專利名稱:枯草芽孢桿菌制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含枯草芽孢桿菌的制劑，特別是水質(zhì)改良劑。
背景技術(shù)：
近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展極其迅速，大規(guī)模集約化過程中大量使用抗生素及其它化學(xué)藥物，雖然達(dá)到了增產(chǎn)與抗病的目的，但長期濫用抗生素不僅會引起病原菌的抗藥性，而且水產(chǎn)品和水環(huán)境中抗生素的化學(xué)殘留直接威脅著人類的健康?？股氐臍埩粢殉蔀槲覈乃a(chǎn)品國際貿(mào)易的技術(shù)壁壘，令我國的水產(chǎn)品出口蒙受巨大的損失。近年來國家嚴(yán)格限制抗生素的使用，并積極尋求其替代品。
微生態(tài)制劑(或稱微生態(tài)調(diào)節(jié)劑microeclogical modulator)的使用已有百年的歷史，從二十世紀(jì)初梅切尼科夫(Elie Metchnikoff)在歐洲提倡飲用酸牛奶可健康長壽以來，微生態(tài)制劑在世界各地發(fā)展迅猛，二十世紀(jì)七十年代德國Volkor Rusch在赫爾本建立了微生態(tài)學(xué)研究所，并從事對雙歧桿菌、乳桿菌、大腸桿菌等活菌作生態(tài)療法的研究與應(yīng)用。日本于80年代初已有26種微生態(tài)制品用于醫(yī)療和保健。其他各國亦有多種微生態(tài)制品投放市場，而且數(shù)量和品種亦在不斷擴(kuò)大。我國最早使用微生態(tài)制劑乳酶生(乳桿菌)來防治腸道疾病。80年代初研制成功促菌生(蠟桿芽孢桿菌)以來，各種活菌微生態(tài)制劑相繼研制成功。如麗珠腸樂(雙歧桿菌)、整腸生(地衣芽孢桿菌)、三株口服液(雙歧桿菌、乳酸菌、DL菌活生物體及其代謝物)，并陸續(xù)投放市場。同時獸用微生態(tài)制劑如芽孢桿菌類、乳酸菌類和酵母菌類的微生態(tài)制劑研制成功并作為飼料添加劑被廣泛使用，1999年農(nóng)業(yè)部規(guī)定了枯草芽孢桿菌等12種飼料級微生物添加劑(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第105號 允許使用的飼料添加劑品種目錄)。
水產(chǎn)生物生活的水體環(huán)境是一個微生物的動態(tài)平衡系統(tǒng)，有益菌群和病原菌群共同生存，但由于環(huán)境污染日益嚴(yán)重，養(yǎng)殖水體的水質(zhì)惡化、致使病原菌大量繁殖，使得近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害不斷發(fā)生，并呈暴發(fā)流行趨勢，危及魚蝦蟹貝藻鱉等幾乎所有的養(yǎng)殖動物。與此同時由于水產(chǎn)食品中的漁用藥物殘留及漁用藥物對水環(huán)境的影響，使得漁用藥物的使用受到嚴(yán)格控制。因此在80年代開始用微生態(tài)制劑作為漁用水質(zhì)改良劑。但使用的種類主要為光合細(xì)菌、乳桿菌、蠟樣芽孢桿菌、噬菌蛭弧菌和復(fù)合EM菌群等(鯉微生態(tài)制劑及其制備方法 專利公開號CN1100271；微膠囊益生凈水復(fù)合菌修復(fù)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的方法 專利公開號CN1461734A；一種池塘養(yǎng)蝦的前期養(yǎng)水方法 專利公開號CN1460414A)。但用枯草芽孢桿菌作為漁用水質(zhì)改良劑則鮮有報道。目前生產(chǎn)的漁用微生態(tài)制劑主要采用常規(guī)的深層液體發(fā)酵法，該法存在著生產(chǎn)成本高，只能以水劑劑型為主，固化困難等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決養(yǎng)殖水體水質(zhì)因污染而日益惡化以及目前漁用微生態(tài)水質(zhì)改良劑品種較單一或者生產(chǎn)成本高、存在二次污染、劑型固化困難等問題，為此提供本發(fā)明的一種枯草芽孢桿菌制劑，本改良劑能有效改良養(yǎng)殖水體水質(zhì)，對魚類無毒性和致病性。
為解決上述問題，本發(fā)明枯草芽孢桿菌制劑采用的技術(shù)方案其特殊之處是以其重量為基準(zhǔn)含有1.4～4.0％下述的發(fā)酵培養(yǎng)基固形物、86～90％下述的填充料和余量的水，所述的制劑中枯草芽孢桿菌B115(Bacillus subtilis B115CGMCC No 1210)含量為1～100×108個/克；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基固形物可以是豆餅粉、麩皮、玉米粉中的二種或三種的組合物；所述的填充料可以是礦粉、農(nóng)作物桔桿籽粒粉或礦粉和農(nóng)作物桔桿籽粒粉的組合物。礦粉和農(nóng)作物桔桿籽粒組合物，兩者可以任何比例組合。
本發(fā)明所述的礦粉可以是沸石粉、膨潤土、麥飯石粉、陶土、高嶺土中的一種或二種以上的組合物，所述的農(nóng)作物桔桿籽粒粉可以是礱糠粉、米糠、豆粕粉、麩皮、花生粕、菜粕、玉米芯粉中的一種或二種以上的組合物。
本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌B115于2004年8月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號為No1210。
枯草芽孢桿菌從池塘淤泥中分離得到。取池塘淤泥，加水稀釋，攪拌混勻，煮沸后冷卻，再用水稀釋至，取稀釋液均勻涂于按重量由胰蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，余量為水，組成的LB固體培養(yǎng)基(pH 7.0～7.2)上，挑取可疑菌落(菌落邊緣不整齊)，再接種到另一上述組成的LB固體培養(yǎng)基上，純培養(yǎng)后鑒定，得到枯草芽孢桿菌B115。
以下對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
1、枯草芽孢桿菌B115的主要特征枯草芽孢桿菌B115的主要特征為革蘭氏陽性，桿狀，能形成芽孢，芽孢呈橢圓形，芽孢囊不膨大，觸酶陽性，VP試驗陽性，甲基紅陰性，能利用葡萄糖不產(chǎn)氣，能利用木糖、阿拉伯糖、甘露醇、淀粉、明膠、檸檬酸鹽，硝酸鹽還原陽性，50℃生長，pH5.7生長，7％NaCl生長。
2、枯草芽孢桿菌B115的保存與培養(yǎng)菌種于4℃保存于膠狀LB培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基配方(W/W)為胰蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，余量為水，pH 7.0～7.2。細(xì)菌菌種的長期保存采用冰冷干燥方法。
用接種針挑枯草芽孢桿菌B115菌落，接種于含3～5ml液狀培養(yǎng)基的試管內(nèi)，此培養(yǎng)基配方(W/W)為胰蛋白胨1％，牛肉膏0.25％，NaCl0.5％，余量為水，pH7.0～7.2；200轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)，30℃，18～20小時；再將試管中的細(xì)菌接種于含上述液狀培養(yǎng)基250mL的錐形瓶內(nèi)，200轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)，30℃，21～24h，得到菌液，其中枯草芽孢桿菌B115濃度不小于5×109CFU/mL。
3、枯草芽孢桿菌B115固體發(fā)酵固體發(fā)酵采用構(gòu)造簡單的淺盤式發(fā)酵器，由一個無菌溫室和許多可移動的托盤組成，發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)滅菌、冷卻、接種后裝入托盤，料層厚度為1cm～2cm，托盤放在溫室的架子上，通過加溫增濕器調(diào)節(jié)溫室空間的溫度和濕度，溫室的溫度控制在28～35℃，同時不斷通入低壓無菌空氣，使菌體處于最適生長狀態(tài)。
發(fā)酵培養(yǎng)基的配方(W/W)為3.5％豆餅粉，4％麩皮，5％玉米粉，余量為水。發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)120～125℃(0.1～0.15Mpa)高溫消毒30分鐘，冷卻后接種。
以重量計，按發(fā)酵培養(yǎng)基1％的量，將上述菌液分別接種到準(zhǔn)備好的發(fā)酵培養(yǎng)基，混合均勻，混勻后平鋪在搪瓷盆或不銹鋼淺盤上進(jìn)行好氧發(fā)酵，時間1～2d，得到含菌糊漿。
4、枯草芽孢桿菌B115制劑的配制將上述含菌糊漿與等重量的本發(fā)明所述的填充料混勻后，于40±1℃鼓風(fēng)式干燥箱中烘干，過18～20目篩，拌勻，制成粉末狀的制劑。
按本發(fā)明制備的枯草芽孢桿菌B115株的芽孢含量≥20×108CFU/mL。
5、對水質(zhì)改良作用(1)不同濃度的枯草芽孢桿菌B115制劑對室內(nèi)靜態(tài)水體改良效果枯草芽孢桿菌B115制劑使用后，對室內(nèi)池水的溶氧、pH無明顯的影響。
室內(nèi)池水在使用枯草芽孢桿菌B115制劑后，0.1ppm組氨氮降低5.62～28.51％，最大降解峰值出現(xiàn)在第4d，亞硝酸鹽氮降低1.52～10.61％，最大降解峰值出現(xiàn)在第3-4d；硫化物降低2.17～20.65％，最大降解峰值出現(xiàn)在第4d，COD降低0.00～13.83％；0.5ppm組氨氮降低6.93～40.26％，最大降解峰值出現(xiàn)在第4d，亞硝酸鹽氮降低7.01～21.66％，最大降解峰值出現(xiàn)在第3d；硫化物降低17.19～31.25％，最大降解峰值出現(xiàn)在第4d，COD降低-0.380～15.22％；1.0ppm組氨氮降低6.28～47.83％，最大降解峰值出現(xiàn)在第5-7d，亞硝酸鹽氮降低5.11～24.82％，最大降解峰值出現(xiàn)在第4d；硫化物降低2.91～43.69％，最大降解峰值出現(xiàn)在第4d，COD降低3.98～20.15％。而未使用枯草芽孢桿菌B115制劑的對照池氨氮的變化量為-2.43～13.11％，亞硝酸鹽氮的變化量為-5.08～8.47％，硫化物的變化量為-6.41～12.82％，無明顯的降解峰出現(xiàn)，COD變化量為-1.95～-7.06％。表明枯草芽孢桿菌B115制劑使用后，可明顯降低池水的氨氮濃度、亞硝酸鹽氮、硫化物濃度。由于本次實驗在靜態(tài)水環(huán)境中進(jìn)行，因此對照組的COD也呈下降的趨勢，但與試驗組相比，第7d時，下降幅度僅為使用芽孢桿菌制劑組的50％以下，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌B115對有機(jī)質(zhì)有降低作用。
0.1ppm、0.5ppm、1.0ppm的枯草芽孢桿菌B115制劑使用后，均對池塘水質(zhì)有不同的改良作用，在該濃度范圍內(nèi)改良效果與濃度呈正相關(guān)，但0.1ppm枯草芽孢桿菌B115制劑使用后，池水中氨氮降解率為28.51％、亞硝酸鹽氮為10.61％、硫化物為20.65％，而0.5ppm和1.0ppm的枯草芽孢桿菌B115制劑使用后，氨氮降解率＞40％、亞硝酸鹽氮＞20％、硫化物＞30％。雖然1.0ppm使用后效果要優(yōu)于0.5ppm的使用效果，但兩者相比，效果差別不是非常大，因此從使用成本和使用效果等方面的綜合考慮，作為微生態(tài)水質(zhì)改良劑，當(dāng)枯草芽孢桿菌B115濃度為20億/克時，0.5ppm的使用劑量比較合理的。
(2)枯草芽孢桿菌B115制劑對養(yǎng)殖魚池的水質(zhì)改良效果測定試驗在湖州市金泰水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司的3號、4號和5號池進(jìn)行，其中3號和4號池為試驗池，5號池為對照池，池塘相鄰，面積均為8畝，水深1.5米，3號和5號池塘主要養(yǎng)殖太湖白魚、4號池塘主要養(yǎng)殖鱖魚。3號和4號池按枯草芽孢桿菌B115制劑使用說明，每池用枯草芽孢桿菌B115制劑4000g全池潑灑，使用后的第3、第7及第15天采集水樣分析測定。第15天時試驗池塘第二次使用枯草芽孢桿菌B115制劑4000g全池潑灑。
在試驗期間，兩試驗魚池pH的變化量分別為-0.26～0.40％和-0.39～0.66％，而對照魚池pH變化量為-0.39～-0.13％；兩試驗魚池溶氧的變化率為-0.53～5.20％和-0.239～0.13％；對照魚池溶氧變化率為0.51～5.68％，表明枯草芽孢桿制劑使用后對養(yǎng)殖魚池溶氧和pH無明顯的影響。試驗魚池在使用枯草芽孢桿菌B115制劑后最大降解峰出現(xiàn)在第3d，氨氮分別降低49.45％和48.57％，亞硝酸鹽氮分別降低13.86％和13.22％，硫化物分別降低25.81％和16.49％，之后各項水化指標(biāo)逐漸升高，至第15d時，兩試驗魚池氨氮僅降低3.3％和11.43％；亞硝酸鹽氮降低4.95％和4.13％，硫化物降低14.52％和2.06％。因此在第15d時繼續(xù)用0.5ppm的枯草芽孢桿菌B115制劑全池潑灑，第二次使用后的最大降解峰仍出現(xiàn)在第3d，氨氮分別降低45.60％和50.29％，亞硝酸鹽氮降低18.81％和11.57％，硫化物降低30.65％和19.59％，至30天時各項水化指標(biāo)又逐漸升至使用前水平。對照魚池氨氮變化范圍為-3.09％～13.58％，亞硝酸態(tài)氮-46.65％～11.63％，硫化物能降低-3.95％～11.63％，無明顯的降解峰出現(xiàn)。4號和3號試驗池塘的COD分別為降低0.59～6.00％和0.28～3.92％，而對照池塘的COD增加0.00～4.09％。結(jié)果表明枯草芽孢桿菌B115制劑使用后，對池塘氨氮、亞硝酸鹽氮、硫化物和有機(jī)物具有明顯的降解作用，降解高峰出現(xiàn)用后第3d左右，在池塘中的維持時間在15d左右，追加使用后的第3d能再次出現(xiàn)氨氮，亞硝酸態(tài)氮和硫化物降解高峰。因此建議在生產(chǎn)中，枯草芽孢桿菌B115制劑一次使用后，在15天以內(nèi)應(yīng)繼續(xù)使用，以有效地改善養(yǎng)殖池塘的環(huán)境，降低池塘中有毒有害物質(zhì)的量，提高養(yǎng)殖效益。
(3)枯草芽孢桿菌B115制劑對養(yǎng)殖蟹池的水質(zhì)改良效果測定試驗在湖州市青山鄉(xiāng)張新江河蟹養(yǎng)殖場的東1和東2池塘進(jìn)行，池塘相鄰，面積分別為15畝和7畝，平均水深為0.6m。東1池塘為試驗池，主要以飼養(yǎng)成蟹為主。試驗時用3000g枯草芽孢桿菌B115制劑全池潑灑。東2池塘為對照池。
在試驗期間，試驗蟹池pH的變化量分別為0.57％～1.58％，溶氧的變化率為-1.22％～2.91％，對照蟹池pH變化量為0.14％～0.42％；溶氧變化率為0.63％～3.30％，表明枯草芽孢桿菌B115制劑使用后對養(yǎng)殖蟹池溶氧和pH無明顯的影響。試驗蟹池在使用枯草芽孢桿菌B115制劑后第3天出現(xiàn)降解高峰，氨氮降低38.25％；亞硝酸鹽氮降低17.05％，硫化物降低14.29％；之后各項水化指標(biāo)逐漸升高。而總大腸菌群則在第7天出現(xiàn)最大降低值為33.90％，在3-15天內(nèi)均保持了較低的值。
總之，三種不同水體枯草芽孢桿菌B115制劑使用后，對溶氧和pH均無明顯的影響。而對氨氮最大降解峰值出現(xiàn)在用后的3～4d，最大平均降低率為45.40±5.06％，亞硝酸鹽氮的最大降解峰值出現(xiàn)在使用后3d，最大平均降低率為16.03±3.82％，硫化物的最大降解峰值出現(xiàn)在使用后3～4d，最大平均降低率為23.01±7.27％；而各對照組的氨氮、亞硝酸鹽氮、硫化物呈波動變化，且出現(xiàn)時間也不固定，統(tǒng)計分析兩者有明顯差異(P＜0.1)。因此可以判斷枯草芽孢桿菌B115劑使用后，對水體中氨氮、亞硝酸鹽氮及硫化物有明顯的改良作用。
6、枯草芽孢桿菌B115微生態(tài)制劑對常見致病微生物的影響篩選出抗菌活性較強(qiáng)的菌株B115。B115菌液培養(yǎng)并經(jīng)離心后，其培養(yǎng)濾液對常見的魚類病原菌具有抑菌活性，能較強(qiáng)地抑制細(xì)菌性敗血癥病原(BSK-10)、金黃色葡萄球菌、大黃魚致病菌(副溶血弧菌、哈維氏弧菌)，但不能抑制中華鱉致病菌(TL970424)。對BSK-10的抑菌圈為14mm，對大黃魚哈維氏弧菌的抑菌圈為15mm，對大黃魚副溶血弧菌的抑菌圈為13mm，對河蟹致病菌Cl99920的抑菌圈為13mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈為10mm。說明B115菌在培養(yǎng)過程中可分泌出一種抗菌物質(zhì)，其抑菌范圍是相當(dāng)廣泛的包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，但并不是所有的細(xì)菌。
(1)對BSK-10的作用B115與BSK-10混合培養(yǎng)時，BSK-10的初始濃度與B115一致均為5000CFU/ml時BSK-10的生長不受B115的抑制，24h培養(yǎng)產(chǎn)物中BSK-10的含量與BSK-10純培養(yǎng)濃度一致，BSK-10的初始濃度為B115的1/10和1/100時，6h時計數(shù)結(jié)果表明BSK-10的生長基本不受B115的影響，但至24h時未檢測到BSK-10(最低檢出值為100CFU/ml)，說明B115對中、低濃度的BSK-10具有明顯的殺滅作用；但高濃度的BSK-10對B115的生長具有抑制作用，24h時B115的增殖倍數(shù)為對照的1/1200，中、低濃度的BSK-10對B115的生長基本無影響。
(2)對Cl99920的作用B115與Cl99920混合培養(yǎng)的抑殺菌效果，試驗結(jié)果表明B115(濃度為5000CFU/ml)對中高濃度(5000和500CFU/ml)的Cl99920具有明顯的抑制作用，且在6h時就已表現(xiàn)出來，中高濃度的Cl99920在6h時其增殖量分別為對照的1/5和1/12，至24h時為對照的1/600和1/300；B115對低濃度(50CFU/ml)的Cl99920有明顯的殺滅作用，6h和24h時均未檢出Cl99920的存在，即起始濃度為50CFU/ml的Cl99920沒有增殖到100CFU/ml，可見5000CFU/ml的B115對50CFU/ml的Cl99920具有殺滅作用；而Cl99920對B115的生長基本無影響，三個濃度的Cl99920與B115混合培養(yǎng)至24h后，B115的含量與對照無明顯差異。
氣單胞菌廣泛分布于水體環(huán)境中，能夠引起鯽、鳊、鰱、鳙等普通養(yǎng)殖魚類及蝦、蟹、鱉、蛙等特種水產(chǎn)動物的嚴(yán)重疾病。B115與致病性氣單胞菌混合培養(yǎng)的結(jié)果顯示，5000CFU/ml的B115能殺滅500CFU/ml、50CFU/ml的魚類氣單胞菌敗血癥病原菌BSK-10以及50CFU/ml的河蟹氣單胞菌致病菌Cl99920，能抑制5000CFU/ml和500CFU/ml的Cl99920的生長。但B115對甲魚致病性氣單胞菌TL97424無抑制作用。因此，在養(yǎng)殖水體中施用B115制劑對防治某些致病性氣單胞菌引起的疾病具有一定的效果。
7、枯草芽孢桿菌B115微生態(tài)制劑的毒性及致病性(1)芽孢桿菌的毒性試驗A、對鯽魚的急性毒性試驗10ppm、100ppm枯草芽孢桿菌B115制劑使用后，試驗魚攝食、活動正常，成活率為100％；1000ppm使用后，池水稍變渾濁，但鯽魚攝食、活動正常，成活率為100％；4000ppm使用24h后，水質(zhì)渾濁，試驗魚缺氧浮頭，96h內(nèi)平均死亡率為35％?？莶菅挎邨U菌B115株對鯽魚的96小時LD50＞4000ppm。
B、對淡水青蝦的急性毒性試驗
10ppm、100ppm枯草芽孢桿菌B115制劑使用后，試驗蝦攝食、活動正常，成活率為100％；1000ppm枯草芽孢桿菌B115制劑使用后，池水稍變渾濁，淡水青蝦出現(xiàn)浮頭，96h內(nèi)平均成活率為60％；2000ppm使用后，池水變渾，24h后，淡水青蝦嚴(yán)重缺氧浮頭，48h內(nèi)全部死亡。用直線內(nèi)插法計算枯草芽孢桿菌B115制劑對淡水青蝦的96hLD50為1350ppm。
C、對小白鼠毒性試驗小白鼠隨機(jī)分組，每組10只，雌雄各半，每籠10只，給藥前稱重。試驗分口灌給藥、拌餌給藥兩組，各組按高、中、低三個劑量給藥，其中高劑量組分別口灌和拌餌給菌5×1010CFU/只，中劑量組口灌和拌餌給菌1×1010CFU/只，低劑量口灌和拌餌給菌0.5×1010CFU/只每天給藥一次。同時設(shè)試驗對照組和空白對照組。
各組小鼠用枯草芽孢桿菌B115制劑投喂后，每天觀察小白鼠的外表、行為、飲食等情況。30天試驗結(jié)束于末次給藥后24h，采血測定血液學(xué)、血液生化學(xué)指標(biāo)，各組小白鼠采血后斷頸處死，迅速解剖，仔細(xì)觀察心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、子宮、卵巢、睪丸病變。
30天試驗結(jié)束于末次給藥后24h，眼眶取血，用全自動血液分析儀測定紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；用BackMan全自生化分析儀測定谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、AST和ALK，對測定的數(shù)據(jù)作方差檢驗30天試驗結(jié)束后，各試驗組和對照組小白鼠的活動、顏色光澤、呼吸均正常，鼻腔末見分泌物外溢，糞便成形，成活率為100％。30天飼料消耗及小白鼠體重均無差異(P＞0.1)，心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、子宮、卵巢、睪丸均正常。試驗組和對照組小白鼠的血液學(xué)和血液生化學(xué)指標(biāo)經(jīng)t檢驗結(jié)果表明小白鼠口灌和拌餌投飼枯草芽孢桿菌B115制劑后，t值均＞0.1，兩者無差異，表明枯草芽孢桿菌B115株對小白鼠無毒性。
(2)枯草芽孢桿菌B115制劑的致病性試驗(1)鯽魚口灌枯草芽孢桿菌B115株的致病性試驗將枯草芽孢桿菌B115制劑稀釋至50×108cfu/mL及用4℃，6000rpm離心10min，取菌泥，用生理鹽水稀釋至200×108cfu/mL后，用自制的口灌器，分別灌入1ml、0.5ml和0.1ml的枯草芽孢桿菌B115培養(yǎng)物和菌泥稀釋液，每兩天口灌一次，連續(xù)口灌三次，同時設(shè)口灌1ml滅菌LB培養(yǎng)基對照組，口灌結(jié)束后連續(xù)觀察15天，各組試驗組和對照組鯽魚口灌枯草芽孢桿菌B115制劑后均未出現(xiàn)死亡，成活率為100％，與對照組相比體重未有明顯下降，體表和臟器解剖觀察未出現(xiàn)異常，表明口灌枯草芽孢桿菌B115株對鯽魚無致病性。
(2)注射枯草芽孢桿菌B115株的致病性試驗枯草芽孢桿菌B115離心后菌泥用生理鹽水稀釋成200×108cfu/mL后，腹腔注射鯽魚10尾/組，每尾分別注射0.5和0.1ml。對照組鯽魚注射滅菌生理鹽水，每尾注射0.5ml。中華絨螯蟹于第三步足基部注射10只，每只注射0.1ml，對照組每只注射生理鹽水0.1ml；南美白對蝦注射10尾，每尾注射0.1ml，對照組每尾注射0.1ml生理鹽水；小白鼠腹腔注射10只/組，皮下注射10只/組，每只分別注射0.5ml和0.1ml，每2d注射一次，連續(xù)注射3次，對照組每只注射生理鹽水0.5ml。連續(xù)觀察15天。試驗期間水溫為25±1℃，池水溶氧在5mg/L以上，pH7.35，氣溫為30±3℃。各試驗組和對照組鯽魚、中華絨螯蟹和南美白對蝦注射枯草芽孢桿菌B115后的15天內(nèi)，均未出現(xiàn)死亡，成活率為100％，與對照組相比體重未有明顯下降，體表和臟器解剖觀察未出現(xiàn)異常。各試驗組和對照組小白鼠的活動、皮毛顏色光澤、呼吸均正常，鼻腔末見分泌物外溢。皮下注射部分有結(jié)塊，腹腔注射的小白鼠腹水增多，肝、脾、腎、腸、性腺等臟器解剖觀察正常。因此初步判斷本實驗室從池塘淤泥中分離的枯草芽孢桿菌B115株對常見水產(chǎn)動物及小白鼠無致病性。
試用表明，本發(fā)明的水質(zhì)改良劑，對池塘氨氮、亞硝酸鹽氮、硫化物和有機(jī)物具有明顯的降解作用，能有效改善養(yǎng)殖池塘的環(huán)境，降低池塘中有毒有害物質(zhì)的量，并且對魚類無毒性和致病性，能有效提高養(yǎng)殖效益。本發(fā)明的制劑，可以是固體劑型，有利于儲存、包裝、運輸。
具體實施方式
實施例1取池塘淤泥，加10倍重量的無菌水稀釋，攪拌混勻，煮沸8分鐘，冷卻，再分份用無菌水分別稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，取不同稀釋度的液體0.1ml，均勻涂于按重量由胰蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，余量為水，組成的LB固體培養(yǎng)基(pH 7.0～7.2)上，挑取可疑菌落(菌落邊緣不整齊)，再接種到另一上述組成的LB固體培養(yǎng)基上，純培養(yǎng)后鑒定，得到枯草芽孢桿菌B115。
將枯芽孢桿菌B115接種于含4ml按重量由胰蛋白胨1％，牛肉膏0.25％，NaCl0.5％，余量為水，組成的液狀培養(yǎng)基(pH7.0～7.2)的試管內(nèi)，再將試管中的細(xì)菌接種于含上述液狀培養(yǎng)基250mL的錐形瓶內(nèi)，200轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)，30℃，21小時，得到菌液，此菌液中枯草芽孢桿菌B115濃度不小于5×109CFU/mL。
按重量將麩皮4％、豆餅粉3.5％、玉米粉5％和余量的水混勻后，高壓滅菌，冷卻后制成發(fā)酵培養(yǎng)基。將發(fā)酵培養(yǎng)基重量1％的上述菌液加入發(fā)酵培養(yǎng)基，混勻后平鋪于搪瓷托盆，料層厚度為1.5cm，托盤放在溫室的架子上，通過加溫增濕器調(diào)節(jié)溫室空間的溫度和濕度，同時不斷通入低壓無菌空氣，使菌體進(jìn)行好氧發(fā)酵，時間24小時，得含菌糊漿。
按重量由沸石粉和礱糠粉按1∶1的比例混合，得填充料。將等重量的所述填充料和含菌糊漿混勻后，于40±1℃鼓風(fēng)式干燥箱中烘干，過18～20目篩，拌勻，制成粉末狀的制劑。經(jīng)測定該制劑的枯草芽胞桿菌B115為8.2×109個/g；再加所含填充料3倍重量的所述填充料，制成枯草芽孢桿菌B115制劑，其中含枯草芽孢桿菌B115 21×108個/g。
實施例2區(qū)別于例1的是，本例發(fā)酵培養(yǎng)基按其重量計組成為豆餅粉4％，麩皮5％，玉米粉5％和余量的水；填充料按重量由沸石粉∶米糠為2∶1混合組成，填充料與含菌糊漿混合后41℃烘干，測定粉末狀制劑其活菌含量為9.8×109個/g，再加所含填充料3倍重量所述的填充料，制成菌含量為24×108個/g的制劑。其它步驟與例的相同。
實施例3本例發(fā)酵培養(yǎng)基按其重量計組成為豆餅粉4％，麩皮4％，玉米粉3％和余量的水，發(fā)酵培養(yǎng)24小時；填充料按重量由高嶺土∶玉米芯粉為2∶1混合組成，測定粉末狀制劑其活菌含量為9.2×109個/g，再加所含填充料3倍重量所述的填充料，制成菌含量為22×108個/g的制劑。
實施例4本例發(fā)酵培養(yǎng)基按其重量計組成豆餅粉4％，麩皮2％，玉米粉4％和余量的水；填充料按重量由膨潤土∶麩皮為4∶1混合，填充料與含菌糊漿混合后40℃烘干，測定粉末狀制劑其活菌含量為7.8×109個/g，再加所含填充料2.5倍重量所述的填充料，制成菌含量為21×108個/g的制劑。
實施例5本例發(fā)酵培養(yǎng)基按其重量計組成為豆餅粉3％，麩皮5％，玉米粉3％和余量的水；填充料按重量由陶土∶豆粕粉為3∶1混合，填充料與含菌糊漿混合后41℃烘干，測定粉末狀制劑其活菌含量為7.6×109個/g，再加所含填充料2.5倍重量所述的填充料，制成菌含量為20×108個/g的制劑。
實施例6本例發(fā)酵培養(yǎng)基按其重量計組成為豆餅粉2％，麩皮3％和余量的水；填充料按重量由麥飯石粉∶花生粕為3∶1混合，填充料與含菌糊漿混合后40℃烘干，測定粉末狀制劑其活菌含量為6.8×109個/g，再加所含填充料2倍重量的沸石粉，制成菌含量為22×108個/g的制劑。
實施例7本例發(fā)酵培養(yǎng)基按其重量計組成為麩皮5％，玉米粉4％和余量的水；填充料按重量由沸石粉∶菜粕為3∶1混合，填充料與含菌糊漿混合后41℃烘干，測定粉末狀制劑其活菌含量為6.6×109個/g，再加所含填充料2倍重量的沸石粉，制成菌含量為21×108個/g的制劑。
實施例8本例發(fā)酵培養(yǎng)基按其重量計組成為豆餅粉3％，麩皮4％和余量的水；填充料為沸石粉混合，填充料與含菌糊漿混合后40℃烘干，測定粉末狀制劑其活菌含量為6.3×109個/g，再加所含填充料2倍重量的沸石粉，制成菌含量為20×108個/g的制劑。
實施例9本例發(fā)酵培養(yǎng)基按重量計組成為豆餅粉3％，玉米粉4％和余量的水；填充料為礱糠粉，填充料與含菌糊漿混合后41℃烘干，測定粉末狀制劑其活菌含量為9.8×108個/g，再加所含填充料3倍重量的大糠，制成菌含量為3×108個/g的制劑。
實施例10本例發(fā)酵培養(yǎng)基按重量計組成為豆餅粉2％，麩皮5％，玉米粉1.5％和余量的水；填充料為玉米芯粉，填充料與含菌糊漿混合后41℃烘干，測定粉末狀制劑其活菌含量為168×108個/g的制劑，再加所含填充料1倍重量的礱糠粉，制成菌含量為84×108個/g的制劑。
權(quán)利要求
1.枯草芽孢桿菌制劑，其特征是以其重量為基準(zhǔn)含有1.4～4.0％下述的發(fā)酵培養(yǎng)基固形物、86～90％下述的填充料和余量的水，所述的制劑中枯草芽孢桿菌B115(Bacillus subtilis B115 CGMCC No1210)含量為1～100×108個/克；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基固形物為豆餅粉、麩皮、玉米粉中的二種或三種的組合物；所述的填充料為礦粉、農(nóng)作物桔桿籽粒粉或礦粉和農(nóng)作物桔桿籽粒粉的組合物。
2.如權(quán)利要求
1所述的微生態(tài)改良劑，其特征是所述的礦粉為沸石粉、膨潤土、麥飯石粉、陶土、高嶺土中的一種或二種以上的組合物，所述的農(nóng)作物桔桿籽粒粉為礱糖粉、米糠、豆粕粉、麩皮、花生粕、菜粕、玉米芯粉中的一種或二種以上的組合物。
專利摘要
能有效改善養(yǎng)殖水質(zhì)、降低水中有毒有害物質(zhì)、對魚類無毒性和致病性、提高養(yǎng)殖效益的枯草芽孢桿菌制劑，以其重量為基準(zhǔn)含有1.4～4.0％下述的發(fā)酵培養(yǎng)基固形物、86～90％下述的填充料和余量的水，所述的制劑中枯草芽孢桿菌B115(Bacillus subtilis B115 CGMCC № 1210)含量為1～100×10
文檔編號C12N1/20GKCN1632105SQ200410101021
公開日2005年6月29日 申請日期2004年12月2日
發(fā)明者沈錦玉, 尹文林 申請人:沈錦玉, 尹文林導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan