專利名稱:綠僵菌發(fā)酵提純苦馬豆素的工藝的制作方法
綠僵菌發(fā)酵提純苦馬豆素的工藝技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及微生物學(xué)、生物發(fā)酵，天然產(chǎn)物提取、分離和 鑒定方法，特別涉及一種綠僵菌發(fā)酵提純苦馬豆素的工藝。
背景技術(shù)：
[0002]苦馬豆素的來源有三種途徑(1)從植物中提取分離苦馬豆素目前已知含苦 馬豆素的植物有①豆科苦馬豆屬植物，如苦馬豆、灰苦馬豆(Swainsonacanescens)，該屬 植物在澳大利亞和我國均有分布灰苦馬豆，是首先分離出苦馬豆素的植物；②豆科黃芪 屬(Astragalas)和棘豆屬(Oxytropis)植物，這類植物是國內(nèi)外研究較多的植物，分布 于世界各地，尤其是北美和我國，資源十分豐富。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，這類植物在我國有44 種，其中黃芪屬21種，棘豆屬23種；③錦葵科黃花稔屬(Sida)，如鵝耳櫪黃花稔(Sida carpinifolia)，熱帶美洲和非洲可能是其發(fā)源地，在巴西的南部和東南部也發(fā)現(xiàn)有大量的 鵝耳櫪黃花稔；④旋花科番薯屬，Haraguchi M等^00 從Ipomea carnea的葉子、花和種 子中分離出苦馬豆素，新鮮葉子和花中的含量分別為0. 00 %和0. 00 %,種子中的含量 大約為葉子和花中含量的10倍。這類植物主要分布于澳大利亞。植物中的苦馬豆素相當(dāng) 穩(wěn)定，據(jù)Molyneux等(1991)]報(bào)道，保存15年的斑莢黃芪仍含有苦馬豆素。[0003](2)從真菌菌絲體及其培養(yǎng)液中提取分離苦馬豆素=Schneider B等(1984)從美 國標(biāo)準(zhǔn)庫保存的豆類絲核菌(Miizoctonia Legaminicola)中分離出苦馬豆素。Sim K L等 (1997)報(bào)道綠僵菌(Metarrhizium anisopliae)中也含有苦馬豆素，如果降低綠僵菌培 養(yǎng)液的PH值，可使苦馬豆素的濃度增加。Braim K等Q003)從中毒瘋草密柔毛黃芪，蘭伯 氏棘豆，絹毛棘豆的8個(gè)類群的葉、莖、種子和花中分離出內(nèi)生植物真菌。所有培養(yǎng)的內(nèi)生 植物都產(chǎn)生導(dǎo)致瘋草病的生物堿-苦馬豆素。感染內(nèi)生植物的瘋草類群也產(chǎn)生苦馬豆素， 而且體外培養(yǎng)的內(nèi)生植物的苦馬豆素水平與宿主植物類群的苦馬豆素水平高度相關(guān)。[0004](3)人工合成苦馬豆素[0005]鑒于苦馬豆素及其相關(guān)化合物在生物化學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)等方面的眾多 用途，美國的化學(xué)家^suda(1984)、Bennett(1989)和我國科學(xué)院院士周維善先后對苦馬 豆素人工合成進(jìn)行了研究。由于苦馬豆素有4個(gè)手性碳原子，即使很好地控制反應(yīng)，但是合 成的產(chǎn)物中還有16個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)相同，而立體構(gòu)象不同的異構(gòu)體，要使之分離卻十分困難， 整個(gè)合成過程有21步，產(chǎn)率僅為6. 6%。[0006]苦馬豆素的抗腫瘤活性、免疫增強(qiáng)作用及其抗輻射作用是十分明顯的，不容質(zhì)疑。 然而制約苦馬豆素作為抗腫瘤藥物研發(fā)，產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化，最終走向臨床用藥的關(guān)鍵是苦馬豆 素純品的來源十分匱乏，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們研究的需要。植物中苦馬豆素含量本身很低，僅 為0. 02%左右，且植物資源受自然因素的影響較大，使得苦馬豆素的生產(chǎn)量十分匱乏?；瘜W(xué) 合成由于受合成路線及分離技術(shù)的限制使得苦馬豆素的來源也十分有限，這些都嚴(yán)重的制 約著苦馬豆素抗腫瘤活性研究及其產(chǎn)品開發(fā)。從真菌菌絲體及其培養(yǎng)液中提取分離苦馬豆 素，中國專利公開號(hào)CN1396^53，
公開日2003年2月12日，發(fā)明創(chuàng)造的名稱為生物發(fā)酵提純苦馬豆素的工藝，其所采用的微生物菌株是自行從自然界豆科植物中分離、篩選的可產(chǎn)生 苦馬豆素的豆類絲核菌7-3菌株(代號(hào))，但沒有公開豆類絲核菌7-3菌株的具體獲得方法 和途徑，也沒有公開該豆類絲核菌7-3菌株的具體特性、標(biāo)準(zhǔn)、以及品質(zhì)鑒定方法，同領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員無法按說明書的內(nèi)容重復(fù)實(shí)現(xiàn)；另外，采用生物發(fā)酵提取苦馬豆素，不僅是 菌絲體中含有苦馬豆素，培養(yǎng)液中也含有大量的苦馬豆素，而該發(fā)明的工藝只涉及菌絲體 中苦馬豆素的提取，確丟掉了培養(yǎng)液中苦馬豆素的提取，使提取苦馬豆素的效率降低。
發(fā)明內(nèi)容
[0007]針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種綠僵菌發(fā) 酵提純苦馬豆素的工藝，該工藝使苦馬豆素原材料來源更為便利，有利于工廠化批量生產(chǎn)， 使生產(chǎn)成本大幅度降低，最終為促進(jìn)苦馬豆素在抗腫瘤藥物及免疫增強(qiáng)劑等方面的產(chǎn)業(yè)化 提供物質(zhì)保障。[0008]實(shí)現(xiàn)上述本發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種綠僵菌發(fā)酵提純苦馬豆素的工藝，該工 藝是將從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物菌種保存中心保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株一綠僵菌(Metarrhizium anisopliae CCTCC No. M93049D)通過生物發(fā)酵，使提取所得到的原材料(菌絲體和培養(yǎng) 液)中苦馬豆素得以富集，再經(jīng)過DlOl大孔樹脂和硅膠柱層析、梯度分段升華等技術(shù)獲得苦馬豆素純品。[0009]本發(fā)明的生物發(fā)酵法提純苦馬豆素工藝，具體包括下列步驟[0010]1)綠僵菌菌株的保存與傳代將綠僵菌接種于高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基(Gause’ s synthetic Nol)，培養(yǎng)4 6天，待菌種充分生長發(fā)育后，置-20°C低溫冰箱保存，每1 2 個(gè)月傳代一次。[0011]所述的高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基的配方組成為硝酸鉀lg，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵 0. Olg,磷酸氫二鉀0. 5g，氯化鈉0. 5g，可溶性淀粉20g,瓊脂20g,水IOOOml ；[0012]2)綠僵菌接種、發(fā)酵培養(yǎng)及菌絲體和培養(yǎng)液收集在無菌狀態(tài)下，將綠僵菌接種 于生物發(fā)酵用改良克氏合成I號(hào)培養(yǎng)基，20°C 25°C通氣發(fā)酵培養(yǎng)10 14天。收集菌絲 體和培養(yǎng)液，干燥，備用；[0013]所述改良克氏合成I號(hào)培養(yǎng)基的配方組成為可溶性淀粉10g，糊精10g，硝酸鉀 2g，磷酸氫二鉀2g，氯化鈉2g，硫酸鎂0. 05g,碳酸鈣0. 02g,硫酸亞鐵0. Olg,酪蛋白0. 3g， DL-賴氨酸 0. lg,7jC 1000ml ；[0014]3)菌絲體中苦馬豆素的提取[0015]①菌絲體總浸膏提取稱取菌絲體，置超聲循環(huán)提取機(jī)，加6 10倍量(重量體積 比)的乙醇，20KHz超聲波室溫處理4次，每次0. 5 1小時(shí)，收集乙醇提取液并分離殘留 物，收集的提取液減壓回收溶劑，得到菌絲體總浸膏；[0016]②苦馬豆素粗品提??；上述得到的菌絲體總浸膏，先用3倍量(重量體積 比)ImoL/L鹽酸溶解浸膏，濾去不溶物，得到酸水液。將酸水液用濃氨水調(diào)pH至9 10，然 后用飽和正丁醇反復(fù)萃取4 6次，減壓回收溶劑得到苦馬豆素粗品。[0017]③苦馬豆素純品提取稱取苦馬豆素粗品，按1 1的比例(重量比)拌等量柱層 析用硅膠，揮干研成細(xì)粉末，硅膠柱層析分離，乙酸乙酯一乙醇(1 4，體積比)洗脫，采用 薄層色譜技術(shù)監(jiān)測合并含苦馬豆素部分，最后經(jīng)90 95°C油浴減壓梯度升華得到苦馬豆素純品。[0018]4)發(fā)酵液中苦馬豆素的提取發(fā)酵液經(jīng)脫水、濃縮、脫糖、脫蛋白、超聲波裂解細(xì) 胞等前處理得到的濃縮水溶液，通過DlOl大孔樹脂收集蒸餾水洗脫部分，濃縮得到苦馬豆 素粗品，然后經(jīng)硅膠柱層析和減壓梯度升華得到苦馬豆素純品。[0019]所述的薄層色譜監(jiān)測技術(shù)是硅膠GF2M薄層板點(diǎn)樣，氯仿甲醇氨水水 (70 26 2 2，體積比)或乙醇乙酸乙酯O 1，4 1，體積比)上行法展開，[0020]以下通過表1來說明本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)[0021]表1綠僵菌生物發(fā)酵提取苦馬豆素工藝與現(xiàn)有技術(shù)對比性試驗(yàn)[0022]
權(quán)利要求
1. 一種綠僵菌發(fā)酵提純苦馬豆素的工藝，其特征在于，包括下列步驟1)綠僵菌菌株的保存與傳代將綠僵菌接種于高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 6天，待 菌種充分生長發(fā)育后，置-20°C低溫冰箱保存，每1 2個(gè)月傳代一次；所述的高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基的配方組成為硝酸鉀lg，硫酸鎂0. 5g，硫酸亞鐵0. Olg，磷 酸氫二鉀0. 5g，氯化鈉0. 5g，可溶性淀粉20g,瓊脂20g,水IOOOml ；2)綠僵菌接種、發(fā)酵培養(yǎng)及菌絲體和培養(yǎng)液收集在無菌狀態(tài)下，將綠僵菌接種于生 物發(fā)酵用改良克氏合成I號(hào)培養(yǎng)基，20°C 25°C通氣發(fā)酵培養(yǎng)10 14天，收集菌絲體和培 養(yǎng)液，干燥，備用；所述改良克氏合成I號(hào)培養(yǎng)基的配方組成為可溶性淀粉10g，糊精10g，硝酸鉀2g，磷 酸氫二鉀2g，氯化鈉2g，硫酸鎂0. 05g，碳酸鈣0. 02g，硫酸亞鐵0. Olg，酪蛋白0. 3g，DL_賴 氨酸 0. lg,7jC 1000ml ；3)菌絲體中苦馬豆素的提?、倬z體總浸膏提取稱取菌絲體，置超聲循環(huán)提取機(jī)，加6 10倍量的工業(yè)酒精， 20KHz超聲波室溫處理4次，每次0. 5 1小時(shí)，收集乙醇提取液并分離殘留物，收集的提取 液減壓回收溶劑，得到菌絲體總浸膏；②苦馬豆素粗品提取；上述得到的菌絲體總浸膏，先用3倍量ImoL/L鹽酸溶解浸膏，濾 去不溶物，得到酸水液，將酸水液用濃氨水調(diào)pH至9 10，然后用飽和正丁醇反復(fù)萃取4 6次，減壓回收溶劑得到苦馬豆素粗品；③苦馬豆素純品提取稱取苦馬豆素粗品，按1 1的比例(重量比)拌等量柱層析用 硅膠，揮干研成細(xì)粉末，硅膠柱層析分離，乙酸乙酯乙醇1 4，(體積比)洗脫，采用薄層 色譜技術(shù)監(jiān)測合并含苦馬豆素部分，最后經(jīng)90 95°C油浴減壓梯度升華得到苦馬豆素純Pm ；4)發(fā)酵液中苦馬豆素的提取發(fā)酵液經(jīng)脫水、濃縮、脫糖、脫蛋白、超聲波裂解細(xì)胞等 前處理得到的濃縮水溶液，通過DlOl大孔樹脂收集蒸餾水洗脫部分，濃縮得到苦馬豆素粗 品，然后經(jīng)硅膠柱層析和減壓梯度升華得到苦馬豆素純品；所述的薄層色譜監(jiān)測技術(shù)是硅膠GF2M薄層板點(diǎn)樣，氯仿甲醇氨水水 70 26 2 2，(體積比)或乙醇乙酸乙酯2 1或4 1，(體積比)上行法展開， 雙氧水/10%醋酐/Hirlich，s試劑噴霧顯色。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種綠僵菌發(fā)酵提純苦馬豆素的工藝，從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物菌種保存中心購買的標(biāo)準(zhǔn)綠僵菌(Metarrhizium anisopliae)菌株，通過生物發(fā)酵工程培養(yǎng)，獲得含苦馬豆素較高的菌絲體和發(fā)酵液，采用超聲提取、溶劑萃取、薄層色譜、D101樹脂、硅膠柱層析及梯度升華等技術(shù)，從菌絲體和發(fā)酵液中分離提純出苦馬豆素純品。該工藝制備的苦馬豆素呈白色針狀結(jié)晶，分子量為173，熔點(diǎn)144～145℃，純度≥98％。本發(fā)明的工藝，不破壞現(xiàn)有的植物資源，不存在資源匱乏問題，生產(chǎn)周期短，提取成本低，生產(chǎn)量大，產(chǎn)品純度高，利于工廠化生產(chǎn)，可促進(jìn)苦馬豆素作為抗腫瘤藥物及免疫增強(qiáng)劑等藥物研發(fā)的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12P17/06GKCN101100682 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200610043120
公開日2011年4月27日 申請日期2006年7月7日
發(fā)明者傅艷萍, 來航線, 王建軍, 趙寶玉 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (3),