專利名稱:編碼具有d-乳酸脫氫酶活性蛋白質(zhì)的dna及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及D-乳酸及一項利用D-乳酸生產(chǎn)聚合物的技術(shù)。更具體地說，本發(fā)明涉及適合用于酵母生產(chǎn)D-乳酸的具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)、具有編碼此種蛋白質(zhì)的核苷酸序列的DNA及其用途。
技術(shù)背景
隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，獲得目的基因產(chǎn)物的技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來。該技術(shù)通過允許外源基因在宿主如微生物、霉菌、動物、植物或昆蟲中表達(dá)以及允許所產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體繁殖得以實現(xiàn)。例如，當(dāng)采用酵母培養(yǎng)技術(shù)時，可通過發(fā)酵生產(chǎn)大量目的基因產(chǎn)物。
從“碳中性”的觀點(diǎn)來看，近年來一直期待著作為植物來源塑料原材料的乳酸的有效生產(chǎn)。
乳酸分為L-乳酸和D-乳酸，它們是光學(xué)異構(gòu)體。發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的技術(shù)已為大家所知，該技術(shù)利用能夠生產(chǎn)D-乳酸的乳酸菌在含有釀酒酵母的培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸 (日本專利公開號(Kokai) 58-16688A (1983))。一項利用保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)的技術(shù)也已為大家所知(日本專利公開號(Kokai) 58-36394 A(1983))。一項獲得高光學(xué)純度D-乳酸的技術(shù)也已經(jīng)公開(日本專利公開號(Kokai)6H93387A(1986)、 4-271787A(1992)和2001-29063 (A))。由于此種生產(chǎn)乳酸的微生物的生產(chǎn)率低并且需要復(fù)雜的培養(yǎng)基成份，所以不適于乳酸的工業(yè)生產(chǎn)。
也已經(jīng)公開了另一項技術(shù)，通過該技術(shù)將乳酸脫氫酶基因摻入到不產(chǎn)生乙醇或乙醇產(chǎn)生能力降低的酵母菌株中，并且所得的重組體用于生產(chǎn)乳酸(日本專利公布號 (Kokai) 2001-516584 (A))。然而，該技術(shù)只公開了 L-乳酸的生產(chǎn)。此外，一項生產(chǎn)D-乳酸的技術(shù)也已經(jīng)公開，由此將D-乳酸脫氫酶基因?qū)肽軌蚋呷萘可a(chǎn)丙酮酸的酵母中(日本專利公開號(Kokai) 2002-136293 (A))。但是，該技術(shù)關(guān)注的是在能夠高容量生產(chǎn)丙酮酸的酵母菌株中的高度濃縮的丙酮酸。因此，其中并未描述通過普通酵母的生產(chǎn)。
本發(fā)明提供了一種編碼用于生產(chǎn)D-乳酸并具有乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸，并且還提供了此種蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明提供了使用此種多核苷酸生產(chǎn)D-乳酸的優(yōu)良系統(tǒng)以及有效生產(chǎn)D-乳酸的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明人尋找了 D-乳酸脫氫酶及允許此酶表達(dá)的基因。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)了一種表現(xiàn)出優(yōu)秀D-乳酸生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化系。更具體地說，他們發(fā)現(xiàn)了能夠正向影響D-乳酸產(chǎn)量并具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)、編碼具有此種酶活性的蛋白質(zhì)的DNA以及自此種DNA制備的轉(zhuǎn)化體。此外，他們發(fā)現(xiàn)了使用相同轉(zhuǎn)化系生產(chǎn)D-乳酸的方法和生產(chǎn)聚乳酸的方法。
基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供下列內(nèi)容。
(1)在下列(a)-(g)中任意一項所述的多核苷酸
(a)包含SEQ ID NO=I所示核苷酸序列的多核苷酸；[0012](b)在嚴(yán)格條件下能與包含SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的全部或部分或其互補(bǔ)鏈的探針雜交并編碼具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；
(c)編碼由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸；
(d)編碼包含通過替代、缺失、插入或者添加一個或幾個氨基酸殘基而自SEQ ID NO 2所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列并具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；
(e)編碼與SEQ ID NO 2所示氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；
(f)編碼具有通過選自表1所示氨基酸殘基替代列表中的一個或多個氨基酸殘基的替代而由SEQ ID NO 4所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列并且具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸
表1 氨基酉I殘基替代列表[0018]替代類型替代位置氨基酸:替代[0019]140纈氨酸(Val)[0020]2112異亮氨I酸(Ile)[0021]3131組氨酸(His)[0022]4139異亮氨I酸(Ile)[0023]5181谷氨酸(Glu)[0024]6266甘氨酸(Gly)[0025]7267亮氨酸(Leu)[0026]8268苯丙氨I酸(Phe)[0027]9269天冬酰胺(Asn)[0028]10270谷氨酸(Glu)[0029]11271天冬氨I酸(Asp)[0030]12272色氨酸(Trp)[0031]13273絲氨酸(Ser)[0032]14274甘氨酸(Gly)[0033]15276谷氨酸(Glu)[0034]16277苯丙氨I酸(Phe)[0035]17287絲氨酸(Ser)[0036]18292亮氨酸(Leu)[0037]19293纈氨酸(Val)[0038]其中替代位置表示為從對應(yīng)于起始密碼子的[0039](g)編碼具有至少包含SEQ ID NO 2所示氨^
296位氨基酸殘基的氨基酸序列并具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
(2)在下列(h)-(l)中任意一項所述的蛋白質(zhì)
(h)由序列表SEQ ID NO 2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(i)由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列通過替代、缺失、插入或添加一個或幾個氨基酸殘基而衍生的氨基酸序列組成的并具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)；
(j)與SEQ ID NO 2所示氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)；
(k)具有通過選自表1所示氨基酸殘基替代列表中一個或多個氨基酸替代自SEQ ID NO 4所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列并具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)；或
(1)具有至少包含SEQ ID NO 2所示氨基酸序列中78和79,152-175,235和296 位氨基酸殘基的氨基酸序列并具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
(3)包含含有(1)中DNA的DNA片段以及含有編碼啟動子或其相同物的DNA片段的DNA構(gòu)建體。
(4)根據(jù)(3)的DNA構(gòu)建體，其中啟動子來自丙酮酸脫羧酶基因。
(5)根據(jù)(3)或(4)的DNA構(gòu)建體，其中啟動子來自酵母屬(Saccharomyces)的丙酮酸脫羧酶1基因。
(6)根據(jù)(5)的DNA構(gòu)建體，其中啟動子來自釀酒酵母(Saccharomycescerevisae) 丙酮酸脫羧酶1基因。
(7)以在宿主中可表達(dá)方式攜帶(1)中DNA的轉(zhuǎn)化體。
(8)根據(jù)(7)的轉(zhuǎn)化體，其中宿主是選自包括酵母和真菌在內(nèi)的真核微生物和包括乳酸菌、埃希氏菌屬(Escherichiai)細(xì)菌和芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌在內(nèi)的原核微生物的微生物。
(9)根據(jù)(7)或⑶的轉(zhuǎn)化體，其中DNA以在啟動子或其相同物控制下的一種可表達(dá)方式攜帶。
(10)根據(jù)(9)的轉(zhuǎn)化體，其中啟動子來自丙酮酸脫羧酶基因。
(11)根據(jù)(9)或(10)的轉(zhuǎn)化體，其中啟動子來自酵母屬丙酮酸脫羧酶1基因。
(12)根據(jù)(11)的轉(zhuǎn)化體，其中DNA以在宿主丙酮酸脫羧酶1基因啟動子控制下可表達(dá)的方式攜帶。
(13)根據(jù)(7)-(1 中任意一項所述的轉(zhuǎn)化體，其中宿主微生物是釀酒酵母。
(14) 一種生產(chǎn)D-乳酸的方法，包括步驟
培養(yǎng)(7)-(13)中任意一項所述的轉(zhuǎn)化體；和
從培養(yǎng)產(chǎn)物中回收選自D-乳酸、其鹽及其衍生物中的至少一種組分。
(15) 一種生產(chǎn)乳酸聚合物的方法，包括步驟
培養(yǎng)(7)-(13)中任意一項所述的轉(zhuǎn)化體；
從培養(yǎng)產(chǎn)物中回收選自D-乳酸、其鹽及其衍生物中的至少一種組分；和
使用回收的D-乳酸或其衍生物作為至少一種聚合材料生產(chǎn)乳酸聚合物。
本說明書包括在日本專利申請?zhí)?003-145085的說明書和/或附圖中公開的部分或全部內(nèi)容，它是本專利申請的優(yōu)先權(quán)文件。
附圖簡述
圖IA顯示SEQ ID NO 1所示核苷酸序列與SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的同源性資料。
圖IB是圖IA的繼續(xù)，顯示SEQ ID NO :1所示核苷酸序列與SEQ IDNO 3所示核苷酸序列的同源性資料。
圖2顯示SEQ ID NO 2所示氨基酸序列與SEQ ID NO :4所示氨基酸序列的同源性資料。[0069]圖3顯示構(gòu)建pBTRP-PDCI-DLDHME載體的部分過程。
圖4顯示構(gòu)建pBTRP-PDCI-DLDHME載體的部分過程。
圖5顯示構(gòu)建pBTRP-PDCI-DLDHME載體的部分過程。
圖6顯示構(gòu)建pBTRP-PDCI-DLDHME載體過程的最后步驟。
圖7顯示在實施例3中獲得的二倍體轉(zhuǎn)化酵母菌株的部分染色體結(jié)構(gòu)。
圖8是顯示由親本菌株和染色體上整合有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的D-乳酸鹽(鈣鹽)的發(fā)酵試驗結(jié)果的圖，該圖顯示了每個菌株產(chǎn)生的D-乳酸鹽和乙醇的量。
圖9是顯示由親本菌株、染色體上整合有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化體及自主復(fù)制質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的游離D-乳酸的發(fā)酵試驗結(jié)果的圖，該圖顯示了每個菌株產(chǎn)生的D-乳酸和乙醇的量。

圖10是顯示由導(dǎo)入2個拷貝D-LDHME基因的菌株和導(dǎo)入4個拷貝D-LDHME基因的菌株產(chǎn)生的游離D-乳酸的發(fā)酵試驗結(jié)果的圖，該圖顯示了每個菌株產(chǎn)生的D-乳酸和乙醇的量。
本發(fā)明的實施方案
本發(fā)明的多核苷酸包含編碼具有D-乳酸脫氫酶(D-LDH)活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
使用本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)致產(chǎn)生表達(dá)上述蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體和生產(chǎn)D-乳酸的轉(zhuǎn)化體。同樣，也可以通過使用涉及本發(fā)明多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)的酶反應(yīng)系統(tǒng)生產(chǎn)D-乳酸。
根據(jù)本發(fā)明，可以提供D-乳酸生產(chǎn)原材料的新的來源。根據(jù)本發(fā)明還可以高選擇性或高效率地生產(chǎn)D-乳酸。
因此，本發(fā)明可提供使用酶反應(yīng)系統(tǒng)生產(chǎn)乳酸聚合物的技術(shù)，其涉及使用本發(fā)明蛋白質(zhì)或允許表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的D-乳酸。
以下描述本發(fā)明的多核苷酸、蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)化體、生產(chǎn)D-乳酸的方法等。
本發(fā)明的多核苷酸包括以下任意一條。
即
(a)包含SEQ ID NO=I所示核苷酸序列的多核苷酸；
(b)在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的全部或部分或其互補(bǔ)鏈的探針雜交并編碼具有D-乳酸脫氫酶(D-LDH)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；
(c)編碼具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸；
(d)編碼由自SEQ ID NO :2所示氨基酸序列通過替代、缺失、插入或添加一個或幾個氨基酸殘基而衍生的氨基酸序列組成的并具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；
(e)編碼與SEQ ID NO 2所示氨基酸序列具有70%或更高同源性并具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；
(f)編碼具有通過選自表1所示氨基酸殘基替代列表中的一個或多個氨基酸殘基的替代而自SEQ ID NO :4所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列并具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；或
(g)編碼具有至少包含SEQ ID NO 2所示氨基酸序列中78和79、152_175、235和 296位氨基酸殘基的氨基酸序列并具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
由本發(fā)明SEQ ID NO :1所示核苷酸序列組成的多核苷酸編碼具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。并且，此種多核苷酸來源于一種乳酸細(xì)菌腸膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)。更具體地說，此種多核苷酸來源于腸膜明串珠菌IF03^6 株(注冊于 Institute forFermentation)。
該多核苷酸序列與GenBank注冊的的序列(GenBank登錄號U9327)有27bp核苷酸的差別。結(jié)果，該多核苷酸編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)與注冊核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO 4)有19個氨基酸殘基不同。SEQ ID NO :1所示核苷酸序列與SEQ ID NO :3所示核苷酸序列有97. 3%的同源性。SEQ ID NO :2所示氨基酸序列與SEQ ID NO 4所示氨基酸序列有94. 3%的同源性。此種同源性是使用Genetyx-mac 10. 1版(Software Development Co. , Ltd.)計算的。
本發(fā)明涉及編碼具有D-LDH活性蛋白質(zhì)的多核苷酸。在本發(fā)明中，此種多核苷酸可以是天然存在的多核苷酸如DNA或RNA。備選地，此種多核苷酸可以包含人工合成的核苷酸衍生物。它可以是單鏈的或者是具有互補(bǔ)鏈。
根據(jù)本發(fā)明的實施方案，多核苷酸具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列。SEQ ID N0 1所示多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明多核苷酸的另一個實施方案，多核苷酸編碼具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。具有編碼SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸是符合條件的。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案，多核苷酸由自SEQ ID NO :2所示氨基酸序列通過一個或幾個氨基酸殘基的替代、缺失、插入或者添加而衍生的氨基酸序列組成并且具有編碼具有D-LDH活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列?？梢酝茢嗑哂凶許EQ ID NO :2所示氨基酸序列通過替代、缺失、插入或者添加一個或幾個氨基酸殘基而衍生的氨基酸序列的多核苷酸會具有與擁有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多核苷酸的相同的D-LDH活性。這是因為來自于SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的D-LDH活性推斷與由其通過替代、缺失、插入或者添加一個或幾個氨基酸殘基衍生的氨基酸序列的D-LDH活性相當(dāng)。通過這種氨基酸替代等方法， 本領(lǐng)域技術(shù)人員能正常地篩選具有D-LDH活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在本發(fā)明中可得到充分利用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員通過定點(diǎn)誘變(NucleicAcid Res.，10，6487 頁，1982 ;Methods in Enzymol. , 100,448 Jit, 1983 ；Melecular Cloning,第二 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ；PCR :A Practical Approach, IRL Press，200 頁，1991)或通過其它方法適當(dāng)?shù)貙⑼蛔兝缣娲?、缺失、插入、?或添加引入具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的多核苷酸中?！皫讉€氨基酸”優(yōu)選地是約2-10個氨基酸殘基，并且更優(yōu)選地是約2-4 個氨基酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案，多核苷酸在嚴(yán)格條件下能與包含SEQID NO 1所示核苷酸序列的全部或部分或其互補(bǔ)鏈的探針雜交并編碼具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。能在嚴(yán)格條件下與此種多核苷酸雜交的探針至少包含由由SEQ ID N0:1所示序列中20 或以上、優(yōu)選地30或以上(例如40、60或100)連續(xù)核苷酸組成的任意一個DNA序列。多核苷酸可在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :1所示DNA或此類探針雜交。例如，在嚴(yán)格條件下，雜交在約37°C及50%甲酰胺存在下進(jìn)行。在更嚴(yán)格的條件下，雜交在約42°C進(jìn)行。在進(jìn)一步嚴(yán)格的條件下，雜交在約65°C及甲酰胺存在下進(jìn)行。[0100]能在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 1所示核苷酸序列組成的DNA或探針雜交的多核苷酸實例是具有與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列相似的核苷酸序列的多核苷酸。此種多核苷酸很可能編碼與那些由SEQ ID NO :2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有相同功能的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案，多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)與SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列顯示70%或更高，優(yōu)選地80%或更高，更優(yōu)選地90%或更高，并且進(jìn)一步優(yōu)選地95%或更高的同源性，并且具有D-乳酸脫氫酶活性。使用基因分析程序BLAST(超鏈接http://blast· genome, ad. jphttp://blast· genome, ad. jp)、FASTA (超鏈接http:// fasta. genome, ad. jp/SIT/FASTA. htmlhttp: //fasta. genome, ad. jp/SIT/FASTA. html)等進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性檢索。此處使用的術(shù)語“同源性”是指通過這些程序觀察到的同一性。
本發(fā)明的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)具有通過選自表1所示氨基酸殘基替代列表中的一個或多個氨基酸殘基的替代自SEQ ID NO :4所示氨基酸序列而衍生的的氨基酸序列并具有D-乳酸脫氫酶活性。SEQ ID NO :4所示氨基酸序列是注冊于GenBank的腸膜明串珠菌的D-LDH序列(GenBank登錄號L29327)。SEQ ID NO 2所示氨基酸序列是通過選自表1 所示氨基酸殘基替代列表中標(biāo)明的全部替代而自SEQ ID NO :4所示氨基酸序列衍生而來。 然而，即使沒有對氨基酸序列進(jìn)行全部替代，也可以獲得可以在本發(fā)明中使用的具有D-LDH 活性的蛋白質(zhì)。替代的數(shù)目優(yōu)選地是2個或以上，更優(yōu)選地是11個或以上，并且更優(yōu)選地是19個或以上。
在表1所示的氨基酸殘基替代列表中，優(yōu)選地是替代類型1-19所指的氨基酸殘基替代。更優(yōu)選地是替代類型6-16所指的氨基酸殘基替代。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案，多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)具有至少含有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列中的78和79、152-175、235和296位氨基酸殘基的氨基酸序列并具有 D-LDH活性。78和79、152-175、235和296位氨基酸殘基被認(rèn)為是SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的特征。當(dāng)一個多核苷酸含有此種氨基酸序列并具有D-LDH活性時，可以說它是本發(fā)明優(yōu)選的多核苷酸。更優(yōu)選地，多核苷酸具有在296位作為活性中心的組氨酸殘基以及由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列中152-175位氨基酸殘基組成的輔酶NADH結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
如上所述，本發(fā)明的多核苷酸除了是由SEQ ID NO 1所示核苷酸序列組成的或包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列以外，可以是具有與上述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)的功能具有相同功能的多核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸可通過以上提及的多種技術(shù)獲得。此外，該多核苷酸可以化學(xué)合成，或者根據(jù)SEQ ID NO :1所示核苷酸序列通過PCR克隆、雜交等從其它生物獲得。例如，多核苷酸可從原核生物如乳酸菌、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或真菌來源的蛋白質(zhì)或者真核生物如酵母或章魚來源的蛋白質(zhì)中分離。備選地，可以采用Fujimoto等的方法，此方法已知用于合成長鏈 DNA(Hideya Fujimoto, "Gousei idenshi no sakuseihou(Production of synthetic genes)，，，Shokubutsusaibo kogaku (Plant Cell Technology)，叢書 7，Shokubutsu no PCR jikkenpurotokoru (Protocol of plant PCR experiments)，1997，95-100頁，Shujunsha)。
在本發(fā)明中，多核苷酸沒必要是由SEQ ID NO :1所示核苷酸序列組成的多核苷酸的同系物。這是因為導(dǎo)入此種多核苷酸的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是用于生產(chǎn)D-LDH和D-乳酸。[0108]例如，不管多核苷酸是否具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列或者是其同系物，還可以采用編碼來源于原核生物如乳酸菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或真菌的具有D-LDH活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸或者編碼來源于真核生物如酵母或章魚的具有D-LDH活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
(蛋白質(zhì))
本發(fā)明的蛋白質(zhì)由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列組成或者包含SEQID NO 2所示氨基酸序列。此種蛋白質(zhì)是本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，蛋白質(zhì)由SEQ ID NO :2所示氨基酸序列通過一個或幾個氨基酸殘基的替代、缺失、插入或添加而衍生的氨基酸序列組成并具有D-乳酸脫氫酶(D-LDH)活性。根據(jù)進(jìn)一步的實施方案，蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與SEQ ID NO :2所示氨基酸序列具有70 %或更高，優(yōu)選地80 %或更高，更優(yōu)選地90 %或更高并且進(jìn)一步優(yōu)選地95 %或更高的同源性并且具有D-LDH活性。
根據(jù)進(jìn)一步的實施方案，蛋白質(zhì)具有通過選自表1所示氨基酸殘基替代列表中的一個或多個氨基酸殘基替代自SEQ ID NO :4所示氨基酸序列而衍生的氨基酸序列并具有 D-LDH活性。SEQ ID NO 4所示氨基酸序列是注冊于GenBank的腸膜明串珠菌的D-LDH的序列(GenBank登錄號L29327)。SEQ ID NO :2所示氨基酸序列是通過表1所示氨基酸殘基替代列表中所示的全部替代自SEQ ID NO :4所示氨基酸序列衍生的。然而，即使沒有對氨基酸序列進(jìn)行全部替代，仍然可以獲得本發(fā)明中使用的具有D-LDH活性的蛋白質(zhì)。替代數(shù)目優(yōu)選地是2個或以上，更優(yōu)選地11個或以上并且進(jìn)一步優(yōu)選地19個或以上。
氨基酸序列優(yōu)選地是具有表1所示氨基酸殘基替代列表中替代類型1-19所示的氨基酸替代，并且更優(yōu)選地是具有替代類型6-16所示的氨基酸替代。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案，蛋白質(zhì)包含至少含有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的78和79、152-175、235和296位氨基酸殘基的氨基酸序列并具有D-乳酸脫氫酶 (D-LDH)活性。78和79、152-175、235和296位氨基酸殘基被認(rèn)為是SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的特征。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)包含此種氨基酸序列并具有D-LDH活性時，可以說它是本發(fā)明優(yōu)選的蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，蛋白質(zhì)具有在296位作為活性中心的組氨酸殘基和由SEQ IDNO 2所示氨基酸序列的152-175位氨基酸殘基組成的輔酶NADH結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)沒必要由SEQ ID NO 2所示核苷酸序列組成，只要它具有D-LDH 活性即可。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以通過培養(yǎng)腸膜明串珠菌IF03^6株獲得。具體而言，蛋白質(zhì)可以作為其培養(yǎng)產(chǎn)物得到。此菌株可通過常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)能按照常規(guī)技術(shù)從培養(yǎng)產(chǎn)物中純化。備選地，培養(yǎng)產(chǎn)物本身或者細(xì)菌可以回收并用作本發(fā)明具有酶活性的物質(zhì)。可以使用細(xì)菌、純化酶或粗純化酶，因為它們是固定化的或者可以固定化。
可以通過例如定點(diǎn)誘變(Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel 等著，8. 1-8. 5節(jié)，1987，John Wily & Sons)向SEQ ID NO :2所示氨基酸序列或其它氨基酸序列中適當(dāng)?shù)匾胪蛔內(nèi)缣娲⑷笔?、插入、?或添加來獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)。此種修飾并不限于人工誘變或合成。它還包括來自本質(zhì)上基于人工突變的氨基酸突變的產(chǎn)物，但也并不僅限于此。
此外，可以得到由SEQ ID NO 1所示核苷酸序列組成的多核苷酸或作為其同系物的DNA，此種DNA可以導(dǎo)入宿主菌株以制備轉(zhuǎn)化體，然后培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化體。因此，可以得到同系物蛋白質(zhì)。
例如，在本發(fā)明中，可以使用具有D-LDH活性的已知蛋白質(zhì)。可以使用的蛋白質(zhì)的實例包括來源于原核生物如乳桿菌(Lactobacillus)、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或真菌的蛋白質(zhì)或者來源于真核生物如酵母或章魚的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)沒必要具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列。它沒必要是由此種氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的同系物。以可表達(dá)方式攜帶具有D-LDH活性的蛋白質(zhì)的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是用于生產(chǎn)D-LDH和D-乳酸。
優(yōu)選的用于獲得本發(fā)明多核苷酸或者蛋白質(zhì)、本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞和為多核苷酸或蛋白質(zhì)的基因來源的細(xì)胞并不限于自天然存在的生物。通過突變等獲得的微生物或細(xì)胞可用作基因資源。
本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)具有D-LDH活性。例如，此種活性可以使用一種商業(yè)試劑盒 (乳酸脫氫酶(LDH/LD)測試-UV(Sigma))測定。
(DNA 構(gòu)建體)
編碼具有D-LDH活性蛋白質(zhì)的分離的多核苷酸(DNA，當(dāng)多核苷酸是DNA時在下文中稱作“D-LDH-DNA”)可用于制備含有此DNA片段的DNA構(gòu)建體。該DNA構(gòu)建體可以以此種狀態(tài)作為表達(dá)載體使用或者通過導(dǎo)入合適載體作為表達(dá)載體使用。用此DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。因此，獲得了產(chǎn)生D-LDH活性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體。此外，可培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體以生產(chǎn)具有D-LDH活性的蛋白質(zhì)。同樣還可以生產(chǎn)D-乳酸。
宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化涉及DNA構(gòu)建體的使用，所述DNA構(gòu)建體允許包含D-LDH-DNA的 DNA片段在宿主細(xì)胞中表達(dá)。對用于轉(zhuǎn)化的DNA構(gòu)建體的實施方案沒有特殊限制。根據(jù)所導(dǎo)入外源基因的形式(位于染色體外或位于染色體上)或宿主細(xì)胞的類型，可選擇質(zhì)粒 (DNA)、噬菌體(DNA)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(DNA)或人工染色體(例如，YAC、PAC、BAC或MAC)。因此，該DNA構(gòu)建體除了包含目的DNA外還包含上述任意一個實施方案所述載體的組成片段。 優(yōu)選的原核載體、真核載體、動物細(xì)胞載體和植物細(xì)胞載體為本領(lǐng)域公知。
質(zhì)粒DNA的實例包括YCp大腸桿菌-酵母穿梭載體，如pRS413、pRS415、pRS416、 YCp50、pAUR112或pAUR123 ；YEp大腸桿菌-酵母穿梭載體，如pYES32或YEpl3 ；YIp大腸桿菌-酵母穿梭載體，如 pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAURlOl 或 pAUR135 ；來源于大腸桿菌的質(zhì)粒(例如，CoIE 質(zhì)粒，如 pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC119、pTV118N、 pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396 或 pTrc99A ；plA 質(zhì)粒，如 pACYC177 或 pACYC184 ； 或pSClOl質(zhì)粒，如pMW118、pMW119、pMW218或pMW219)和來源于枯草芽孢桿菌的質(zhì)粒，如 pUBllO或pTP5。噬菌體DNA的實例包括λ噬菌體(例如，Charon4A、Charon21A、EMBL3、 EMBL4、AgtlOO、gtll 或 zap)、Φ X174、M13mpl8 和 M13mpl9。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的一個實例是 Ty因子。YAC的一個實例是pYACC2。
例如，目的DNA構(gòu)建體可通過用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖邢掳珼-LDH-DNA的片段并將其插入所使用載體DNA的限制性位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)來制備。
根據(jù)本發(fā)明的第一個實施方案，DNA構(gòu)建體包含與由D-LDH-DNA組成的DNA片段以可表達(dá)方式連接的啟動子片段。具體而言，這種DNA片段連接至啟動子的下游位點(diǎn)，以致于啟動子能夠控制此DNA片段。[0129]具有D-LDH活性的蛋白質(zhì)優(yōu)選地在酵母中表達(dá)。因此，優(yōu)選使用能夠在酵母中表達(dá)該蛋白質(zhì)的啟動子?？蓛?yōu)選使用的啟動子的實例包括丙酮酸脫羧酶基因啟動子、gall啟動子、gallO啟動子、熱激蛋白啟動子、MF α 1啟動子、ΡΗ05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、 ADH啟動子和AOXl啟動子。特別優(yōu)選的啟動子是來源于酵母屬的丙酮酸脫羧酶1基因的啟動子，更優(yōu)選地是使用來源于釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶1基因的啟動子。由這些啟動子誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)的表達(dá)在酵母(釀酒酵母)的乙醇發(fā)酵途徑中得到加強(qiáng)。通過PCR擴(kuò)增分離目的啟動子序列，其中使用酵母屬酵母的丙酮酸脫羧酶1基因的基因組DNA作為模板。例如， SEQ ID NO :5顯示了來源于釀酒酵母的啟動子的核苷酸序列。DNA構(gòu)建體中的啟動子片段可以是由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列組成的DNA、由通過缺失、替代、插入和/或添加一個或幾個核苷酸自SEQ ID NO :5所示核苷酸序列衍生的核苷酸序列組成并具有啟動子活性的DNA、或者能夠在嚴(yán)格條件下與包含SEQID NO 5所示核苷酸序列的全部或部分或其互補(bǔ)鏈的DNA雜交并具有啟動子活性的DNA(即，此種啟動子的相同物)。也可以使用來源于其它類型酵母或其它類型釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶基因或丙酮酸脫羧酶1基因的啟動子。
根據(jù)本發(fā)明的第二個實施方案，DNA構(gòu)建體除包含目的DNA以外還包含用于與宿主染色體同源重組的DNA片段。用于同源重組的DNA片段具有與位于目的DNA所插入的宿主染色體上的靶位點(diǎn)鄰近的DNA序列同源的DNA序列。DNA構(gòu)建體至少包含1個并且優(yōu)選是2個用于同源重組的DNA片段。例如，與位于染色體上靶位點(diǎn)上游和下游位點(diǎn)的DNA同源的DNA序列是作為用于同源重組的2個DNA片段提供的，并且目的DNA優(yōu)選地連接至這些DNA片段之間的位點(diǎn)。
當(dāng)通過同源重組將目的DNA導(dǎo)入宿主染色體時，此DNA以可被宿主染色體上的啟動子控制的方式導(dǎo)入。在這種情況下，靶基因的導(dǎo)入也可能破壞本應(yīng)由啟動子控制的內(nèi)源基因并且允許外源D-LDH-DNA的表達(dá)而不是內(nèi)源基因的表達(dá)。當(dāng)此種啟動子在宿主細(xì)胞中能增強(qiáng)表達(dá)時特別有用。
為了在宿主染色體上產(chǎn)生此種表達(dá)系統(tǒng)，將能夠增強(qiáng)表達(dá)的基因靶向宿主染色體上，并且優(yōu)選地是將D-LDH-DNA導(dǎo)入啟動子下游的位點(diǎn)，其中所述的啟動子以D-LDH-DNA可被此種啟動子控制的方式控制著目的基因。當(dāng)用乙醇發(fā)酵微生物如酵母作為宿主時，靶向地是丙酮酸脫羧酶基因(特別是丙酮酸脫羧酶1基因)，并且編碼具有LDH活性蛋白質(zhì)的 DNA可以導(dǎo)入至內(nèi)源丙酮酸脫羧酶基因啟動子控制下。在這種情況下，用于同源重組的DNA 片段可與丙酮酸脫羧酶1基因的LDH結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)域的序列或者其臨近的序列(包括啟始密碼子附近的序列、起始密碼子的上游序列、結(jié)構(gòu)基因序列等)同源。DNA構(gòu)建體可以包含丙酮酸脫羧酶基因啟動子的片段。
優(yōu)選地，使用酵母屬酵母(特別是釀酒酵母)作為宿主，并且制備了靶向該宿主的丙酮酸脫羧酶1基因的DNA構(gòu)建體。此種DNA構(gòu)建體破壞了丙酮酸脫羧酶1基因并且通過使用單一載體用D-LDH替代了該結(jié)構(gòu)基因部分。丙酮酸脫羧酶1是介導(dǎo)從丙酮酸到乙醛的不可逆反應(yīng)的一種酶。其基因的破壞能抑制丙酮酸到乙醛以及隨后到乙醇的轉(zhuǎn)變。通過使用丙酮酸作為底物也能夠加速通過D-LDH的D-乳酸的產(chǎn)生。
根據(jù)第一個實施方案的DNA構(gòu)建體也可以是通過包含用于與宿主染色體進(jìn)行同源重組的DNA片段而用于同源重組的DNA構(gòu)建體。在根據(jù)第一個實施方案的DNA構(gòu)建體的情況下，其啟動子片段也可以作為與宿主染色體進(jìn)行同源重組的DNA片段。例如，具有釀酒酵母宿主染色體啟動子的DNA構(gòu)建體(例如以丙酮酸脫羧酶1基因啟動子作為啟動子片段)構(gòu)成具有作為靶位點(diǎn)的宿主基因的尋靶載體。在此種情況下，DNA構(gòu)建體優(yōu)選地包含與位于丙酮酸脫羧酶1基因下游的結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)域序列同源的序列。
根據(jù)需要，除了終止子外，可將順式元件如增強(qiáng)子、剪接信號、多聚A添加信號、選擇標(biāo)記或核糖體結(jié)合序列(SD序列)連入DNA構(gòu)建體。對選擇標(biāo)記并不作特別限定，可以使用的多種常規(guī)選擇標(biāo)記基因包括藥物抗性基因和營養(yǎng)缺陷型基因。例如，可以使用二氫葉酸還原酶基因、潮霉素B基因和新霉素抗性基因。
(使用DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化)
一旦制備了 DNA構(gòu)建體，可以通過任意一種適當(dāng)?shù)募夹g(shù)如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、醋酸鋰法、粒子槍法、磷酸鈣沉淀、農(nóng)桿菌法、PEG法或直接微注射將此種DNA構(gòu)建體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞。在DNA構(gòu)建體導(dǎo)入后，在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)受體細(xì)胞。
宿主細(xì)胞的實例包括細(xì)菌如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌；酵母如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)；昆蟲細(xì)胞如sf9和sf21 ；動物細(xì)胞如COS細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)和植物細(xì)胞如甘薯和煙草。 優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是乙醇發(fā)酵微生物或抗酸微生物如酵母。其實例包括酵母屬酵母如釀酒酵母。其具體實例包括釀酒酵母IF02260株和YPH株。
由目的DNA構(gòu)建體制備的轉(zhuǎn)化體包含位于染色體或染色體外元件(包括人工染色體)的此種DNA構(gòu)建體組分。當(dāng)DNA構(gòu)建體在染色體外或通過隨機(jī)整合整合至染色體上維持時，以丙酮酸作為底物的另一種類型的酶的基因(其中丙酮酸也是LDH的底物)例如丙酮酸脫羧酶基因(及釀酒酵母中丙酮酸脫羧酶1基因)優(yōu)選地通過尋靶載體被敲除。
如果已導(dǎo)入上述能夠進(jìn)行同源重組的DNA構(gòu)建體，連接的D-LDH-DNA以啟動子能夠控制D-LDH-DNA的方式位于目的啟動子或由目的啟動子或其相同物替代的啟動子的下游位點(diǎn)。酵母屬酵母轉(zhuǎn)化體優(yōu)選地在宿主染色體上包含D-LDH-DNA，其中D-LDH-DNA以啟動子能夠控制D-LDH-DNA的方式位于丙酮酸脫羧酶1基因啟動子或由啟動子或其相同物替代的啟動子的下游位點(diǎn)。通常，同源重組體在D-LDH-DNA下游的位點(diǎn)包含選擇標(biāo)記基因或已破壞結(jié)構(gòu)基因的一部分(對應(yīng)于DNA構(gòu)建體上的同源序列的位點(diǎn))。
導(dǎo)入DNA構(gòu)建體的結(jié)果是產(chǎn)生了由D-LDH-DNA編碼的蛋白質(zhì)。在酵母的丙酮酸脫羧酶基因被破壞的同時，導(dǎo)入了在該基因啟動子或其相同物控制下的D-LDH。這導(dǎo)致原先不產(chǎn)生D-乳酸的酵母類型產(chǎn)生了 D-LDH，反過來D-LDH導(dǎo)致D-乳酸的產(chǎn)生。
更具體地說，將D-LDH-DNA導(dǎo)入酵母(具體而言是酵母屬，并且一般是釀酒酵母) 丙酮酸脫羧酶1基因啟動子或其相同物的下游位點(diǎn)可導(dǎo)致選擇性產(chǎn)生D-乳酸。據(jù)推斷如果D-LDH-DNA編碼具有D-LDH活性的蛋白質(zhì)，借助于此種啟動子D-LDH的表達(dá)得到增強(qiáng)，這種情況也正向作用于使D-乳酸的生產(chǎn)增強(qiáng)。相反，D-LDH-DNA編碼由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。由此推斷將導(dǎo)致D-乳酸的增強(qiáng)生產(chǎn)和/或選擇性生產(chǎn)。
可通過PCR、Southern雜交或其它方法驗證是否已經(jīng)將D-LDH-DNA導(dǎo)入至目的啟動子的下游位點(diǎn)。例如，可從轉(zhuǎn)化體制備DNA，利用用于基因定點(diǎn)誘變的引物對該DNA進(jìn)行 PCR，然后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳以檢測預(yù)期條帶。備選地，可以利用熒光染料等標(biāo)記的引物通過PCR驗證。還可以根據(jù)轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)驗證。這些技術(shù)均為本領(lǐng)域所公知。[0144]優(yōu)選地是制備通過導(dǎo)入一個DNA構(gòu)建體而將多拷貝D-LDH基因?qū)氲霓D(zhuǎn)化體。例如，當(dāng)制備酵母轉(zhuǎn)化體時，導(dǎo)入至少2拷貝并且優(yōu)選地是4-10拷貝D-LDH-DNA。導(dǎo)入多拷貝 D-LDH基因的轉(zhuǎn)化體顯著提高了 D-乳酸的生產(chǎn)能力。也就是說，使用導(dǎo)入多拷貝D-LDH基因的轉(zhuǎn)化體能導(dǎo)致D-乳酸生產(chǎn)力的顯著提高。
(D-乳酸的生產(chǎn))
培養(yǎng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體導(dǎo)致培養(yǎng)物中D-LDH的產(chǎn)生，D-LDH是外源基因的表達(dá)產(chǎn)物。這還進(jìn)一步導(dǎo)致D-乳酸的產(chǎn)生。通過分離乳酸的步驟能從培養(yǎng)產(chǎn)物中獲得乳酸。在本發(fā)明中，除了培養(yǎng)物上清以外培養(yǎng)產(chǎn)物的實例還包括培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)菌以及破壞的細(xì)胞或細(xì)菌。
在本發(fā)明中，D-乳酸可以選擇性產(chǎn)生，例如，使用最初不產(chǎn)生D-乳酸的酵母細(xì)胞類型作為宿主。使用發(fā)酵微生物對于獲取D-乳酸特別有效。由于其快速的生長率，來源于酵母的轉(zhuǎn)化體有效增強(qiáng)D-乳酸的生產(chǎn)。隨著對具有選擇性生產(chǎn)D-乳酸能力的轉(zhuǎn)化體的使用，不再需要分離光學(xué)異構(gòu)體，從而導(dǎo)致更加有效地生產(chǎn)D-乳酸。
根據(jù)轉(zhuǎn)化體的類型，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)。此種適當(dāng)條件為本領(lǐng)域公知。
作為用于培養(yǎng)從微生物宿主如大腸桿菌或酵母獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，天然的或者合成的培養(yǎng)基均可使用，只要它含有微生物可同化的碳源、氮源和無機(jī)鹽并且能夠有效培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體即可。碳源的實例包括碳水化物如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉和纖維素；有機(jī)酸如乙酸和丙酸；以及醇如乙醇和丙醇。氮源的實例包括氨、無機(jī)酸或有機(jī)酸的銨鹽如氯化銨、硫酸銨、醋酸銨和磷酸銨；其它含氮化合物；蛋白胨；肉湯提取物及玉米浸泡液。無機(jī)物的實例包括磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅和碳酸鈣。
通常，培養(yǎng)在有氧條件下(如振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng))于30°C培養(yǎng)適當(dāng)?shù)囊欢螘r間。例如，培養(yǎng)6-120小時。在培養(yǎng)過程中，pH值優(yōu)選地保持在2. 0-6.0?？捎脽o機(jī)酸或有機(jī)酸、堿性溶液等調(diào)節(jié)PH值。
用于培養(yǎng)從動物宿主細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基實例包括普通的RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和通過向上述培養(yǎng)基中添加胎牛血清等制備的培養(yǎng)基。通常，培養(yǎng)在有5% CO2條件下于37°C進(jìn)行1-30天。在培養(yǎng)過程中，如果需要可向培養(yǎng)基中加入抗生素如卡那
霉素或青霉素。
可以通過分批或連續(xù)系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)。還可以通過對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行堿中和(如用銨或鈣鹽)的方法進(jìn)行培養(yǎng)以獲得乳酸鹽如D-乳酸銨或D-乳酸鈣。備選地，培養(yǎng)產(chǎn)物可以是游離的D-乳酸。
培養(yǎng)完成之后，通過普通純化技術(shù)等的適當(dāng)組合能從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離基因產(chǎn)物 D-乳酸。例如，當(dāng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中產(chǎn)生了 D-乳酸，可通過傳統(tǒng)技術(shù)如超聲破碎、研磨或壓碎破壞細(xì)胞以便從這些細(xì)胞中分離基因產(chǎn)物。在這種情況下，可根據(jù)需要加入蛋白酶。當(dāng)D-乳酸產(chǎn)生于培養(yǎng)物上清中時，需對溶液進(jìn)行過濾、離心或其它方法以去除固體成分。
例如，在培養(yǎng)步驟結(jié)束后，可通過壓帶法、離心或壓濾中的至少一種方式對培養(yǎng)液進(jìn)行一步固相-液相分離。對分離后的濾液優(yōu)選地進(jìn)行純化。例如，在純化步驟中，含乳酸的濾液可進(jìn)行電透析以去除除乳酸和糖類以外的有機(jī)酸。因此，乳酸或乳酸銨的水溶液得以制備。在乳酸銨溶液的情況下，通過雙極膜等降解氨以便從氨水中分離乳酸水溶液。當(dāng)濾液中除乳酸外的有機(jī)酸含量或糖的含量相對少時，不要進(jìn)行電透析。在這種情況下，可根據(jù)需要通過蒸發(fā)水分對濾液進(jìn)行濃縮，并通過雙極膜使氨降解。
電透析時溶液的溫度一般在20°C -45°C，優(yōu)選地是35°C -40°C。不能通過電透析去除的氨基酸、無機(jī)離子(例如，K、Ca或Mg)和有機(jī)酸(例如，檸檬酸或蘋果酸)可在后期階段使用色譜分離器或離子交換劑去除。此外，如果需要可以對獲得的乳酸溶液進(jìn)行濃縮。 例如，蒸發(fā)溶液中的水分可獲得50% -90%的乳酸溶液。
從培養(yǎng)液或粗提物中分離和純化D-乳酸或其鹽的技術(shù)并不僅限于前面所述。多種純化和分離技術(shù)可用于分離和純化D-乳酸或其鹽，如使用有機(jī)溶劑分離和提取或蒸餾。 如果需要，可對培養(yǎng)液、粗提物及其純化產(chǎn)物進(jìn)行酯化反應(yīng)、丙交酯轉(zhuǎn)換、寡聚化、預(yù)聚合等。因此，可以獲得多種D-乳酸衍生物。根據(jù)需要可以從發(fā)酵的乳酸溶液中回收D-乳酸、 其鹽及其衍生物中的一種或多種。
也可以通過使用本發(fā)明所述的具有D-LDH活性的蛋白質(zhì)的酶反應(yīng)系統(tǒng)代替培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)D-乳酸。D-乳酸能夠在任何酶反應(yīng)條件下生產(chǎn)，只要酶反應(yīng)條件允許D-乳酸生產(chǎn)即可。多種誘導(dǎo)技術(shù)可應(yīng)用于通過此種技術(shù)獲得的D-乳酸。
(乳酸聚合物的產(chǎn)生)
獲得的D-乳酸、其鹽以及其衍生物可作為至少一種類型聚合材料使用以生產(chǎn)乳酸聚合物。可用作聚合材料的實例包括單體如D-乳酸或其衍生物以及由這種單體聚合至適當(dāng)長度形成的預(yù)聚物或低聚物。此外，也可以使用L-乳酸或其衍生物及其預(yù)聚物或低聚物。
乳酸聚合物的實例包括D-乳酸同聚物、D-乳酸和L-乳酸的雜聚物、 hetero-block聚合物及乳酸與其它聚合材料的多種類型的雜聚物。
這些乳酸聚合材料、或者乳酸聚合材料和另一種聚合材料可與適當(dāng)?shù)木酆弦l(fā)劑反應(yīng)產(chǎn)生乳酸聚合物。
根據(jù)本發(fā)明，選擇性和/或增強(qiáng)生產(chǎn)D-乳酸是可能的。因此，可有效獲得D-乳酸， 并因此導(dǎo)致以D-乳酸作為聚合物材料的乳酸聚合物的有效生產(chǎn)。
實施例
從此處開始將描述本發(fā)明的實例，但本發(fā)明并非僅限于此。在本發(fā)明的范圍內(nèi)可進(jìn)行多種修改。
實施例1 :D_乳酸脫氫酶基因的分離
分離了來源于原核乳酸細(xì)菌腸膜明串珠菌的D-乳酸脫氫酶基因(D-LDH基因，此后簡稱“D-LDHME基因”)。
以IF03426株(注冊于化8{行肚6 for Fermentation)的基因組DNA作為模板通過PCR擴(kuò)增分離該基因。使用基因組DNA制備試劑盒(Fast DNAKit, Bio 101)根據(jù)試劑盒內(nèi)的方法制備該菌株的基因組DNA。用Ultrospec3000分光光度計(Amersham Pharmacia Biotech)測定所制備基因組DNA的DNA濃度。
使用具有高正確性的KOD Plus DNA聚合酶(Toyobo Co.，Ltd)作為PCR的擴(kuò)增酶。反應(yīng)液(共50μ1)包含50ng先前制備的基因組DNA，各50pmol的兩種引物DNA，5y 1 10 X KOD 酶反應(yīng)緩沖液，2 μ 1 25mMMgS04, 5 μ 12mM dNTP 混合物和 1. 0 單位的 KOD plus DNA 聚合酶，用 PCR擴(kuò)增儀(Gene Amp PCR system 9700,PE Applied Biosystems)進(jìn)行 DNA擴(kuò)[0169]在下述條件下進(jìn)行PCR。首先于96°C進(jìn)行2分鐘的熱處理，接著進(jìn)行3階段溫度變化循環(huán)(96 °C，30秒；53°C，30秒和72 °C，90秒)。此循環(huán)重復(fù)25次，并且結(jié)束時溫度降至4°C。將反應(yīng)樣品(5 μ 1)用1 % TBE瓊脂糖凝膠(含0. 5 μ g/ml溴化乙錠)電泳，并且通過用2Mnm的紫外線(Fimakoshi)照射凝膠來檢測DNA條帶以確定擴(kuò)增的基因片段。
使用合成的DNA引物(Sawady Technology)進(jìn)行反應(yīng)，并且這些引物的DNA序列顯示如下。
· DLDEME-U (2 lmer, Tm {t 57. 2 °C )
5' -ATG AAG ATT TTT GCT TAC GGC—3' (SEQ ID NO 6)
· DLDEME-U (24mer，Tm 值 54. 7 °C )
5' -ATC TTA ATA TTC AAC AGC AAT AGC-3‘ (SEQ ID NO 7)
將PCR 擴(kuò)增的片段亞克隆入 pBluescriptll SK+載體(Toyobo Co.，Ltd.)。反應(yīng)根據(jù)一般的DNA亞克隆技術(shù)進(jìn)行。具體而言，用T4 DNA連接酶將在實施例1中得到的擴(kuò)增基因片段連接到用限制性酶EcoRV (Takara Shuzo Co.，Ltd.)和堿性磷酸酶去磷酸酶 (Takara Shuzo Co.，Ltd.)處理的上述載體中。使用！"4 DNA連接酶的反應(yīng)使用LigaFast RapidDNA Ligation(Promega)根據(jù)其附帶的方法進(jìn)行。
隨后，將連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。使用大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞 (Toyobo Co.，Ltd.)，并且根據(jù)其附帶的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB 平板上進(jìn)行菌落篩選，從每個篩選的菌落中制備質(zhì)粒DNA，并使用前述引物DNA對質(zhì)粒DNA 進(jìn)行 PCR 以亞克隆目的 D-LDH 基因。根據(jù) Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第二版，Maniatis 等編，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 中的指導(dǎo)進(jìn)行乙醇沉淀、限制性酶處理等。
測定獲得的D-LDH基因的核苷酸序列。使用儀器ABI PRISM 310Genetic Analyzer (ΡΕ Applied Biosystems)進(jìn)行核苷酸分析，并且根據(jù)儀器的說明書確定樣品的制備方法、儀器的使用以及其它條件。通過堿提取法制備包含所分離D-LDH基因的載體 DNA，然后使用GFX DNA純化試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)柱純化載體DNA，接著使用Ultrospec3000分光光度計(Amersham Pharmacia Biotech)測定DNA濃度，并且使用已進(jìn)行濃度調(diào)整的載體DNA。
通過序列分析確定的DNA序列顯示于SEQ ID NO :1，并且相應(yīng)的氨基酸序列顯示于 SEQ ID NO :2ο
將本實施例中分離的D-LDHME基因的核苷酸序列與已在GenBank中注冊的D-LDH 基因序列(GenBank登錄號L29327，來源于乳酸菌腸膜明串珠菌，SEQ ID NO 3)進(jìn)行比較。 結(jié)果顯示它們在氨基酸序列水平有19個氨基酸殘基的差異，在核苷酸序列水平有27bp核苷酸的差異。
圖IA和圖IB顯示了本實施例中獲得的D-LDHME基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)與已在GenBank中注冊的D-LDH基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 3)的同源性資料。上面的序列為本實施例獲得的D-LDHME基因的核苷酸序列，并且下面的序列為已在GenBank中注冊的D-LDH基因的核苷酸序列。
圖2顯示了對應(yīng)于本實施例獲得的D-LDHME基因核苷酸序列的氨基酸序列(SEQID NO 2)與對應(yīng)于已在GenBank中注冊的D-LDH基因核苷酸序列的氨基酸序列(SEQ ID NO 4)的同源性資料。上面的序列為對應(yīng)于本實施例中獲得的D-LDHME基因的氨基酸序列， 下面的序列為對應(yīng)于已在GenBank中注冊的D-LDH基因的氨基酸序列。 基于氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在本實施例中獲得基因的氨基酸序列有表2所示的氨基酸殘基替代。
0183] 表2 氨基酸殘基替代列表
0184]替代類型替代位置氨基酸替代0185]140纈氨酸(Val)0186]2112異亮氨酸(Ile)0187]3131組氨酸(His)0188]4139異亮氨酸(Ile)0189]5181谷氨酸(Glu)0190]6266甘氨酸(Gly)0191]7267亮氨酸(Leu)0192]8268苯丙氨酸(Phe)0193]9269天冬酰胺(Asn)0194]10270谷氨酸(Glu)0195]11271天冬氨酸(Asp)0196]12272色氨酸(Trp)0197]13273絲氨酸(Ser)0198]14274甘氨酸(Gly)0199]15276谷氨酸(Glu)0200]16277苯丙氨酸(Phe)0201]17287絲氨酸(Ser)0202]18292亮氨酸(Leu)0203]19293纈氨酸(Val)
0204]在本表中，替代位置表示為從對應(yīng)于起始密碼子的蛋氨酸開始的位置。
0205]實施例2 重組載體的構(gòu)建
0206]構(gòu)建了能夠表達(dá)目的基因(即在實施例1中獲得的D-LDHME基因)的染色體整合載體。載體能夠在來源于釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶1基因(PDCl)啟動子序列的控制下表達(dá)目的基因。這種新構(gòu)建的并進(jìn)行染色體整合的載體稱作PBTRP-PDC1-DLDHME載體。載體的構(gòu)建按照DNA亞克隆的一般技術(shù)進(jìn)行。
此后，本實施例中載體構(gòu)建過程的詳細(xì)描述參考圖3-6。
所有用于載體構(gòu)建的酶由Takara Shuzo Co.，Ltd生產(chǎn)。應(yīng)該指出可能的載體構(gòu)建過程并不僅限于該過程。
1. PDCl基因啟動子片段(PDClP)和PDCl基因下游片段(PDClD)的分離
對于載體構(gòu)建所必需的971-bp的PDCl基因啟動子片段(PDClP)和518_bp的PDCl 基因下游片段(PDClD)從基因來源如釀酒酵母IF02260株通過使用該株基因組DNA作為模板的PCR擴(kuò)增分離。IF02^0株注冊于hstitute for Fermentation。使用基因組DNA制備試劑盒(Fast DNA Kit,Bio 101)根據(jù)試劑盒內(nèi)的說明書制備該菌株的基因組DNA。使用Ultrospec3000分光光度計(Amersham Pharmacia Biotech)測定所制備基因組DNA的濃度。
用具有高正確性的KOD Plus DNA聚合酶(Toyobo Co.，Ltd)作為PCR的擴(kuò)增酶。 反應(yīng)液(共50 μ 1)包含50ng先前制備的IF02260株的基因組DNA，各50pmol的兩種引物 DNA, 5 μ 1 10XK0D 酶反應(yīng)緩沖液，2 μ 125mM MgSO4, 5 μ 1 2mM dNTP 混合物和 1. O 單位 KOD plus DNA聚合酶，用 PCR擴(kuò)增儀(Gene Amp PCR system 9700,PE Applied Biosystems)進(jìn)行DNA擴(kuò)增。
在下述條件下進(jìn)行PCR。首先于96°C進(jìn)行2分鐘的熱處理，接著進(jìn)行3階段的溫度變化循環(huán)(961，30秒；531，30秒和721，90秒)。該循環(huán)重復(fù)進(jìn)行25次，并且在結(jié)束時溫度降至4°C。反應(yīng)樣品(5 μ 1)在TBE瓊脂糖凝膠(含0.5 μ g/ml溴化乙錠)上電泳，通過用2Mnm的紫外線(Fimakoshi)照射凝膠來檢測DNA條帶以便確定擴(kuò)增的基因片段。
使用合成的DNA引物(Sawady Technology)進(jìn)行反應(yīng)，并且這些引物的DNA序列顯示如下。
[用于PDClP片段擴(kuò)增的引物]
· PDC1P-LDH-U(31mer, Tm 值 58. 3 °C )
5' -ATA TAT GGA TCC GCG TTT ATT TAC CTA TCT C_3' (SEQID NO 8)(下劃線部分=BamHI位點(diǎn))
· PDCIP-LDH-D (3 Imer，Tm 值 54. 4°C )
5' -ATA TAT GM TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G_3' (SEQID NO :9)(下劃線部分=EcoRI位點(diǎn))
[用于PDClD片段擴(kuò)增的引物]
· PDC1D-LDH-U(31mer, Tm 值 55. 3 °C )
5' -ATA TAT CTC GAG GCC AGC TAA CTT CTT GGT CGA C-3' (SEQ ID N0:10) (下劃線部分AhoI位點(diǎn))
· PDC1D-LDH-D (31mer, Tm 值 65. 2 °C )
5' -ATA TAT GGG CCC CCC CTC GAG GTC CCC CCT C_3' (SEQ ID NO :11)(下劃線部分ApaI位點(diǎn))
在上述反應(yīng)中獲得的PDClP和PDClD基因的擴(kuò)增片段通過乙醇沉淀純化，并且分別用限制性酶BamHI和EcoRI以及限制性酶BioI和ApaI酶切擴(kuò)增的PDClP片段和PDClD 片段°根據(jù)Molecular Cloning :ALaboratory Manual,第二版,Maniatis等編，Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989中的指導(dǎo)進(jìn)行乙醇沉淀和限制性酶切。
2. pBPDClP載體的構(gòu)建
用T4 DNA連接酶將通過PCR擴(kuò)增及限制性酶切的PDClP片段連接到用限制性酶 BamHI 和 EcoRI (Takara Shuzo Co.，Ltd.)以及堿性磷酸酶去磷酸酶(BAP) (Takara Shuzo Co.，Ltd.)處理的 pBluescriptll SK+ 載體(Toyobo Co.，Ltd.)上(圖 3，上面的部分)。 使用LigaFast Rapid DNALigation (Promega)根據(jù)其附帶的方法進(jìn)行！"4 DNA連接酶的反應(yīng)。[0227]隨后，將連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。使用大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞 (Toyobo Co.，Ltd.)根據(jù)其附帶的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。所得的培養(yǎng)液涂布于含ΙΟΟμ g/ml抗生素氨芐青霉素的LB平板上并培養(yǎng)過夜。使用引物DNA對長出的菌落進(jìn)行菌落PCR，并對通過微量制備方法制備的質(zhì)粒DNA溶液進(jìn)行限制性酶處理以確定插入的片段然后分離目的 PBPDC1P載體(圖3，中間部分)。
3. pBPDClP-LDHI 載體的構(gòu)建
如圖3所示，可以通過使用限制性酶EcoRI和AatII以及末端修飾酶(即 T4 DNA聚合酶)處理由Toyota Motor公司構(gòu)建的pYLDl載體(日本專利公布號 (Kokai) 2001-204468 (A))獲得 LDH 基因(來源于長雙歧桿菌(Bifidobacterium Iongum)) 片段，并將其亞克隆至已經(jīng)如上述方式用限制性酶EcoRI及末端修飾酶(即T4 DNA聚合酶)進(jìn)行過相似處理的PBPDCIP載體中。因此，pBPDClP-LDHI載體得以制備(圖3，中間至下面部分)。將上述的PYLDl載體導(dǎo)入大腸桿菌(命名“大腸桿菌pYLDl”)，并且依照布達(dá)佩斯條約于1999年10月沈日國際保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所 (National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)專利生物保藏 Φ·1^ (International Patent OrganismDepositary) (Tsukuba Central 6，1—1—1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki，305-8566，日本)，保藏號為 FERM BP-7423 (原始保藏)。
4. pBPDClP-LDH 載體的構(gòu)建
如圖4所示，將用限制性酶BioI和ApaI處理的pBPDClP-LDHI載體與用限制性酶進(jìn)行同樣處理的擴(kuò)增PDClD片段連接以制備pBPDClP-LDHII載體(圖4，上面部分)。
隨后，將用EcoRV和T4 DNA聚合酶處理的pBPDClP-LDHII載體和通過用AatII 和kpl以及T4 DNA聚合酶處理pRS404載體(ftOmega)獲得的Trp標(biāo)記片段連接以制備 pBTRP-PDCI-LDH載體(圖4，下面部分)。
5. pBTRP-PDClPII 載體的構(gòu)建
如圖5所示，將現(xiàn)有的pBPDClP載體用限制性酶HincII和堿性磷酸酶去磷酸化酶處理。pBTrp-PDCl-LDH載體用限制性酶ApaI和AflII處理然后用末端修飾酶即T4 DNA 聚合酶處理以產(chǎn)生含有trp標(biāo)記的片段。將該片段連接到處理后的pBPDClP載體中以構(gòu)建 pBTRP-PDClPII 載體。
6. pBTRP-PDCI-DLDHME 載體的構(gòu)建
如圖6所示，pBTRP-PDClPII載體用限制性酶EcoRV處理后再用末端修飾酶即T4 DNA聚合酶處理，并與在實施例1中分離的D-LDHME基因片段連接以構(gòu)建最終載體，即染色體整合的pBTRP-PDCI-DLDHME載體。
至于其它的D-LDH基因，根據(jù)來自乳酸細(xì)菌腸膜明串珠菌的D-LDH基因數(shù)據(jù)庫中 GenBank登錄號為L29327的基因序列(SEQ ID NO 幻進(jìn)行了寡核苷酸合成。將這些寡核苷酸相繼連接以完全合成目的D-LDH基因。對所得的基因片段進(jìn)行與本實施例中的那些同樣的處理以構(gòu)建染色體整合的載體。
實施例3 酵母的轉(zhuǎn)化
將缺乏色氨酸合成能力的酵母宿主菌IF02^0株(注冊于Institute forFermentation)在IOml YPD培養(yǎng)基中于30°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細(xì)胞并用TE 緩沖液洗滌。隨后，加入0.5ml TE緩沖液和0.5ml 0. 2M醋酸鋰，將所得物于30°C振蕩培養(yǎng)1小時，然后加入已經(jīng)用限制性酶ApaI和SpeI (Takara Shuzo Co.，Ltd.)處理的 pBTRP-PDCl-DLDHME。
所得的懸液于30°C振蕩培養(yǎng)30分鐘，然后向其中加入150μ 1 70%的聚乙二醇 4000 (Wako Pure Chemical hdustries，Ltd.)，并徹底攪動混合物。再進(jìn)一步于 30°C振蕩培養(yǎng)1小時，培養(yǎng)產(chǎn)物于42°C熱激處理5分鐘，然后將細(xì)胞在Iml YPD培養(yǎng)基中于30°C培養(yǎng)12小時。將培養(yǎng)液洗滌后懸浮于200 μ 1無菌水中。然后將所得懸液涂布于色氨酸選擇
培養(yǎng)基上。
將產(chǎn)生的菌落用新的色氨酸選擇培養(yǎng)基再次分離，并且選擇保持色氨酸合成能力的菌株作為候選轉(zhuǎn)化體。將這些菌株在YPD培養(yǎng)液中培養(yǎng)并用基因組DNA制備試劑盒O^ast DNA Kit, Bio 101)制備其基因組DNA。對基因組DNA進(jìn)行PCR以確定轉(zhuǎn)基因的存在或不存在。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了具有導(dǎo)入至啟動子下游的D-LDHME基因的菌株。
將獲得的導(dǎo)入了轉(zhuǎn)基因的菌株涂布于誘導(dǎo)孢子形成的培養(yǎng)基上，于30°C連續(xù)4 天誘導(dǎo)孢子形成。從培養(yǎng)基上收集細(xì)胞，并向其中加入5單位酶解酶(Zymolyase) (Zymo Research Corp.)，酶反應(yīng)于37°C進(jìn)行1小時，然后用顯微鏡(Olympus Corporation)和顯微操作器(Narishige ScientificInstrument Laboratory)在 YPD 培養(yǎng)基上分離孢子。檢查所獲得孢子后代菌株的色氨酸標(biāo)記選擇能力，并且進(jìn)行PCR以確定它們表現(xiàn)2 2分離。 因此，獲得了目的二倍體菌株。二倍體菌株是TC14-6-1A、TC14-6-2A和TC14-6-3A株。獲得的二倍體菌株在酵母染色體上具有圖7所示的結(jié)構(gòu)。
關(guān)于在實施例2中構(gòu)建的其它D-LDH基因的染色體整合載體，以相似方法將基因?qū)肴狈ι彼岷铣赡芰Φ腎F02260株，并通過PCR發(fā)現(xiàn)了染色體上整合有D-LDH的 TC20-1-1A 株。
作為對照，將DLDHME導(dǎo)入酵母自主復(fù)制2 μ質(zhì)粒載體pYPDl質(zhì)粒，以構(gòu)建自主復(fù)制載體。所得的載體以相似的方法導(dǎo)入IF02260株，并通過PCR發(fā)現(xiàn)了含有包含D-LDH基因的質(zhì)粒的TC21-1株。
實施例4 轉(zhuǎn)化體中D-乳酸生產(chǎn)的確認(rèn)
對在實施例3中制備的5種類型的轉(zhuǎn)化體和親本菌IF02260株進(jìn)行發(fā)酵試驗。將這些菌株接種于5ml YPD液體培養(yǎng)基中，于30°C，130轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)過夜，并制備發(fā)酵生產(chǎn)必需的細(xì)胞。
收集接種的細(xì)胞，將收集的細(xì)胞以0.5%的細(xì)胞濃度接種于含10%葡萄糖的YPD 液體培養(yǎng)基中，于30°C靜止發(fā)酵4天。在該發(fā)酵試驗中，測試2種類型的生產(chǎn)形式。即測試通過向發(fā)酵醪中添加2. 5%碳酸鈣(NacalaiTesque Inc.)而制備D-乳酸鹽的生產(chǎn)和使用不添加碳酸鈣的游離D-乳酸的生產(chǎn)。
于發(fā)酵開始4天后收集發(fā)酵醪，使用多功能生物傳感器BF-4(0jikientific Instruments)檢測醪液中包含的D-乳酸和乙醇的量。使用檢測D-乳酸的試劑盒(Oji Scientific Instruments)根據(jù)試劑盒內(nèi)的說明書檢測D-乳酸。結(jié)果示于圖8和圖9。
如圖8和圖9所示，沒有基因?qū)氲挠H本酵母菌株(IF02^0)產(chǎn)生乙醇但不產(chǎn)生 D-乳酸。相反，實施例3中制備的具有染色體整合轉(zhuǎn)基因的4種類型轉(zhuǎn)化酵母菌株較親本菌株表現(xiàn)為更低的乙醇產(chǎn)量但是產(chǎn)生D-乳酸。
具體而言，4種類型的菌株(即D-LDHME基因?qū)虢湍溉旧wPDCl啟動子下游的轉(zhuǎn)化體TC14-6-lA、TC14-6-2A和TC14-6-3A，以及導(dǎo)入D-LDH基因的TC20-1-1A)產(chǎn)生濃度在4% -6%的D-乳酸和濃度在2% -3%的乙醇。這些染色體上整合了轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化體不產(chǎn)生L-乳酸。
相反，借助于自主復(fù)制質(zhì)粒導(dǎo)入D-LDHME基因的菌株(TC21-1)產(chǎn)生非常少量的 D-乳酸。產(chǎn)生的乙醇的量與菌株IF02260相同。
因此，染色體上整合了轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化體能夠有效表達(dá)D-LDH并有效產(chǎn)生D-乳酸。 具體而言，導(dǎo)入處于PDCl啟動子控制下的D-LDH基因(包括D-LDHME基因)有效增強(qiáng)D-乳
酸生產(chǎn)。
在上述4種類型的染色體上整合有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化體中，D-LDHME基因整合于PDCl 啟動子下游的3個菌株表現(xiàn)為5 %或6 %的高D-乳酸生產(chǎn)量但表現(xiàn)為2 %的低乙醇生產(chǎn)量， 即D-乳酸的生產(chǎn)量是乙醇的2或3倍。對于D-LDH基因(GenBank登錄號L29327)整合于PDCl啟動子下游的轉(zhuǎn)化體，D-乳酸的生產(chǎn)量低至約4%，這與乙醇的產(chǎn)量基本上相同或約是乙醇產(chǎn)量的1.3倍。因此，D-LDHME基因有效增強(qiáng)了染色體上整合有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化體中D-乳酸的生產(chǎn)。
在D-乳酸鹽(鈣)和游離L-乳酸的情況下增強(qiáng)D-乳酸生產(chǎn)的水平大約相同。
實施例5 具有增加的D-LDHME拷貝數(shù)的基因重組體酵母菌株
在實施例4中制備的生產(chǎn)D-乳酸的酵母菌株中，TC14-6-3A株用于制備具有所導(dǎo)入D-LDHME基因拷貝數(shù)增加的基因重組體酵母菌株。根據(jù)實施例3中描述的方法將D-LDHME 基因?qū)隩C14-6-3A株。具體而言，除了使用TC14-6-3A株代替宿主酵母菌IF02260株以外，以與實施例3中同樣的方法將D-LDHME基因?qū)隩C14-6-3A株。
所獲得的導(dǎo)入基因的菌株稱作TD1-10-1B、TD1-10-3B、TD1-10-6A 和 TD1-10-7D 株。以與實施例3中相同的方法對這4種菌株中導(dǎo)入的D-LDHME基因的拷貝數(shù)進(jìn)行檢查。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入了 4個拷貝的D-LDHME基因。
隨后，根據(jù)實施例4中描述的方法對這4種類型菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗以檢查產(chǎn)生 D-乳酸的量。結(jié)果示于圖10。如圖10所示，由本實施例中獲得的TD1-10-1B、TD1-10-3B、 TD1-10-6A和TD1-10-7D株產(chǎn)生的D-乳酸的量在親本TC14-6-3A株產(chǎn)生的量(4.65%)的基礎(chǔ)上得到增加。與親本菌株相比，本實施例中獲得的所有4種菌株表現(xiàn)出降低的乙醇生產(chǎn)量。
這表明轉(zhuǎn)化的酵母菌株的D-乳酸生產(chǎn)能力可以通過增加導(dǎo)入的D-LDHME基因的拷貝數(shù)得到提高。在本實施例中，檢查了導(dǎo)入4個拷貝D-LDHME基因的轉(zhuǎn)化酵母菌株。應(yīng)當(dāng)指出導(dǎo)入更多拷貝數(shù)的D-LDHME基因能導(dǎo)致增強(qiáng)的D-乳酸產(chǎn)生。更具體地說，本實施例揭示可以通過增加所導(dǎo)入D-LDHME基因的拷貝數(shù)制備具有較高D-乳酸生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化酵母菌株。
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工業(yè)適用性
本發(fā)明提供了有效生產(chǎn)D-乳酸的技術(shù)。
序列表獨(dú)立文本
SEQ ID NO :6_11 人工 DNA(引物)
權(quán)利要求
1.下列(a)-(d)中任意一項所述的多核苷酸(a)包含SEQID NO :1所示核苷酸序列并且編碼具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(b)多核苷酸，其中所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與SEQID N0:1所示核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交并且編碼具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)，其中所述嚴(yán)格條件為在42°C及 50%甲酰胺存在下進(jìn)行雜交；(c)編碼由SEQID NO 2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(d)編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)由通過替代、缺失、插入或添加1-4個氨基酸殘基而自SEQ ID NO :2所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成并且具有D-乳酸脫氫酶活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的多核苷酸，其中所述嚴(yán)格條件為在65°C及甲酰胺存在下雜交。
3.下面(h)-(j)中任意一項所述的蛋白質(zhì)(h)由序列表中SEQID NO 2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(i)蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)由通過1-4個氨基酸殘基替代、缺失、插入或添加而自序列表中SEQ ID NO :2所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成并且具有D-乳酸脫氫酶活性； 或(j)由權(quán)利要求
1之(b)項所述的多核苷酸編碼的具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
4.DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體包含由權(quán)利要求
1至2中任意一項的多核苷酸組成的DNA片段和由啟動子組成的DNA片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4的DNA構(gòu)建體，其中啟動子是丙酮酸脫羧酶基因啟動子。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4或5的DNA構(gòu)建體，其中啟動子是酵母屬(Saccharomyces)丙酮酸脫羧酶1基因啟動子。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6的DNA構(gòu)建體，其中啟動子是釀酒酵母(Saccharomycescerevisae) 丙酮酸脫羧酶1基因啟動子。
8.轉(zhuǎn)化體，其中轉(zhuǎn)化體以在宿主微生物中可表達(dá)的方式攜帶權(quán)利要求
1至2中任意一項的多核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8的轉(zhuǎn)化體，其中宿主是選自真核微生物和原核微生物的微生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9的轉(zhuǎn)化體，其中宿主是選自真菌的微生物。
11.根據(jù)權(quán)利要求
9的轉(zhuǎn)化體，其中宿主是選自酵母、乳酸菌、埃希氏菌Escherichia) 和芽孢桿菌(Bacillus)的微生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求
8至11中任一項所述的轉(zhuǎn)化體，其中DNA是置于啟動子控制之下以可表達(dá)方式攜帶的。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12的轉(zhuǎn)化體，其中啟動子是丙酮酸脫羧酶基因啟動子。
14.根據(jù)權(quán)利要求
12的轉(zhuǎn)化體，其中啟動子是酵母屬丙酮酸脫羧酶1基因啟動子。
15.根據(jù)權(quán)利要求
12的轉(zhuǎn)化體，其中DNA是置于宿主丙酮酸脫羧酶1基因啟動子控制之下以可表達(dá)方式攜帶的。
16.根據(jù)權(quán)利要求
11的轉(zhuǎn)化體，其中宿主微生物為釀酒酵母。
17.根據(jù)權(quán)利要求
12的轉(zhuǎn)化體，其中宿主微生物為釀酒酵母。
18.根據(jù)權(quán)利要求
13的轉(zhuǎn)化體，其中宿主微生物為釀酒酵母。
19.根據(jù)權(quán)利要求
14的轉(zhuǎn)化體，其中宿主微生物為釀酒酵母。
20.根據(jù)權(quán)利要求
15的轉(zhuǎn)化體，其中宿主微生物為釀酒酵母。
21.生產(chǎn)D-乳酸的方法，其中所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求
8-20中任意一項所述的轉(zhuǎn)化體和從培養(yǎng)產(chǎn)物中回收選自D-乳酸、其鹽和其衍生物中的至少一種的步驟。
22.生產(chǎn)乳酸聚合物的方法，其中所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求
8-20中任意一項所述的轉(zhuǎn)化體；從培養(yǎng)產(chǎn)物中回收選自D-乳酸、其鹽和其衍生物中的至少一種和使用回收的 D-乳酸或其衍生物作為至少一種聚合材料生產(chǎn)乳酸聚合物的步驟。
專利摘要
本發(fā)明提供了編碼具有乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸以及可用于生產(chǎn)D-乳酸的此種蛋白質(zhì)。該多核苷酸具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列(a)，并且能夠在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列全部或部分或其互補(bǔ)鏈的探針雜交并編碼具有D-乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)(b)。
文檔編號C12P7/62GKCN1795270 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200480014169
公開日2011年9月21日 申請日期2004年5月21日
發(fā)明者大西徹, 平井正名, 德弘健郎, 齋藤聰志, 石田亙廣, 長森英二, 高橋治雄 申請人:豐田自動車株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),