專利名稱:固定化酶的絲素納米顆粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種固定化酶的載體及其制備方法，特別涉及一種用蠶絲絲素制造固定化酶的絲素納米顆粒及其制備方法，屬于生物技術(shù)酶工程領(lǐng)域，也屬于納米技術(shù)領(lǐng)域：
和高分子化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
將酶或藥物以微粒、微囊、脂質(zhì)體、白蛋白、紅細(xì)胞載體等形式引入體內(nèi)，可以延長酶或藥物的半衰期，使之緩慢釋放，提高酶或藥物對遺傳性缺酶癥、代謝紊亂癥、腫瘤以及心血管病等的治療功效。以天然生物材料作為酶固定化載體或作為藥物的緩釋載體的研究頗多，是因為它有安全、穩(wěn)定、生物相容性并能在體內(nèi)代謝等優(yōu)點。家蠶生產(chǎn)的絲素蛋白是一種天然的高分子聚合物，分子量高達(dá)37萬。由于這種蛋白質(zhì)對人體無毒、無害、無免疫性，長期以來一直用作醫(yī)用手術(shù)縫合線。近年來，對絲素進(jìn)行在人工皮膚、化妝品和營養(yǎng)食品的原料或作為固定化細(xì)胞、酶和抗體的載體等方面的開發(fā)利用受到關(guān)注。特別是以絲素蛋白為固定化酶載體的研究在過去的二十多年中尤其活躍，已有許許多多實驗充分證實絲素蛋白是一種優(yōu)良的固定化酶生物材料。
以絲素蛋白作為酶固定化載體具有其它高分子材料所沒有的優(yōu)點，酶固定化的原理是建立在絲素蛋白從可溶性的無規(guī)線圈和α-螺旋的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成不溶性的反向平行β-折疊結(jié)構(gòu)，與此同時也完成了酶的固定化。用絲素作為固定化酶載體有多種形態(tài)如絲素膜、絲素纖維、絲素粉末或絲素凝膠。其中絲素粉末的制備及其應(yīng)用研究十分活躍，已有大量的專利報道，主要是通過物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)絲素蛋白凝聚如鹽析、超聲波、充氣、高速攪拌，等電點凝聚、電析或先成膜后機(jī)械粉碎或直接對絲纖維進(jìn)行多次機(jī)械粉碎等方法，制成1～100微米不等的超細(xì)絲素粉末，在化妝品、營養(yǎng)食品、添加劑、高吸水材料和涂料等方面有廣泛的應(yīng)用前景。然而，這些方法或加工環(huán)境大多不適合制備活性高、性能穩(wěn)定的固定化酶。公開號為CN1560136的中國發(fā)明專利(國際專利WO2005085327A1)“絲素納米顆粒的制造方法”中，公開了一種將水溶性再生絲素溶液直接與過量的能與水混溶的有機(jī)溶劑混合制成絲素納米顆粒的制備方法，但其中有些有機(jī)溶劑會引起酶的失活而不適宜制備固定化酶。
絲素粉末用于酶和活性物質(zhì)的固定化研究起源于上個世紀(jì)80年代初，主要是利用鹽析、高速攪動、蛋白凍融以及加入少量有機(jī)溶劑或調(diào)節(jié)等電點等方法使絲素蛋白沉淀、凝聚或變性，然后進(jìn)行干燥和粉碎而制成固定化酶。水溶性絲素和酶混合液，用無機(jī)鹽或無機(jī)鹽與有機(jī)鹽混合物進(jìn)行鹽析使之沉淀制備固定化酶(日本專利，特開昭JP56-15687；特開昭JP60-155125，國際專利，WO8503230；特開昭JP62-151180)；或者將絲素和酶混合液先調(diào)至酸性或堿性，再經(jīng)鹽析、沖洗、干燥后制成粉末狀的固定化酶(日本專利，特開昭JP56-051983，特開昭JP56-39783)。在絲素和酶混合液中加入少量甲醇等有機(jī)溶劑直接誘導(dǎo)絲素凝聚，或者先將絲素酶混合液調(diào)節(jié)到絲素等電點附近，再加入少量有機(jī)溶劑誘導(dǎo)絲素凝聚，然后將凝聚物沖洗、干燥和粉碎后制成固定化α-淀粉和蔗糖酶(日本專利，特開昭JP1-313530)，或者制成固定化堿性或中性蛋白酶(日本專利，特開昭JP56-18590)。通過高速攪動使絲素凝聚或充氣引起絲素和酶混合液產(chǎn)生大量泡沫而制成固定化酶(日本專利，特開昭JP60-227679，特開昭JP61-187790)。將絲素和酶的混合液先凍結(jié)后融化使絲素變性而制成固定化堿性磷酸酶(日本專利，特開昭JP01-120287)。還有利用鹽析法先制成絲素粉末，然后應(yīng)用交聯(lián)劑將絲素粉末與糖化酶交聯(lián)制成固定化酶粉末[《蠶業(yè)科學(xué)》，25(2)113-119，1999]。除此以外，有關(guān)以絲素粉末為載體的固定化酶研究在國內(nèi)外沒有更多的報道。究其原因主要是由于上述這些方法制備的絲素粉末結(jié)晶性差、穩(wěn)定性差、比表面小、固定化酶活性低下。而且在制備過程中形成的凝聚物或沉淀物都需要干燥和反復(fù)粉碎等加工工藝，由此制備的絲素粉末粒徑大，形狀各異，都在微米級以上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種具有良好的生物相容性、酶活性回收率高、生產(chǎn)工藝簡單的固定化酶的絲素納米顆粒及其制備方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是提供一種固定化酶的絲素納米顆粒，它以絲素蛋白為核心，酶被包埋并固定于微粒表層中，平均粒度為35～125nm，不溶于水；所述的絲素蛋白呈β-折疊結(jié)構(gòu)，結(jié)晶度為20％以上。
制備上述固定化酶的絲素納米顆粒的方法，將水溶性絲素溶液與酶混合均勻，再將絲素酶混合液注入到快速攪動的水溶性有機(jī)溶劑中，其絲素酶液與有機(jī)溶劑的混合體積比為1∶2.3以上，形成乳白色絲素蛋白為核心，表層包埋并固定酶的球形微粒分散在有機(jī)溶劑體系中，得到固定化酶的絲素納米顆?；旌弦夯驊腋∫海偃コ渲械挠袡C(jī)溶劑，得到固定化酶的絲素納米顆粒。
上述技術(shù)方案中所述的水溶性絲素包括由家蠶絲或野蠶絲，或者由基因工程生產(chǎn)的類蠶絲蛋白純化而成；所述的絲素溶液濃度為0.1～20％。
上述技術(shù)方案中所述的與絲素液混合的酶指氧化還原酶、水解酶和異構(gòu)酶當(dāng)中的一種或者二種以上的混合酶。
在上述絲素酶液注入有機(jī)溶劑時，攪拌速度在50轉(zhuǎn)/分鐘以上。
所述的水溶性有機(jī)溶劑為乙醇或丙酮。
上述固定化酶的絲素納米顆粒的制造方法，其制備工作環(huán)境溫度在10～45℃，最好在25～37℃之間。
對固定化酶絲素納米顆粒的有機(jī)溶劑混合液或懸浮液進(jìn)行反復(fù)離心脫水處理，或進(jìn)行反復(fù)過濾、清洗處理，直至完全去除有機(jī)溶劑。
對獲得的絲素納米顆粒加入純水或水溶液后進(jìn)行超聲處理1～10min，制成固定化酶的納米絲素液。
對獲得的固定化酶的絲素納米顆粒的有機(jī)溶劑混合液或懸浮液進(jìn)行真空冷凍干燥，制成固定化酶納米絲素粉末。
眾所周知，水溶性有機(jī)溶劑是一種最常用的蛋白變性劑，當(dāng)具有生物活性的蛋白酶遇到高濃度有機(jī)溶劑時會變性失活。絲素也是一種高分子蛋白，當(dāng)將絲素纖維制成再生的水溶性絲素蛋白時，易受到物理或化學(xué)因素影響而發(fā)生蛋白變性，尤其是遇到有機(jī)溶劑時更易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化而凝聚沉淀。在以往研究中，是將少量有機(jī)溶劑加入到絲素與酶的混合溶液中促使絲素蛋白凝聚或沉淀，使酶包埋在絲素沉淀物中，然后再干燥和粉碎制成固定化酶。本發(fā)明利用蠶絲蛋白結(jié)構(gòu)易受改變和水溶性有機(jī)溶劑易引起蛋白變性的二大特性，將少量的絲素與酶的混合溶液注入到高速攪動的超大量的純有機(jī)溶劑中，促使絲素蛋白快速分散與變性，水溶性絲素直接從α-螺旋和無規(guī)線圈轉(zhuǎn)變成β-折疊結(jié)構(gòu)，在形成結(jié)晶性絲素顆粒的同時，酶被包埋和固定化，從而獲得納米級的、性能穩(wěn)定的、不溶于水的固定化酶絲素納米顆粒。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)固定化酶效果較好的是乙醇和丙酮，因此，優(yōu)選的技術(shù)方案是，有機(jī)溶劑為乙醇或丙酮。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點由于絲素與過量的水溶性有機(jī)溶劑混合后，可溶性的絲素蛋白從無規(guī)線圈和α-螺旋結(jié)構(gòu)瞬間轉(zhuǎn)化為不溶性的反向平行β-折疊結(jié)構(gòu)。因此，得到的固定化酶絲素顆粒平均80nm左右，酶活性回收率高達(dá)60％，電子顯微鏡觀察呈球形，結(jié)晶度達(dá)20％以上、性能穩(wěn)定、不易被蛋白酶分解，具有強(qiáng)力阻擋紫外輻射的功能，在體內(nèi)能大大降低或消除酶的免疫原性，延長酶半衰期。
本發(fā)明技術(shù)方案所提供的固定化酶的絲素納米顆粒穩(wěn)定性好，無論是顆粒懸浮液還是凍干粉狀態(tài)，可長期放在室溫下，而酶活性不會受到任何影響，不需象純酶那樣須在4℃或4℃以下保存；制造的凍干粉狀態(tài)的固定化酶絲素納米顆粒能抗高溫，在90～100℃烘干1小時也不丟失酶活性。
按本發(fā)明技術(shù)方案，由于在制備過程中不使用有毒的化學(xué)試劑，因此，得到的固定化酶的納米絲素對人體無毒、無害，且具有良好的生物相容性，是一種綠色環(huán)保產(chǎn)品。所使用的乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑與絲素酶溶液混合后，生成乳白色固定化酶絲素納米顆粒懸浮液，經(jīng)過濾或離心分離，其廢棄的過濾液或上清液可回收重蒸；或者經(jīng)真空冷凍干燥后升華的有機(jī)溶劑水溶液也同樣可回收重蒸，循環(huán)使用。還由于產(chǎn)品制備工藝簡單，成本低、效益高，因此，具有廣闊的市場前景。



圖1是按本發(fā)明實施例1制造方法得到的固定化葡萄糖氧化酶絲素納米顆粒的熒光發(fā)射光譜；圖2是按本發(fā)明實施例1制造方法得到的固定化葡萄糖氧化酶絲素納米顆粒的紅外吸收光譜；圖3是按本發(fā)明實施例1制造方法得到的固定化葡萄糖氧化酶絲素納米顆粒的X-射線衍射圖譜；圖4是按本發(fā)明實施例1制造方法得到的固定化葡萄糖氧化酶絲素納米顆粒的粒度分布圖。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
實施例一取在蠶桑、種繭生產(chǎn)和繅絲、紡織生產(chǎn)中的種繭、繭衣、廢絲或廢綢布等清洗后，加入30倍量的0.5％碳酸鈉水溶液或其它堿性溶液或者加入表面活性劑等進(jìn)行煮沸1小時，再換液1次，再煮沸1小時，確保將絲膠全部脫除。脫除絲膠的絲素纖維經(jīng)反復(fù)用水沖洗后烘干備用。
取上述脫除絲膠的絲素纖維與5～20倍量(W/V)的8～9M溴化鋰水溶液或者是溴化鋰甲醇水三元混合溶劑混合，在40℃以上溶解2～40小時；或者是將絲素纖維與5～20倍量的氯化鈣/乙醇/水三元混合溶劑(摩爾比1∶2∶8)混合，在50℃以上溶解1～5小時；或者是將上述絲素纖維溶解在其它濃鹽溶液或有機(jī)溶劑中。將上述獲得的各種絲素溶解液進(jìn)行透析、脫鹽、純化，制成濃度為0.5～15％的水溶性絲素溶液，最好是濃縮或稀釋成1.5～3.5％水溶性絲素溶液。
取上述濃度為1.5～3.5％水溶性絲素溶液，加入占絲素總量0.0001～1％的葡萄糖氧化酶，通過攪拌裝置使絲素酶混合溶液攪動，在10～45℃的環(huán)境條件下，最好是在25～37℃環(huán)境條件下，快速加入過量的丙酮(最終體積70％以上)中，使絲素蛋白快速變性成超微顆粒懸浮在有機(jī)溶劑中，經(jīng)濾紙過濾，將過濾后的固定化酶絲素濕粉末置緩沖溶液中，經(jīng)超聲處理后成固定化葡萄糖氧化酶的絲素納米顆粒懸浮液，可直接用于酶活性測定；或者將過濾后的固定化酶絲素濕粉末置-20℃凍結(jié)，最后，進(jìn)行真空冷凍干燥，得到粉末狀的固定化葡萄糖氧化酶絲素納米顆粒。
采用以前報道的方法(Kawahara YJournal of Sericulture Science ofJapan，62(4)，272-275，1993)略加改進(jìn)后測定葡萄糖氧化酶活性。具體操作步驟如下在測定管、標(biāo)準(zhǔn)管和空白管中分別加入2.4ml染色緩沖液、0.5mL 10％底物葡萄糖溶液和0.1ml過氧化物酶溶液，搖勻，置37℃恒溫2～5min后最后加入游離酶開始反應(yīng)，以空白管為對照，500nm波長處測定5分鐘內(nèi)反應(yīng)的吸光度變化值，然后除5得到每分鐘將1.0mmol/L β-D-葡萄糖氧化為D-葡萄糖酸和H2O2所增加的吸光度值。當(dāng)測定固定化酶時，因絲素顆粒懸浮在比色皿中邊反應(yīng)邊測定會擋住紫外光線的透過，干擾測定，所以，自制固定化酶反應(yīng)器，當(dāng)反應(yīng)5min后，立即抽濾出反應(yīng)液測定吸光度值。1個單位葡萄糖氧化酶活性定義為在37℃，pH5.5磷酸鈉緩沖液條件下每分鐘催化1.0mmol/L β-D-葡萄糖氧化為D-葡萄糖酸和H2O2所產(chǎn)生的吸光度變化值。表中數(shù)值均為5次重復(fù)測定的平均值。從表中可知，固定化酶的活性回收率在24.5～72.9％之間。
表1固定化葡萄糖氧化酶活性回收率


參見附圖1，固定化葡萄糖氧化酶絲素納米顆粒水中懸浮液和含酶水溶性絲素溶液在日立熒光分光光度計(F-4500 FL Spectrophotometer)上測度的熒光發(fā)射光譜。測定條件激發(fā)波長290nm，激發(fā)狹縫10.0nm，發(fā)射狹縫5.0nm，掃描速度240nm/min，靈敏度0.5s。從圖中可以發(fā)現(xiàn)絲素納米化以后，熒光發(fā)射光譜發(fā)生藍(lán)移10nm左右，表明絲素分子從無規(guī)線圈和α-緩螺旋轉(zhuǎn)變成β-折疊的構(gòu)造。
參見附圖2，固定化葡萄糖氧化酶絲素納米顆粒凍干粉和含酶水溶性絲素溶液凍干粉用少許KBr壓片制樣，在Magna 550紅外分光光度計(NicoletInstrument Corp.USA)上進(jìn)行測定，掃描范圍為4000～200cm-1。圖中含酶水溶性絲素的紅外吸收光譜顯示無規(guī)卷曲和α-緩螺旋或稱曲柄形結(jié)構(gòu)(Silk I)特征，當(dāng)絲素納米化后其吸收帶發(fā)生位移，出現(xiàn)了反向平行β-折疊(Silk II)的構(gòu)造。
參見附圖3，在MERCURY CCD-AFC8型CCD單晶X-射線衍射儀(日本理學(xué)電機(jī)株式會社)進(jìn)行絲素樣品分析，管電壓為4.0kV，管電流為35mA，掃描速度2°/min，Ni濾波。從2θ＝5°～45°進(jìn)行掃描，得到固定化葡萄糖氧化酶絲素納米顆粒凍干粉和含酶水溶性絲素溶液凍干粉的X-射線衍射圖譜。含酶水溶性絲素凍干粉可確認(rèn)為完全無定形結(jié)構(gòu)，而在丙酮中絲素納米化后，絲素分子構(gòu)象由Silk I向Silk II轉(zhuǎn)化，成為結(jié)晶性的固定化酶絲素納米顆粒。
參見附圖4，固定化葡萄糖氧化酶絲素納米顆粒用水稀釋，超聲處理后直接放入樣品杯，在Zetasizer 3000HSa激光粒度儀(Malvern Instruments Ltd，Malvern UK)上測定顆粒粒度分布情況。從圖可知，固定化酶的絲素納米顆粒粒度分布在35～125nm之間。
實施例二與實施例一制備方法相同，將1.5～3.5％的水溶性絲素溶液與超氧物歧化酶混合后，加入快速攪動的過量丙酮(最終體積70％以上)中，其余制備步驟全部相同。用這種丙酮處理方法分別制備得到固定化超氧物歧化酶絲素納米顆粒懸浮液或凍干粉，其活性測定方法以及固定化酶的活性回收率見表2。表中數(shù)值均為5次重復(fù)測定的平均值。
本實驗使用超氧物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所一分所生產(chǎn))測定溶液酶或固定化酶的活性。其測定方法是通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生O2-，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈現(xiàn)紫紅色，用日立U3000紫外可見分光光度計測定其吸光度。當(dāng)被測樣品中含有SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算被測樣品SOD活力(NU/ml，以亞硝酸鹽單位表示)。表中固定化酶活性回收率是以牛血超氧化物歧化酶(上海東方麗珠生物化學(xué)制品有限公司生產(chǎn))活性為100％計算的。結(jié)果表明固定化超氧物歧化酶的活性回收率在25～79.4％之間。
表2.固定化超氧物歧化酶的活性回收率


實施例三與實施例一制備方法相同，將1.5～3.5％的水溶性絲素溶液與L-天冬酰胺酶混合后，加入快速攪動的過量丙酮(最終體積70％以上)中，其余制備步驟全部相同。用這種丙酮處理方法分別制備得到固定化L-天冬酰胺酶絲素納米顆粒懸浮液或凍干粉，其活性測定方法以及固定化酶的活性回收率見表3。表中數(shù)值均為5次重復(fù)測定的平均值。
L-天冬酰胺酶活性測定方法(Mashburn，L.T.，Wriston，J.C.，jr.Tumorinhibitory effect of L-Asparaginase.Biochen.Biophys.Res.Comm.1250，1963)用移液管向數(shù)支離心管滴入0.2ml Tris-HCl緩沖溶液(pH8.6)和1.7ml底物溶液，置于水浴中調(diào)溫至37℃。加0.10ml游離酶溶液或固定化酶后精確保溫10min。加0.10ml三氯醋酸溶液，反應(yīng)終止。離心分離后取出0.50ml上清液滴入7.0ml蒸餾水中，再加1.0ml奈氏試劑。室溫下靜置10min后用分光光度計(480nm處)以空白管為對照測定吸光度。當(dāng)一系列不同濃度的游離酶經(jīng)上述同樣方法測定后，計算游離酶濃度與吸光度關(guān)系，作出校正曲線獲得線性方程。然后，根據(jù)這個線性方程(y＝0.4286x+0.0555)計算固定化酶樣品中實測到的酶活性，最后將樣品中酶的加入總量除以樣品中實測酶活性得出固定化酶活性回收率，結(jié)果見表3。從表中可知，固定化L-天冬酰胺酶活性回收率在13％以上，最高可達(dá)76％。
表3 固定化L-天冬酰胺酶的活性回收率


實施例四與實施例一制備方法相同，將1.5～3.5％的水溶性絲素溶液與青霉素酰化酶混合后，加入快速攪動的過量丙酮(最終體積70％以上)中，其余制備步驟全部相同。用這種丙酮處理方法分別制備得到固定化青霉素?；附z素納米顆粒懸浮液或凍干粉，其活性測定方法以及固定化酶的活性回收率見表4。表中數(shù)值均為5次重復(fù)測定的平均值。
應(yīng)用PDAB(P-dimethylaminobenzaldehyde)方法測定青霉素?；?penicillin Acylase E.C.3.5.11)的活性(Balasshingham K，Warburton D，Dunnill P et al.，The isolation and kinetics of penicillin amidase fromEscherischia Coli.，Biochim Biophys Acta，1972，276250-256)。青霉素?；?1000U/mL)在37℃裂解青霉素產(chǎn)生6-APA在酸性條件下，進(jìn)而與PDAB形成西夫堿，在415nm有最大吸收。酶活測定操作步驟如下酶液0.5ml或固定化酶約20mg加入到4.5ml磷酸鹽緩沖液(pH7.8)稀釋。吸取1.0ml置試管中，于37℃平衡5min。另將4％的青霉素G溶液于37℃平衡5min，吸取1.0ml加入上述含酶的試管中，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)5min，加入3ml乙醇中止反應(yīng)。吸取0.75ml加入5.25ml PDAB生色液，放置3min。在415nm處測定光密度.對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得6-APA濃度。在pH7.8，溫度37℃條件下每分鐘催化青霉素G鉀鹽水解產(chǎn)生1μmol的6-APA所需的酶量，定義為1個酶活單位(U)。
配制一系列不同濃度的青霉素?；?，按上述方法測定酶活性，計算酶濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性方程y＝0.0984x+0.2526，然后計算實際樣品中測得的酶活性，根據(jù)樣品制備時加入的酶量計算固定化酶活性回收率。結(jié)果表明，固定化青霉素酰化酶的活性回收率在20～80％之間。
表4.固定化青霉素?；附z素納米顆粒的酶活性回收率


權(quán)利要求
1.一種固定化酶的絲素納米顆粒，其特征在于它以絲素蛋白為核心，酶被包埋并固定于微粒表層，平均粒度為35～125nm，不溶于水；所述的絲素蛋白呈β-折疊結(jié)構(gòu)，結(jié)晶度為20％以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的酶，其特征在于它包括氧化還原酶、水解酶和異構(gòu)酶當(dāng)中的一種或者二種以上的混合酶。
3.制備固定化酶的絲素納米顆粒的方法，其特征在于將水溶性絲素溶液與酶混合均勻，再將絲素酶混合液注入到快速攪動的水溶性有機(jī)溶劑中，其絲素酶液與有機(jī)溶劑的混合體積比為1∶2.3以上，形成乳白色絲素蛋白為核心，表層包埋并固定酶的球形微粒分散在有機(jī)溶劑體系中，得到固定化酶的絲素納米顆?；旌弦夯驊腋∫?，去除其中的有機(jī)溶劑，得到固定化酶的絲素納米顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的酶，其特征在于它包括氧化還原酶、水解酶和異構(gòu)酶當(dāng)中的一種或者二種以上的混合酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的水溶性有機(jī)溶劑，其特征在于它包括乙醇或丙酮。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種用蠶絲絲素制造固定化酶的絲素納米顆粒及其制備方法，屬于生物技術(shù)酶工程領(lǐng)域。其技術(shù)方案是將酶與水溶性的再生絲素溶液充分混合后，注入到高速攪動的過量水溶性有機(jī)溶劑中，引起絲素變性和結(jié)構(gòu)β化而形成乳白色結(jié)晶性絲素微粒，同時酶被包埋和固定在微粒中。經(jīng)過濾或離心去除有機(jī)溶劑后，制成結(jié)晶性的固定化酶絲素納米顆粒。這種固定化酶平均粒度35～125nm，活性回收率高達(dá)70％、熱穩(wěn)定性大大提高、不易被體外或體內(nèi)的蛋白酶分解，能大大降低或消除酶的免疫原性。這種固定化酶絲素納米顆粒在藥物緩釋系統(tǒng)、工業(yè)酶反應(yīng)器、食品添加劑和高級化妝品等方面有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N11/04GKCN1834240SQ200610039191
公開日2006年9月20日 申請日期2006年3月30日
發(fā)明者張雨青 申請人:蘇州大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan