調(diào)配200000重量份抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY組合溶液；抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY 300重量份阿斯巴甜 240重量份香橙香精 600重量份水蜜桃香精 200重量份薄荷香精 1400重量份蒸餾水 加至200000重量份先取蒸餾水180000重量份，然后分別加入阿斯巴甜、香精，攪拌均勻，再邊攪拌邊緩緩加入IgY；接著加蒸餾水至200000重量份，充分?jǐn)嚢杈鶆?，測量溶液pH值，根據(jù)所測的pH值用1.0N NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5；溶液調(diào)配好后，在壓力罐生產(chǎn)線上灌裝手動定量壓力噴霧罐，每支噴霧罐灌足10ml后，再充入壓力氮氣或者氟里昂作為助推劑(拋射劑)，裝上定量閥門，密封，即得。
18.一種抗非典型肺炎(SARS)常壓噴霧劑的制備方法，其特征在于該方法為抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性純IgY干粉300重量份，加入小型攪拌機中充分混和；按以下配方調(diào)配200000重量份抗非典型肺炎(SARS)致病病毒IgY組合溶液；抗非典型肺炎(SARS)致病病毒特異性IgY 300重量份阿斯巴甜 240重量份香橙香精 600重量份水蜜桃香精 200重量份薄荷香精 1400重量份蒸餾水 加至200000重量份先取蒸餾水180000重量份，然后分別加入阿斯巴甜、香精，攪拌均勻，再邊攪拌邊緩緩加入復(fù)合IgY；接著加蒸餾水至200000重量份，充分?jǐn)嚢杈鶆颍瑴y量溶液pH值，根據(jù)所測的pH值用1.0N NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5間；經(jīng)細(xì)菌過濾除菌，灌裝手撳定量常壓噴霧罐，每支灌裝滿10ml。
19.一種抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎癥噴霧劑的制備方法，其特征在于該方法為抗非典型肺炎(SARS)特異性復(fù)合IgY干粉150重量份，抗齲齒菌IgY干粉150重量份，加入小型攪拌機中充分混和，制成抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎癥復(fù)合IgY干粉300重量份；按以下配方調(diào)配200000重量份抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎癥復(fù)合IgY組合溶液；抗非典型肺炎(SARS)和口腔炎癥復(fù)合IgY 300重量份阿斯巴甜 240重量份香橙香精 600重量份水蜜桃香精 200重量份薄荷香精 1400重量份蒸餾水 加至200000重量份先取蒸餾水180000重量份，然后分別加入阿斯巴甜、香精，攪拌均勻，再邊攪拌邊緩緩加入復(fù)合IgY；接著加蒸餾水至200000重量份，充分?jǐn)嚢杈鶆?，測量溶液pH值，根據(jù)所測的pH值用1.0N NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5間；經(jīng)細(xì)菌過濾除菌，灌裝手撳定量常壓噴霧罐，每支灌裝滿10ml。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY及其制備方法和制劑。本發(fā)明制備方法包括下列步驟篩選出引致非典型肺炎(SARS)的主要致病病毒，在篩選和分類組合各種致病病毒的基礎(chǔ)上，分別制備單一或復(fù)合的致病病毒抗原，制備免疫蛋，制備抗非典型肺炎(SARS)各種致病病毒特異性IgY粗提物，抗非典型肺炎(SARS)各種致病病毒特異性IgY粗提物的純化，本發(fā)明抗非典型肺炎(SARS)特異性IgY多種制劑用于非典型肺炎(SARS)的預(yù)防和治療具有特效、安全、使用方便的特點。
文檔編號C12N7/00GKCN1450086SQ03136101
公開日2003年10月22日 申請日期2003年5月13日
發(fā)明者包晟 申請人:雅臣藥業(yè)集團(遠(yuǎn)東)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan