專利名稱:多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的標(biāo)記物Msx1/2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Msxl基因和Msx2基因，該基因是多巴胺能神經(jīng)元增殖祖 纟田月包(dopaminergic neuron proliferative progenitor cell)的才示i己物。更具體;t也， 本發(fā)明涉及^r測多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的手段，檢測該細(xì)胞的方法和 檢測該細(xì)胞的試劑盒。
背景技術(shù)：
多巴胺系統(tǒng)是很重要的系統(tǒng)，它參與對哺乳動物腦而言至關(guān)重要的運 動控制、激素分泌控制、情感控制等。因此，多巴胺能神經(jīng)傳遞異常會導(dǎo) 致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。例如，帕金森氏病是錐體外系統(tǒng)的神經(jīng)變性疾病， 它是由中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的特異性變性引起的(HARRISON， S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE Vol. 2 23rd ed., Isselbacher et al. edited by McGraw-Hill Inc., NY (1994) pp. 2275-7)。
治療帕金森氏病的方法，即口服L-DOPA (3,4-二羥基-苯丙氨酸)的方法 主要用于補(bǔ)償多巴胺產(chǎn)量的降低，但已知其療效并不持久。
因此，為了補(bǔ)償多巴胺能神經(jīng)元的損失，最近人們嘗試了一種治療方 法，即移植6-9周齡流產(chǎn)胎兒的中腦腹側(cè)區(qū)域，該區(qū)域內(nèi)含有多巴胺能神經(jīng) 元前體(美國專利5690927; Spencer et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1541-8; Freed et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1549-55; Widner et al. (1992) N, Engl. J. Med, 327:1556-63; Kordower et al. (1995) N. Engl. J. Med. 332:1118-24; Defer et al. (1996) Brain 119:41-50; and Lopez-Lozano et al. (1997) Transp. Proc. 29:977-80)。然而，目前除了細(xì)胞供應(yīng)和倫理道德問題外(Rosenstain (1995) Exp. Neuroi.33:106; Turner et al. (1993) Neurosurg. 33:1031-7)，多種其它問題 也已顯現(xiàn)，例如，傳染性污染的風(fēng)險、免疫移植物排斥(L叩ez-Lozano et al. (1997) Transp. Proc. 29:977-80 and Widner and Brudin(1988) Brain Res. Rev. 13:287-324)、因胎兒組織主要依賴于脂質(zhì)代謝而不是糖酵解所造成的低存 活率(Rosenstein (1995) Exp. Neurol. 33:106)等。例如，為了解決倫理道德或供應(yīng)短缺問題，已被建議的方法有使用
得自豬的皮質(zhì)、紋狀體和中腦細(xì)胞(例如日本專利特許公開號10-508487、 10-508488和10-509034)等。然而，在此方法中，需要經(jīng)過復(fù)雜的程序來修 飾細(xì)胞表面抗原(MHCI類抗原)以抑制排斥。例如，為了解決移植物排斥問
特許公開號11-509170、 11-501818; and Selawly and Cameron (1993) Cell Transplant 2:123-9)。移植細(xì)胞可能來自MHC匹配的親屬、他人的骨髓、骨 髓庫、臍血庫等。然而，如果可使用患者自身的細(xì)胞，無需額外的程序和 麻煩即可解決排斥問題。
因此，得自非-神經(jīng)細(xì)胞，如胚胎-干細(xì)胞(ES細(xì)胞)和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的多 巴胺能神經(jīng)元體外分化系統(tǒng)有望被用作移植材料，以替代得自流產(chǎn)胎兒的 細(xì)胞。實際上，有報道表明通過將ES細(xì)胞移植到大鼠帕金森氏病模型的 損害條紋中，形成了功能性的多巴胺能神經(jīng)元(Kim et al. (2002) Nature 418:50-56)。據(jù)認(rèn)為，得自ES細(xì)胞或患者自身神經(jīng)干細(xì)胞的再生藥物的重 要性將會增加。
另一方面，治療神經(jīng)組織損傷時，需要重構(gòu)腦功能，而為了與周圍的 細(xì)胞形成適當(dāng)?shù)穆?lián)接(網(wǎng)絡(luò)形成)，需要移植的不是成熟細(xì)胞，而是可在體內(nèi) 分化成神經(jīng)元的祖細(xì)胞。然而，在移植神經(jīng)元祖細(xì)胞時，除了存在上述與 供應(yīng)有關(guān)的問題，還存在一個問題，即祖細(xì)胞可分化成不均一的細(xì)胞群體。 例如，在治療帕金森氏病時，需要在含有兒茶酚胺神經(jīng)元中選擇性地移植 多巴胺能神經(jīng)元。以前，有人建議將下述細(xì)胞用作移植細(xì)胞以治療帕金森 氏病紋狀體(Lindvall et al. (1989) Arch. Neurol. 46:615-31 and Widner et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1556-63)，得自人胚胎神經(jīng)的無限增殖化細(xì)胞系 (曰本專利特許公開號8-509215, 11-506930和2002-522070), NT2Z細(xì)胞有 絲分裂后的人神經(jīng)元(日本專利特許公開號9-5050554)，神經(jīng)元原基細(xì)胞(曰 本專利特許公開號11-509729)，被外源基因轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生兒茶酚胺，如多巴胺 的細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(日本專利特許公開號2002-504503和2002-513545), 基因被修飾的ES細(xì)胞(Kimetal. (2002) Nature 418:50-56)，等等。然而，這 些細(xì)胞無一僅含有多巴胺能神經(jīng)元或能分化成多巴胺能神經(jīng)元的細(xì)胞。
有人建議了一種從未分化的細(xì)胞群體中選擇性濃縮或分離多巴胺能神 經(jīng)元的方法在細(xì)胞群體的每個細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)焚光蛋白的報道基因，所述基因處于在多巴胺能神經(jīng)元中表達(dá)的基因，如酪氨酸羥化酶(TH)基因的 啟動子/增強(qiáng)子的控制之下，分離發(fā)出熒光的細(xì)胞，籍此用肉眼觀察活的多
巴胺能神經(jīng)元，以進(jìn)行濃縮、分離或鑒定(日本專利特許公開號2002-51775)。 然而，該方法需要復(fù)雜的導(dǎo)入外源基因的步驟，此外，當(dāng)用于基因治療時， 報道基因的存在會導(dǎo)致毒性和免疫原性的問題。
如上所述，目前，移植治療帕金森氏病的最大問題之一是多巴胺能 神經(jīng)元祖細(xì)胞無論是得自流產(chǎn)胎兒的中腦腹側(cè)區(qū)域，還是經(jīng)誘導(dǎo)后分化的， 皆為多種細(xì)胞的混合物?？紤]到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成的安全性，僅分離和使用所 需的細(xì)胞種類才是合乎需要的。另外，考慮到存活力或在移植了細(xì)胞的腦 中正確形成網(wǎng)絡(luò)的能力，可以說分離和移植較早的增殖祖細(xì)胞會獲得合意 的治療效果。
以前，有人報道過在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中選擇性表達(dá)的基因 Lrp4(WO 2004/065599)。另外， 一些多巴胺能神經(jīng)元前體的標(biāo)記物也已被報 道(WO 2004/038018和WO 2004/052190)。其中，關(guān)于Lmxla,已證實它表 達(dá)于人和小鼠的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞，有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng) 元前體(postmitotic dopaminergic neuron precursor cell)和多巴胺能神經(jīng)元 (WO 2005/052190)。
Msx基因是參與器官形成的同源異型框基因，已知Msxl、Msx2和Msx3 存在于小鼠中，Msxl和Msx2存在于人中(Davidson, D.(1995). Trends Genet 11:405-411)。以前曾有人報道Msxl在多種腦細(xì)胞中表達(dá)(Ramos, C., et al. (2004). Dev Dyn 230:446-60)。另據(jù)報道在Msxl/Msx2突變體小鼠中，參 與背腹方向神經(jīng)管圖式形成的Wntl的表達(dá)在間腦和嘴側(cè)中腦的背側(cè)中線 完全消失(Bach, A" et al. (2003). Development 130:4025-36)。另有報道認(rèn)為: Msxl參與神經(jīng)管形成早期的發(fā)育(Liu, Y.， et al. (2004). Development 131:1017-28)。
然而，無人報道Msxl和Msx2在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中選擇性 表達(dá)。
發(fā)明簡述
最近，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Msxl基因和Msx2基因(下文中有時也將其簡稱為 "Msxl"和"Msx2")在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中選擇性表達(dá)。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明的目的是提供檢測多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的手段，檢測多
巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的方法和檢測多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的試劑 備
J3L 。
此外，本發(fā)明的目的是提供篩選物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)能有效誘導(dǎo)生 成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過程。
另外，本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)生可用于治療帕金森氏病的多巴胺能神 經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的方法。
本發(fā)明提供了可用于檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的多核苷
酸探針或多核苷酸引物，它們可與由Msx 1基因或Msx2基因的核苷酸序列 組成的多核苷酸，或其互補(bǔ)序列雜交(下文有時也稱之為"本發(fā)明的探針"或 "本發(fā)明的引物")。
本發(fā)明提供了可用于檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的抗Msxl 蛋白或Msx2蛋白的抗體或其部分(下文有時也稱之為"本發(fā)明的抗體")。
本發(fā)明還提供了檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的方法，其包 括檢測Msxl基因或Msx2基因表達(dá)的步驟(下文有時也稱之為"本發(fā)明的檢 測方法")。
本發(fā)明還提供了檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的試劑盒，其 至少包含本發(fā)明的探針，本發(fā)明的引物或本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明提供了篩選物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)能有效誘導(dǎo)生成多巴胺能神 經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過程，所述方法包括4企測Msxl基因或Msx2基因表 達(dá)的步驟。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生可用于治療帕金森氏病的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì) 月包的方法。
本發(fā)明提供了多核苷酸用于檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的 用途，所述多核苷酸可與由Msxl基因或Msx2基因的核苷酸序列組成的多 核香酸，或其互補(bǔ)序列雜交。
本發(fā)明提供了抗Msxl蛋白或Msx2蛋白的抗體或其部分用于檢測或選 擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的用途。
本發(fā)明的探針，本發(fā)明的引物，和本發(fā)明的抗體可用作多巴胺能神經(jīng) 元增殖祖細(xì)胞的選擇標(biāo)記。因此，本發(fā)明對于移植材料的純度^r測，以及開發(fā)體外誘導(dǎo)生成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過程的方法等十分有 用，本發(fā)明有望促進(jìn)再生醫(yī)療的實際應(yīng)用。
附圖簡述

圖1顯示了與多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)的標(biāo)記基因的表達(dá)時期。
圖2顯示了 12.5曰齡小a^月臺的中腦。沿著背腹軸將中腦分成四個區(qū)^(V:最 腹側(cè)區(qū)域，VL:腹側(cè)區(qū)域，DL:背側(cè)區(qū)域，D:最背側(cè)區(qū)域)。
圖3顯示了通過RT-PCR法，分析Msxl, Msx2, DAT, Lmxla和Lrp4在中腦各 個區(qū)域中的mRNA表達(dá)的結(jié)果。
圖4顯示了通過原位雜交，分析Msxl,Nuirl和TH在11.5日齡小鼠胚胎中 腦中的mRNA表達(dá)的結(jié)果。點多汰示產(chǎn)生多e^肯a申^iL的區(qū)域，破折號癥汰示VZ (腦室區(qū))和ML (套層)之間的分界。
圖5顯示了通過免疫染色法，分析Msxl/2和Lmxla在U.5日齡小鼠胚月臺中
腦中的蛋白質(zhì)表ii^jy^表ii(雙染色)的結(jié)果。
圖6顯示了通過免疫染色法，分析Msxl/2,Lmxla和TH在11.5日齡小鼠胚 胎中樞神經(jīng)系MJ1側(cè)區(qū)域的蛋白質(zhì)表達(dá)的結(jié)果。
圖7顯示了通過RT-PCR法，分析Msxl, Msx2和其它多巴胺能神經(jīng)元標(biāo) 記基因在由ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果。
圖8顯示了通過細(xì)胞分選儀分離Lrp4陽性細(xì)月fe^陰性細(xì)胞。
圖9顯示了通過RT-PCR法，分析Msxl,Msx2和其它多巴胺能神經(jīng)元標(biāo) 記基因在每個多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果，所迷細(xì)胞分離自由12.5 曰齡小鼠胚胎(E12.5)的中腦獲得的細(xì)胞和SDIA分化誘導(dǎo)細(xì)胞。
發(fā)明詳述
下文將要詳細(xì)解釋本發(fā)明。以下描述是解釋本發(fā)明的例子，本發(fā)明并 不局限于所描述的實施方案。本說明書中使用的所有技術(shù)術(shù)語、科技術(shù)語 和術(shù)語學(xué)與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同，
它們僅用于解釋具體的實施方案，而不會對其構(gòu)成限制。只要不背離本發(fā) 明的精神，本發(fā)明可在不同的實施方案中被實施。本說明書中提及的所有 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)、公開出版物、專利出版物和其它專利文獻(xiàn)皆以參考文獻(xiàn)的 形式被引入本說明書中，可用于實施本發(fā)明。[多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞]
身為本發(fā)明中被檢測或選擇的目標(biāo)的"多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞"指 的是有絲分裂停滯前的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞。
經(jīng)過增殖祖細(xì)胞和有絲分裂后前體細(xì)胞的分化階段，多巴胺能神經(jīng)元 由神經(jīng)上皮細(xì)胞分化為成熟的多巴胺能神經(jīng)元。多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì) 胞是多巴胺能神經(jīng)元中最早的祖細(xì)胞，因此，預(yù)期可獲得高存活力，并在 移植了細(xì)胞的腦中獲得網(wǎng)絡(luò)形成的高能力。因此，多巴胺能神經(jīng)元增殖祖 細(xì)胞可用于移植療法，以治療因多巴胺能神經(jīng)元變性使多巴胺減少而導(dǎo)致 的疾病，3口帕金力，氏病。
使用本發(fā)明的探針、引物或抗體作為指標(biāo)選擇的細(xì)胞是有絲分裂停滯 前的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞，因此，從安全性、存活率和網(wǎng)絡(luò)形成能 力方面考慮，與常規(guī)的混合細(xì)胞群體或?qū)胪庠椿虻亩喟桶纺苌窠?jīng)元前 體相比，本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞可優(yōu)選用于神經(jīng)變性疾病， 如帕金森氏病的移植治療。細(xì)胞是有絲分裂停滯前的多巴胺能神經(jīng)元增殖 祖細(xì)胞，即為處于增殖過程中的細(xì)胞，其具有在腦中的大多數(shù)合適的位置 分化為成熟細(xì)胞的可能性，另外，多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞也具有在體內(nèi)增 殖的可能性，因此，預(yù)期可獲得較長期的治療效果。因此，可以認(rèn)為本發(fā) 明為神經(jīng)變性疾病，如帕金森氏病的有效移植治療的實際應(yīng)用鋪平了道路。
本發(fā)明的探針和引物可與Msxl基因或Msx2基因特異性雜交。如上所 述，Msxl基因或Msx2基因的表達(dá)可用作多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的指 標(biāo)。因此，本發(fā)明的探針或引物可用作檢測多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的 才示i己物。
本發(fā)明的探針和引物可用于檢測Msxl基因或Msx2基因的表達(dá)，相當(dāng) 于由多個堿基或堿基對，如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)組成的聚 合物。已知雙鏈cDNA也可用于組織原位雜交，本發(fā)明的探針和引物包括 該雙鏈cDNA。用于檢測組織中的RNA的特別優(yōu)選的探針和引物可以是例 如RNA探針(核糖核酸探針)。
本發(fā)明的探針和引物包括由含有Msxl基因或Msx2基因核苷酸序列的 至少10個，優(yōu)選至少15個，更優(yōu)選至少20個，更優(yōu)選至少25個連續(xù)核 苷酸的序列的多核苷酸，或其互補(bǔ)序列組成的探針和引物。本發(fā)明的探針和引物也包括由含有Msxl基因或Msx2基因核苷酸序列的10-50或10-30, 15-50或15-30, 20-50或20-30，以及25-50或25-30個連續(xù)核芬酸的序列 的多核苦酸，或其互補(bǔ)序列組成的探針和引物。
本發(fā)明的探針和引物的長度可以至少為10個堿基，優(yōu)選至少為15個 堿基，更優(yōu)選至少為20個堿基，更優(yōu)選至少為25個堿基。本發(fā)明的探針 和引物的長度也可以為10-50個堿基或10-30個堿基，15-50個堿基或15-30 個堿基，20-50個堿基或20-30個堿基，以及25-50個堿基或25-30個堿基。
本發(fā)明探針和引物的優(yōu)選實施方案提供了長度為15-30個堿基的探針 和引物，用于檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞，所述探針和引物由 含有Msxl基因或Msx2基因核苷酸序列的至少IO個(優(yōu)選至少15個，更優(yōu) 選至少20個，更優(yōu)選至少25個)連續(xù)核香酸的序列的多核苦酸，或其互補(bǔ) 序列組成，并能與Msxl基因或Msx2基因雜交。
本發(fā)明探針和引物的優(yōu)選實施方案提供了可與Msx 1基因或Msx2基因 核香酸序列的高辨別部分雜交的探針和引物。使用該探針和引物，可以較 高的準(zhǔn)確度檢測到增殖祖細(xì)胞。所述探針和引物包括可與含有選自SEQID N0:1的核苷酸1-710和963-1713，SEQ IDN0:3的核苷酸1-677和943-1546, SEQIDNO:5的核苦酸1-484和736-1316, SEQIDNO:7的核苷酸1-612和 864-1801， SEQIDNO:9的核苷酸1-737和976-1724， SEQIDNO:ll的核苷 酸1-525和777-1189， SEQ ID NO:13的核苷酸1-612和864-1810, SEQ ID NO:15的核苦酸1-754和994-1754， SEQ ID NO:16的核苷酸1-744和 996-1935， SEQ ID NO:17的核苦酸1-610和864-1806, SEQ IDNO:19的核苷 酸1-610和864-1785， SEQ IDNO:21的核苷酸1-1456和1710-1905, SEQ ID NO:23的核香酸1-625和891-1062, SEQ ID NO:25的核苷酸1-709和 963-1895， SEQ ID NO:27的核普酸1-520和786-1310, SEQIDNO:29的核 苷酸1-510和767-1259, SEQ ID NO:31的核苦酸1-473和712-2180, SEQ ID NO:33的核普酸1-468和707-1138, SEQ ID NO:35的核苷酸1-435和 674-1143， SEQ ID NO:37的核普酸1-473和712-1164， SEQIDNO:39的核 苷酸1-473和712-1164, SEQIDNO:41的核香酸1-473和712-2048， SEQ ID NO:43的核香酸1-473和712-2182, SEQ ID NO:45的核苷酸1-413和 651-804, SEQIDNO:47的核苷酸1-431和670-2605， SEQIDNO:49的核香 酸1-435和674-2136, SEQIDNO:51的核苷酸1-778和1015-1452， SEQ IDNO:53的核苷酸1-780和1017-1453， SEQ ID NO:55的核芬酸1-370和 609-800, SEQ ID NO:57的核苷酸1-29和267-420, SEQ ID NO:59的核香酸 1-1340和1578-1731， SEQ ID NO:61的核苷酸1-541和778-2225, SEQ ID NO:63的核香酸1-404和651-804， SEQ ID NO:65的核苦酸1-632， SEQ ID NO:67的核苦酸1-489和728-1107,和SEQ ID NO:69的核苷酸1-487和 708-2569的梭苷酸序列的部分或全部的核苷酸序列雜交的探針和引物。
本發(fā)明的探針可在檢測感興趣基因的已知方法，如northern印跡法、 southern印跡法、原位雜交法等中用作根據(jù)一般方法的探針。
可根據(jù)本說明書中公開的核苷酸序列，化學(xué)合成本發(fā)明的探針。探針 的制備方法是眾所周知的，可根據(jù)例如"Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.，，(Cold Spring Harbor Press (1989))和"Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997))進(jìn)行制備。
本發(fā)明的引物也可用作由兩種或多種引物組成的引物套。
本發(fā)明的引物和引物套可在利用核酸擴(kuò)增法，如PCR法、RT-PCR法、 實時PCR法、原位PCR法或LAMP法檢測感興趣基因的已知方法中用作 根據(jù)一般方法的引物和引物套。
可選擇本發(fā)明的引物套，以使通過核酸擴(kuò)增法可擴(kuò)增出Msxl基因或 Msx2基因的核苷酸序列。核酸擴(kuò)增法是眾所周知的，核酸擴(kuò)增法中引物對 的選擇也是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的。例如，在PCR法中，可選擇引物， 以4吏兩個引物(引物對)中的一個與Msxl基因或Msx2基因雙鏈DNA的正《連 配對，另一個引物與雙鏈DNA的負(fù)鏈配對，由一個引物延伸的鏈可與另一 個引物配對。另外，在LAMP法(WO 00/28082)中，關(guān)于靶基因，從3，末端 一側(cè)，限定了三個區(qū)域F3c、 F2c和Flc，,人5，末端一側(cè)，限定了三個區(qū)i或 Bl、 B2和B3，通過使用這六個區(qū)域，可設(shè)計四種引物。
可根據(jù)本說明書中公開的核苷酸序列，化學(xué)合成本發(fā)明的引物。引物 的制備方法是眾所周知的，可沖艮據(jù)例如"Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.，，(Cold Spring Harbor Press (1989))和"Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997))進(jìn)行制備。
在本發(fā)明中，"Msxl基因，，是多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞存在的指標(biāo)， 已知其存在于人、小鼠、大鼠、黑猩猩、狗、牛、雞等中。已知"Msx2基 因"存在于人、小鼠、大鼠、黑猩猩、狗、牛、雞、鵪鶉等中。公開各個序列的GenBank登錄號如下。 Msxl基因
人NMJ)02448(SEQ ID NO: 1 (堿基序列)，SEQ ID NO:2 (氨基酸序列)， 下文中以相同的次序表示)，BC021285(SEQ ID NO:3， SEQ ID NO:4), M97676 (與NM—002448相同)和BC067353(SEQ ID NO:5， SEQ ID NO:6)
小鼠NM_010835(SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8), BC016426(SEQ ID NO:9， SEQ ID NO:10)， AF308572(SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:12)， X14759(SEQ ID NO:13， SEQ ID NO:14), AK078600(SEQ ID NO:15(堿基序 列))，AK077524(SEQIDNO:16(堿基序列))和X59251(與NM_010835相同)
大鼠NM—031059(SEQ ID NO:17， SEQ ID NO:18)和D83036(SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20)
黑猩猩XM—517087(SEQ ID NO:21 ， SEQ ID NO:22)
狗XM_545946(SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24)
牛NM—174798(SEQ ID NO:25， SEQ ID NO:26)和D30750(與 NM一174798相同)
雞NM_205488(SEQ IDNO:27， SEQ IDNO:28), D10372(與NM一205488 相同)和M76985(SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30)
Msx2基因
人NM—002449(SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32), CR592938 (SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34), BC015509(SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36), D31771(SEQ ID NO:37， SEQ ID NO:38)， S75308(SEQ ID NO:39， SEQ ID NO:40)， S75361(SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42)， D89377(SEQ ID NO:43， SEQ ID NO:44), BT009814(SEQ ID NO:45， SEQ ID NO:46), X69295(SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48)和D26145(SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50)
小鼠NM—013601(SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52)和X59252(SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54)
大鼠U12514(SEQ ID NO:55， SEQ ID NO:56)和NM_012982(SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58)
黑猩猩XM—523807(SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60)
狗NM—001003098(SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62)和AJ277753(SEQ ID NO:63， SEQ ID NO:64)牛XM—592489(SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66)
雞NM—204559(SEQ ID NO:67， SEQ ID NO:68)和S64478(與 NM—204559相同)
鵪鵓M57611(SEQIDNO:69， SEQIDNO:70)
至于除上述動物外的動物(優(yōu)選哺乳動物)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于已 知的全長Msxl基因或Msx2基因序列，詳細(xì)列出其固有的Msxl基因或 Msx2基因序列。例如，通過基于人或小鼠Msxl基因或Msx2基因的同源 性檢索，可檢索并鑒定出動物的Msxl基因或Msx2基因。在同源性檢索中， 可使用下文描述的BLAST等。
Msxl基因包括
編碼人Msxl蛋白的多核香酸，所述蛋白由選自SEQIDNO:2、 SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的至少一個氨基酸序列組成；
編碼小鼠Msxl蛋白的多核苷酸，所述蛋白由選自SEQIDNO:8、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 14的至少一個氨基酸序列組成；編碼大鼠Msxl蛋白的'多核苷酸，所述蛋白由選自SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20的至少一個氨基酸序列組成；
編碼黑猩猩Msxl蛋白的多核苦酸，所述蛋白由SEQIDNO:22的氨基 酸序列組成；
編碼狗Msxl蛋白的多核苷酸，所述蛋白由SEQ ID NO:24的氨基酸序 列組成；
編碼牛Msxl蛋白的多核香酸，所述蛋白由SEQIDNO:26的氨基酸序 列組成；和
編碼雞Msxl蛋白的多核苷酸，所述蛋白由選自SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30的至少一個氨基酸序列組成。
此外，Msxl基因包括
含有選自SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的至少一個人 Msxl基因DNA序列的多核苷酸；
含有選自SEQIDNO:7、 SEQIDNO:9、 SEQIDNO:ll、 SEQ ID NO: 13、 SEQ IDNO:15和SEQ IDNO:16的至少一個小鼠Msxl基因DNA序列的多 核苷酸；含有選自SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 19的至少一個大鼠Msxl基因
DNA序列的多核香酸；
含有SEQIDNO:21的黑猩猩Msxl基因DNA序列的多核香酸； 含有SEQ ID NO:23的狗Msxl基因DNA序列的多核香酸； 含有SEQ ID NO:25的牛Msxl基因DNA序列的多核苷酸；和 含有選自SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29的至少一個雞Msxl基因
DNA序列的多核苷酸。 Msx2基因包括
編碼人Msx2蛋白的多核苦酸，所述蛋白由選自SEQIDNO:32, SEQID NO:34， SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38， SEQ ID NO:40， SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:50的至少一個氨基 酸序列組成；
編碼小鼠Msx2蛋白的多核苷酸，所述蛋白由選自SEQ ID NO: 52和SEQ IDNO:54的至少一個氨基酸序列組成；
編碼大鼠Msx2蛋白的多核苦酸，所述蛋白由選自SEQ ID NO: 5 6和SEQ IDNO:58的至少一個氨基酸序列組成；
編碼黑猩猩Msx2蛋白的多核香酸，所述蛋白由SEQ ID NO:60的氨基 酸序列組成；
編碼狗Msx2蛋白的多核苦酸，所述蛋白由選自SEQIDNO:62和SEQ IDNO:64的至少一個氨基酸序列組成；
編碼牛Msx2蛋白的多核苷酸，所述蛋白由SEQIDNO:66的氨基酸序 列組成；
編碼雞Msx2蛋白的多核苷酸，所述蛋白由SEQ ID NO:68的氨基酸序 列組成；和
編碼鵪鶇Msx2蛋白的多核苦酸，所述蛋白由SEQ ID NO:70的氨基酸 序列組成。
此外，Msx2基因包括
含有選自SEQIDNO:31， SEQIDNO:33， SEQIDNO:35, SEQIDNO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43， SEQ ID NO:45， SEQ ID NO:47和SEQ IDNO:49的至少一個人Msx2基因DNA序列的多核芬酸；
含有選自SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:53的至少一個小鼠Msx2基因DNA序列的多核香酸；
含有選自SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:57的至少一個大鼠Msx2基因
DNA序列的多核苷酸；
含有SEQIDNO:59的黑猩猩Msx2基因DNA序列的多核苦酸； 含有選自SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63的至少一個狗Msx2基因
DNA序列的多核苷酸；
含有SEQ ID NO:65的牛Msx2基因DNA序列的多核苷酸； 含有SEQIDNO:67的雞Msx2基因DNA序列的多核苷酸；和 含有SEQIDNO:69的鵪鵓Msx2基因DNA序列的多核苷酸。 本發(fā)明的Msxl基因或Msx2基因包括編碼與Msxl蛋白或Msx2蛋白
功能等同的蛋白質(zhì)的基因。通過評價與Msx 1基因或Msx2基因的表達(dá)相關(guān)
的生物學(xué)現(xiàn)象或功能，例如，通過評價基因是否在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖
細(xì)胞中選擇性表達(dá)，即可測定基因是否為"功能等同的"基因。
此外，當(dāng)編碼氨基酸序列(如SEQ ID NO:2的氨基酸序列和SEQ ID
NO:32的氨基酸序歹'J)的基因具有多態(tài)性時，與Msxl蛋白或Msx2蛋白功能
等同的蛋白質(zhì)包括具有多態(tài)性的蛋白質(zhì)。
編碼與Msxl蛋白功能等同的蛋白質(zhì)的基因包括
編碼Msxl蛋白(例如SEQ ID NO:2的氨基酸序列和SEQ ID NO:8的氨 基酸序列)經(jīng)一個或多個氨基酸殘基的插入、取代或缺失，或在氨基酸序列 的 一端或兩端添加所得的氨基酸序列(經(jīng)修飾的氨基酸序列)的基因；
在嚴(yán)緊條件下與編碼Msxl蛋白氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2的氨基 酸序列和SEQIDNO:8的氨基酸序歹'〗)的基因雜交的基因；和
編碼與Msxl蛋白氨基酸序歹'j(例如SEQ ID NO:2的氨基酸序列和SEQ IDNO:8的氨基酸序列)具有至少70%或更高同一性的氨基酸序列的基因。
此外，編碼與Msx2蛋白功能等同的蛋白質(zhì)的基因包括
編碼Msx2蛋白(例如SEQ ID NO:32的氨基酸序列和SEQ ID NO:52的 氨基酸序列)經(jīng)一個或多個氨基酸殘基的插入、取代或缺失，或在氨基酸序 列的 一端或兩端添加所得的氨基酸序列(經(jīng)修飾的氨基酸序列)的基因；
在嚴(yán)緊條件下與編碼Msx2蛋白氨基酸序列(例如SEQ ID NO:32的氨基 酸序列和SEQIDNO:52的氨基酸序列)的基因雜交的基因；和
編碼與Msx2蛋白氨基酸序列(例如SEQ ID NO:32的氨基酸序列和SEQIDNO:52的氨基酸序列)具有至少70%或更高同 一性的氨基酸序列的基因。
在本說明書中，"經(jīng)一個或多個氨基酸殘基的插入、取代或缺失，或在 氨基酸序列的一端或兩端添加"指的是通過眾所周知的技術(shù)方法，如定點i秀 變或通過在自然產(chǎn)生的程度下取代多個氨基酸而進(jìn)行的修飾。
Msxl蛋白或Msx2蛋白經(jīng)修飾的氨基酸序列可以是如下所述的氨基酸 序列，其中1-30,優(yōu)選1-20，更優(yōu)選1-9,更優(yōu)選1-5,特別優(yōu)選1或2個 氨基酸被插入、取代或缺失，或在氨基酸序列的一端或兩端凈皮添加。優(yōu)選 經(jīng)修飾的氨基酸序列可以是在Msxl蛋白或Msx2蛋白的氨基酸序列中具有 一個或多個(優(yōu)選一個或幾個，或1,2,3或4個)保守取代的氨基酸序列。
術(shù)語"保守取代"指的是一個或多個氨基酸殘基被其它化學(xué)類似氨基酸 殘基所取代，但實質(zhì)上不會改變蛋白質(zhì)的活性。例如，某個疏水殘基^L另 一個疏水殘基取代的情形，某個極性殘基被另 一個具有相同電荷的極性殘 基取代的情形。對每個氨基酸而言，可按照此方式被取代的功能類似的氨 基酸是本領(lǐng)域已知的。具體例如非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、 異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、曱碌^氨酸。極性(中性) 氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半 胱氨酸。帶正電(堿性)的氨基酸包括精氨酸、祖氨酸和賴氨酸。另外，帶負(fù) 電(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
在本說明書中，"雜交"指的是在嚴(yán)緊條件下與靶多核苷酸雜交。具體地 說，例如，當(dāng)使用缺省參數(shù)(最初的設(shè)置)，用同源性檢索軟件，如FASTA, BLAST, Smith-Waterman [Meth. Enzym.， 164, 765 (1988)]進(jìn)行計算時，與耙核 苷酸序列具有的同一性為至少70%或更高，優(yōu)選80°/?；蚋?，更優(yōu)選85% 或更高，更優(yōu)選90%或更高，更優(yōu)選95%或更高，特別優(yōu)選98%或更高， 最優(yōu)選99%或更高的多核苷酸。另外，"在嚴(yán)緊條件下"可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人 員通常使用的在雜交緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)的方法來進(jìn)行，以使溫度為 40-70°C,優(yōu)選為60-65°C,并在鹽濃度為15-300 mmol/L，優(yōu)選為15-60 mmol/L的漂洗溶液中進(jìn)行洗滌。可根據(jù)所用探針的長度適當(dāng)調(diào)整溫度和鹽 濃度。另外，洗滌雜交核苷酸的條件可以是0.2或2xSSC, 0.1%SDS,溫度 為20-68°C。至于控制嚴(yán)緊條件(高嚴(yán)緊度)或溫和條件(低嚴(yán)緊度)，洗滌時 的鹽濃度或溫度即可提供差異。當(dāng)由鹽濃度提供雜交差異時，可使用嚴(yán)緊 的洗滌緩沖液(高嚴(yán)緊度洗滌緩沖液)0.2xSSC和0.1。/。 SDS,以及溫和的洗滌緩沖液(低嚴(yán)緊度洗滌緩沖液)2xSSC和0.1% SDS。另外，當(dāng)由溫度提供 雜交差異時，嚴(yán)緊條件下的溫度為68。C,中度嚴(yán)緊條件下的溫度為42°C， 溫和條件下的溫度為室溫(20-25。C)，每種情形都可在0.2xSSC和0.1% SDS 中進(jìn)行。
一般說來，在與雜交相同的條件下進(jìn)行預(yù)雜交。然而，不局限于在相 同條件下進(jìn)行雜交和初步洗滌。
可根據(jù)已知方法進(jìn)行雜交。另外，在使用商購的文庫時，可根據(jù)所附 使用說明中描述的方法進(jìn)行雜交。
在本說明書中，與氨基酸序列有關(guān)的術(shù)語"同一性"(有時也稱之為同源 性)指的是在被比較的序列之間，各個序列的氨基酸殘基的同一性水平。此 時，要考慮缺口的存在和氨基酸的特性(Wilbur， Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730(1993))。為了計算同源性，可使用BLAST(Altschul: J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990》、FASTA (Peas應(yīng)Methods in Enzymiology 183:63-69 (1990))等。
與Msxl蛋白或Msx2蛋白氨基酸序列的同 一性至少為70%或更高的氨 基酸序列可以是同一性優(yōu)選為80%或更高，更優(yōu)選為85%或更高，更優(yōu)選 為90%或更高，更優(yōu)選為95%或更高，特別優(yōu)選為98%或更高，最優(yōu)選為 99%或更高的氨基酸序列。
"同 一性，，可以是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的同源性檢索程序計算出的 !K直,通過例長口4吏用NCBI (National Center for Biotechnology Information)的 同源性算法BLAST(Basic local alignment search tool) http:www.ncbi.nhTL nih.gov/BLAST/中的缺省參數(shù)(最初的設(shè)置)即可計算同一性。
本發(fā)明的抗體可特異性識別Msxl蛋白或Msx2蛋白。如上所述，Msxl 基因或Msx2基因的表達(dá)可用作多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的指標(biāo)。因此， 本發(fā)明的抗體可用作檢測多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的標(biāo)記物。
用于獲得本發(fā)明抗體的Msxl蛋白或Msx2蛋白可具有Msxl或Msx2 的抗原性，其包括在Msxl蛋白或Msx2蛋白氨基酸序列中進(jìn)行一個或多個 氨基酸殘基的缺失、插入、取代或添加所得的蛋白質(zhì)。已知在這種蛋白質(zhì) 中，會維持與原始蛋白質(zhì)相同的生物活性(Mark et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5662-6; Zoller and Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10:6487-500;Wang et al. (1984) Science 224:1431-3; and Dalbadie隱McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409-13)。缺失、插入、取代或添加一個或多個 氨基酸殘基，而能在蛋白質(zhì)中維持原始蛋白質(zhì)的抗原性的方法是已知的。 例如，編碼突變蛋白質(zhì)的多核苷酸可通過定點誘變的方法來制備，并能被 適當(dāng)表達(dá)(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1989)， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997); Sections 8.1-8.5; Hashimoto-Goto et al. (1995) Gene 152:271-5; Kinkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 82:488-92; Kramer and Fritz (1987) Method. Enzymol. 154:350-67; and Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85:2763-6)。
本發(fā)明的抗體包括特異于Msxl蛋白或Msx2蛋白的一部分的抗體。具 體地說，用于獲得本發(fā)明抗體的Msxl蛋白或Msx2蛋白包括具有Msxl蛋 白或Msx2蛋白的至少6個或更多個氨基酸殘基(例如6, 8， 10, 12或15個或 更多個氨基酸殘基)的多肽片段，以及具有全長氨基酸序列的多肽。本說明 書中Msxl蛋白或Msx2蛋白的多肽片段包括每一個片段，只要該片段具有 Msxl蛋白或Msx2蛋白的抗原性即可。
優(yōu)選的片段包括多肽片段，例如Msx 1蛋白或Msx2蛋白的氨基末端或 羧基末端。通過分析蛋白質(zhì)氨基酸序列的疏水性/親水性的方法 (Kyte-Doolittle(1982) J. Mol. Biol. 157:105-22)，或分析二級結(jié)構(gòu)的方法 (Chou-Fasman (1978) Ann. Rev. Biochem. 47:251-76)估計多肽的抗原決定蔟 位點，再通過計算機(jī)程序(Anal, Biochem. 151:540-6 (1985))或合成短肽并證 實抗原性的^支術(shù)，如PEPSCAN法(日本專利特許公開號60-500684)進(jìn)一步 證實該位點。
抗Msxl蛋白的抗體包括
抗具有選自SEQ ID NO:2， SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的至少一個氨 基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體；
抗具有選自SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO:IO、 SEQ ID NO:12和SEQ ID NO: 14的至少 一個氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體；
抗具有選自SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO:20的至少一個氨基酸序列的 蛋白質(zhì)或其部分的抗體；
抗具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體；抗具有SEQ IDNO:24的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體； 抗具有SEQIDNO:26的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體；和 抗具有選自SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30的至少一個氨基酸序列的 蛋白質(zhì)或其部分的抗體。
抗Msx2蛋白的抗體包括
抗具有選自SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36， SEQ ID NO:38， SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42， SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46， SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:50的至少一個氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗 體；
抗具有選自SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:54的至少一個氨基酸序列的 蛋白質(zhì)或其部分的抗體;
抗具有選自SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:58的至少一個氨基酸序列的 蛋白質(zhì)或其部分的抗體；
抗具有SEQ IDNO:60的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體； 抗具有選自SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的至少一個氨基酸序列的 蛋白質(zhì)或其部分的抗體；
抗具有SEQIDNO:66的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體； 抗具有SEQIDNO:68的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體；和 抗具有SEQ IDNO:70的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體。 本發(fā)明抗體的優(yōu)選實施方案提供了可識別Msxl蛋白或Msx2蛋白的高 辨別多肽部分的抗體。使用該抗體，可以較高的準(zhǔn)確度檢測到增殖祖細(xì)胞。 所述抗體包括抗Msxl蛋白的高辨別多肽部分的抗體，所述多肽部分例如可 為選自SEQ ID NO:2的氨基酸1-143和242-297， SEQ ID NO:4的氨基酸 1-216和315-370, SEQ ID NO:6的氨基酸1-143和242-297， SEQ ID NO:8 的氨基酸1-149和248-299, SEQ IDNO:IO的氨基酸1-143和242-297, SEQ ID NO:12的氨基酸1-149和248-303, SEQ ID NO:14的氨基酸1-143和 242-323, SEQIDNO:18的氨基酸1-143和242-297， SEQ IDNO:20的氨基 酸1-143和242-297, SEQ ID NO:22的氨基酸1-472和571-634, SEQ ID NO:24 的氨基酸1-208和298-353, SEQIDNO:26的氨基酸1-143和242-297, SEQ ID NO:28的氨基酸1-138和237-288，和SEQ ID NO:30的氨基酸1-100和 199-242的至少6個氨基酸殘基或全部氨基酸序列。此外，能以較高的準(zhǔn)確度檢測增殖祖細(xì)胞的抗體包括抗Msx2蛋白的高辨別多肽部分的抗體，所述
多肽部分例如可為選自SEQ ID NO:32的氨基酸1-120和218-267, SEQ ID NO:34的氨基酸1-120和218-268， SEQ ID NO:36的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:38的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:40的氨基酸1-120 和219-267， SEQ ID NO:42的氨基酸1-120和219-267, SEQIDNO:44的氨 基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:46的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:48的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:50的氨基酸1-119和218-266, SEQ ID NO:52的氨基酸1-121和220-268, SEQ ID NO:54的氨基酸1-121 和220-269, SEQ ID NO:56的氨基酸1-9和99-139, SEQ ID NO:58的氨基 酸1-9和99-139, SEQ IDNO:60的氨基酸1-466和527-576, SEQ IDNO:62 的氨基酸1-120和219-267, SEQIDNO:64的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:66的氨基酸1-120, SEQ ID NO:68的氨基酸1-112和211-259，和SEQ ID NO:70的氨基酸1-112和211-259的至少6個氨基酸殘基或全部氨基酸序 列。
Studies Hybridoma Bank。
通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，例如"Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987) and Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988),也 可獲得本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體 (scFv)、人源化抗體、多特異性抗體和抗體片段，如Fab, Fab'， F(ab，)2, Fc和 Fv。
對于多克隆抗體而言，抽取經(jīng)過抗原致敏的哺乳動物的血液，通過已 知方法從血液中分離出血清，用作含有多克隆抗體的血清。
根據(jù)需要，也可以進(jìn)一步分離含有多克隆抗體的級分。
對單克隆抗體而言，提取從經(jīng)過上述抗原致敏的哺乳動物的脾臟或淋 巴結(jié)中獲得的能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，并將所述細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。對所 得雜交瘤進(jìn)行克隆，從培養(yǎng)物中收集抗體以用作單克隆抗體。
可將Msxl蛋白或Msx2蛋白的片段用作免疫抗原。或者，可使用基于 上述氨基酸序列合成的抗原?？乖梢砸耘c載體蛋白形成復(fù)合物的形式來使用。為了制備抗原與載體蛋白的復(fù)合物，可使用多種凝聚劑(condensation), 如戊二醛、碳二亞胺、馬來酰亞胺-活化的酯等。載體蛋白可以是常用的那 些，如牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、血藍(lán)蛋白等， 一般以l-5倍量進(jìn)行連接。
被免疫的動物包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和倉鼠。注射方法包括皮下、 肌肉或腹膜內(nèi)給藥。給藥時，抗原可與完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑混 合。 一般每2-5周給藥一次。
將得自經(jīng)免疫動物的脾臟或淋巴結(jié)的能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞 進(jìn)行細(xì)胞融合，并分離雜交瘤。可使用得自小鼠、大鼠或人的骨髓瘤細(xì)胞， 優(yōu)選其與產(chǎn)生抗體的細(xì)胞源自相同物種，但源自不同物種的細(xì)胞有時也是
可以的。
可根據(jù)先前已知的方法，例如Nature, 256,495, 1975中公開的方法進(jìn)行 細(xì)胞融合。
融合促進(jìn)劑包括聚乙二醇或仙臺病毒，通常，在20-40°C，優(yōu)選30-37。C， 使用濃度約為20-50%的聚乙二醇(平均分子量為1000-4000),反應(yīng)約1-10 分鐘，使抗體生成細(xì)胞的數(shù)目與骨髓瘤細(xì)胞的數(shù)目之比大致約為1:1-10:1， 以進(jìn)行細(xì)胞融合。
為了篩選產(chǎn)生抗體的雜交瘤，可使用多種免疫化學(xué)方法。例如，使用 包被Msxl蛋白或Msx2蛋白的微滴板進(jìn)行ELISA法，使用包被抗-免疫球 蛋白抗體的微滴板進(jìn)行EIA法，以及將含Msxl蛋白或Msx2蛋白的樣品電 泳之后使用硝酸纖維素轉(zhuǎn)移膜進(jìn)行免疫印跡法。
通過例如有限稀釋法從所述孔中進(jìn)行進(jìn)一步克隆，籍此獲得克隆。一 般在添加了 HAT(次黃。票呤、氨基蝶呤和胸苷)的含有10-20%牛胚胎血清的 動物細(xì)胞培養(yǎng)基(例如RPMI1640)中進(jìn)行雜交瘤的選擇和培養(yǎng)。將按上述方 法獲得的克隆移植到預(yù)先施用過pristine的SCID小鼠的腹腔中，10-14天后， 收集含有高濃度單克隆抗體的腹水液以用作純化抗體的材料。另外，培養(yǎng) 克隆，培養(yǎng)物也可以是純化抗體的材料。
為了純化單克隆抗體，可使用先前已知的純化免疫球蛋白的方法，通 過例如硫酸銨分級分離法、PEG分級分離法、乙醇分級分離法、使用陰離 子交換劑、使用了 Msxl蛋白或Msx2蛋白的親和層析等可以容易地進(jìn)行純 化?？砂搭愃品椒ǎ瑥难逯屑兓嗫寺】贵w。 [沖全測方法]
Msxl基因或Msx2基因的表達(dá)可用作多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞存在 的指標(biāo)。因此，根據(jù)本發(fā)明，通過檢測Msxl基因或Msx2基因的表達(dá)，即 可檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
對本文所用的"4全測Msxl基因或Msx2基因表達(dá)"的方法沒有特別的限 制，只要它能檢測待測試細(xì)胞樣品中的Msxl基因或Msx2基因表達(dá)即可， 例如，所述方法包括雜交法、核酸擴(kuò)增法和抗原-抗體反應(yīng)法。
本文所用的"待測試細(xì)胞樣品，，可以是據(jù)認(rèn)為含有多巴胺能神經(jīng)元增殖 祖細(xì)胞的細(xì)胞樣品，可以使用中腦腹側(cè)區(qū)域的細(xì)胞。通過已知方法可獲得 中腦腹側(cè)區(qū)域的細(xì)胞(Studer, L., et al. Nature Neurosci (1998) 1:290-295)。優(yōu) 選將胎兒(優(yōu)選人流產(chǎn)胎兒)或患者本人中腦腹側(cè)區(qū)域的細(xì)胞用作待測試細(xì) 胞樣品。另外，可將培養(yǎng)物細(xì)胞用作待測試細(xì)胞樣品，所述培養(yǎng)物細(xì)胞中 含有在體外能被誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。通過將已知的ES
細(xì)月包(Kawasaki et al. Neuron (2000) 28(1):31-40 and Lee, SH.， et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、得自神經(jīng)的無限增殖化細(xì)胞系 (曰本專利特許公開號8-509215, 11-506930和2002-522070)、神經(jīng)元原基細(xì) 胞(日本專利特許公開號11-509729)等用作起始材料，用已知方法進(jìn)行分化 處理即可體外誘導(dǎo)其向多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞分化，所述方法如SDIA 法(Kawasaki et al. Neuron (2000) 28(1):31-40)或5-階4殳法(Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)。優(yōu)選將用SDIA法進(jìn)行分化處理的ES細(xì) 胞用作待檢測細(xì)胞樣 品。
通過在無血清培養(yǎng)基中共培養(yǎng)ES細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞系PA6來進(jìn)行本文所 用的"SDIA法，，(Kawasakietal. Neuron (2000) 28(1):31-40)。另外，可按下述 進(jìn)行"5-階段法"。在存在血清時，在非-貼壁的培養(yǎng)板上培養(yǎng)ES細(xì)月包，籍此 形成胚狀體(embryoid body, EB),隨后，將EB粘附在貼壁培養(yǎng)板上，籍此 選擇神經(jīng)元祖細(xì)胞。最后，在其中加入生長因子，如Shh、 FGF2或FGF8， 從而誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)。
根據(jù)本發(fā)明檢測方法的第 一 個實施方案，本發(fā)明的探針與核酸樣品 (mRNA或其轉(zhuǎn)錄物)雜交，檢測雜交復(fù)合物，即核苷酸雙鏈。因此，可檢測細(xì)胞樣品中的Msxl基因或Msx2基因表達(dá)。
關(guān)于雜交方法的詳細(xì)程序，可參考"Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.，，(Cold Spring Harbor Press (1989),特別是第9.47-9.58節(jié)， "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997》，特 別是第6.3和6.4節(jié)，"DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed." (Oxford University (1995),特別是與條件有關(guān)的第2.10節(jié))。
可通過例如下述步驟，利用雜交法檢測Msxl基因或Msx2基因的表達(dá)
(a) 使得自待測試細(xì)胞樣品的多核苷酸與本發(fā)明的多核苷酸探針接觸；
和
(b) 檢測雜交復(fù)合物。
在步驟(a)中，可將由據(jù)認(rèn)為含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的待測試 細(xì)胞樣品制備的mRNA,或由該mRNA轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)DNA(cDNA)用作得自 待測試細(xì)胞樣品的多核苷酸，進(jìn)而與探針接觸。
在使用探針的檢測方法中，可標(biāo)記探針。標(biāo)記物包括利用放射性(如"P, 14C和35S)、熒光(如FITC、銪)、酶(如過氧化物酶或堿性磷酸酶)反應(yīng)，如 化學(xué)顯色等的標(biāo)記物。
4吏用眾所周知的方法，如northern雜交、southern雜交或集落雜交即可
進(jìn)行雜交產(chǎn)物的檢測。
檢測到其中的雜交復(fù)合物的細(xì)胞是表達(dá)Msxl基因或Msx2基因的細(xì) 胞，因此，可被測定為多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明檢測方法的第二個實施方案，通過使用本發(fā)明的引物或引 物對的核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增核酸樣品(mRNA或其轉(zhuǎn)錄物)，并檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，即 可檢測到細(xì)胞樣品中的Msxl基因或Msx2基因表達(dá)。
通過例如下述步驟，可利用核酸擴(kuò)增法檢測Msxl基因或Msx2基因的 表達(dá)
(c) 使用得自待測試細(xì)胞樣品的多核苷酸作為模板，并使用本發(fā)明的多 核苷酸引物或多核苷酸引物對進(jìn)行核酸擴(kuò)增法；和
(d) 檢測所形成的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在步驟(c)中，可將由據(jù)認(rèn)為含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的待測試 細(xì)胞樣品制備的mRNA,或由該mRNA轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)DNA(cDNA)用作模板。 使用核酸擴(kuò)增法，如PCR法、RT-PCR法、實時PCR法或LAMP法可進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。
檢測到其中的擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞也表達(dá)Msx 1基因或Msx2基因，因此，
可被測定為多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明檢測方法的第三個實施方案，使本發(fā)明的抗體與細(xì)胞樣品
接觸，檢測抗原-抗體反應(yīng)。因此，可檢測到細(xì)胞樣品中的Msxl基因或Msx2 基因表達(dá)。
通過例如下述步驟，可利用抗原-抗體反應(yīng)檢測Msxl基因或Msx2基因 的表達(dá)
(e) 使得自待測試細(xì)胞樣品的蛋白質(zhì)與本發(fā)明的抗體接觸；和
(f) 測定抗原-抗體復(fù)合物。
檢測抗原-抗體反應(yīng)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，例如，可通 過免疫學(xué)方法，在據(jù)認(rèn)為含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的待測試細(xì)胞樣 品中檢測Msxl蛋白或Msx2蛋白。關(guān)于免疫學(xué)方法，可對根據(jù)需要經(jīng)適當(dāng) 處理，如細(xì)胞的分離或提取操作的細(xì)胞樣品使用先前已知的方法，如免疫 組織染色法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、western印跡法、凝集法、竟?fàn)幏ɑ驃A 心法。可通過例如使用經(jīng)標(biāo)記抗體的直接法，或使用經(jīng)標(biāo)記的抗抗體之抗 體的間接法來進(jìn)行免疫組織染色法。關(guān)于標(biāo)記試劑，可使用已知的標(biāo)記物 質(zhì)，如熒光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、酶、金屬或色素。
檢測到其中的抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞是表達(dá)Msx 1基因或Msx2基因的 細(xì)胞，因此，可被測定為多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
為了用于治療帕金森氏病，多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的純度較高才 是合乎需要的。
通過將上述檢測步驟中的每一步重復(fù)多次，而不是一次，即可增強(qiáng)檢 測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的準(zhǔn)確度。
因此，根據(jù)本發(fā)明的檢測方法，通過將上述步驟進(jìn)行兩次或多次，即 可以高準(zhǔn)確度;f僉測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
另外，通過同時使用其它標(biāo)記基因，優(yōu)選除Msxl基因和Msx2基因以 外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因，也可增強(qiáng)^f企測或選擇多巴胺能 神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的準(zhǔn)確度。
因此，根據(jù)本發(fā)明的檢測方法，通過同時使用除Msxl基因和Msx2基 因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因以及有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因等，并同時檢測Msxl基因或Msx2基因的表達(dá)以及 上述其它標(biāo)記基因的表達(dá)，也可以較高的準(zhǔn)確度檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)
元增歹i^且細(xì)〗包。
圖1顯示了在各個分化階段選擇性表達(dá)的與多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)的標(biāo) 記基因。
在特征在于檢測Msxl基因或Msx2基因表達(dá)的檢測方法中，通過同時 使用除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基 因，同時檢測Msxl基因或Msx2基因以及除Msxl基因和Msx2基因以外 的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因，即可以高準(zhǔn)確度檢測或選擇多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
具體地說，在步驟(a)、步驟(c)或步驟(e)中，通過將其中的除Msxl基 因和Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)需被檢 測的細(xì)胞用作待測試細(xì)胞樣品，即可以高準(zhǔn)確度檢測或選擇多巴胺能神經(jīng) 元增殖祖細(xì)胞。此時，在步驟(b)中被檢測雜交復(fù)合物的細(xì)胞，在步驟(d)中 被檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞，在步驟(f)中被檢測抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞各自表 達(dá)Msxl基因或Msx2基因和除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神 經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因。因此，可以高準(zhǔn)確度將細(xì)胞測定為被檢測或選 擇的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
另外，關(guān)于在步驟(b)中被檢測雜交復(fù)合物的細(xì)胞，在步驟(d)中被檢測 擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞，以及在步驟(f)中被檢測抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞，分別進(jìn) 行檢測除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基 因表達(dá)的步驟(g-l)，即可以高準(zhǔn)確度檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì) 胞。此時，在步驟(g-l)中，其中的除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺 能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)需被檢測的細(xì)胞是表達(dá)Msxl基因或 Msx2基因，以及除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖 細(xì)胞標(biāo)記基因的細(xì)胞。因此，可以高準(zhǔn)確度將細(xì)胞測定為被檢測或選擇的 多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
在特征在于檢測Msxl基因或Msx2基因表達(dá)的檢測方法中，通過同時 使用有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因，可以證實表達(dá)了 Msxl基因或Msx2基因，但未檢測到有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì) 胞標(biāo)記基因的表達(dá)。因此，可以高準(zhǔn)確度檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖前體細(xì)胞。
具體地說，在步驟(a)、步驟(c)或步驟(e)中，通過使用未^^測到其有絲
分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的細(xì)胞，即可以高準(zhǔn)確度
檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。此時，在步驟(b)中被檢測雜交復(fù) 合物的細(xì)胞，在步驟(d)中被檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞，在步驟(f)中被檢測抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞各自表達(dá)Msxl基因或Msx2基因，但不表達(dá)有絲分裂后 的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因。因此，可以高準(zhǔn)確度將細(xì)胞測定為 被才企測或選4奪的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
另外，關(guān)于在步驟(b)中被檢測雜交復(fù)合物的細(xì)胞，在步驟(d)中被檢測 擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞，以及在步驟(f)中被;險測抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞，分別進(jìn) 行檢測有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的步驟(g-2), 即可以高準(zhǔn)確度檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。此時，在步驟(g-2) 中，其中的有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)未被檢 測到的細(xì)胞是表達(dá)Msxl基因或Msx2基因，但不表達(dá)有絲分裂后的多巴胺 能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因的細(xì)胞。因此，可以高準(zhǔn)確度將細(xì)胞測定為被 檢測或選擇的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
"除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基 因"包括在中腦最腹側(cè)腦室區(qū)域(VZ區(qū))表達(dá)的、除Msxl基因和Msx2基因 以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因，其包括Lrp4基因、Nato3基 因和Mashl基因。
Lrp4基因描述于WO 2004/065599。 Mashl基因描述于Kele J, Simplicio N, Ferri AL, Mira H, Guillemot F， Arenas E， Ang SL. Neurogenin 2 is required for the development of ventral midbrain dopaminergic neurons , 以及 Development. 2006 Feb; 133(3):495-505。本發(fā)明人已證實Nato3基因在多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中選擇性表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。
對除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基 因的檢測沒有限制，只要使用可^r測已知基因表達(dá)的方法即可，例如，所 述方法包括上述的雜交法、核酸擴(kuò)增法和抗原-抗體反應(yīng)法。
"有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因，，包括在中腦最腹側(cè) 套層(ML區(qū))表達(dá)的基因，其包括Nurrl基因、Enl基因、En2基因、Ptx3 基因和TH基因。另外，標(biāo)記基因包括在中腦最腹側(cè)腦室區(qū)(VZ區(qū))表達(dá)的基因，其包括65B13基因。
Nurrl基因描述于Science. 1997 11; 276(5310):248-50。 Enl基因描述于 J. Neu薩i. 2001 21(9): 3126-34。 En2基因描述于J. Ne畫ci. 2001 21(9) 3126-34。 Ptx3基因描述于Proc.Natl.Acad.Sci. 1997 94: 13305-10。 TH基因 描述于Science 1997 11; 276(5310):248-50。 65B13基因描述于WO 2004/ 038018。
對有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因的檢測沒有特別的 限制，只要使用可檢測已知基因表達(dá)的方法即可，例如，所述方法包括上 述的雜交法、核酸擴(kuò)增法和抗原-抗體反應(yīng)法。
本發(fā)明的檢測方法可用于篩選物質(zhì)，所述物質(zhì)能有效誘導(dǎo)生成多巴胺 能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過程。具體地說，通過使用Msxl基因或Msx2 基因的表達(dá)為指標(biāo)，測定待測試的物質(zhì)的添加是否能誘導(dǎo)生成多巴胺能神 經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過程，即可篩選出能有效誘導(dǎo)生成多巴胺能神經(jīng)元 增殖祖細(xì)胞的分化過程的物質(zhì)。
因此，本發(fā)明提供了篩選物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)能有效誘導(dǎo)生成多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過程，所述方法包括下述步驟(i) 使能分化成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞與待測試的物質(zhì)接
觸；和
(ii) 檢測與待測試物質(zhì)接觸的細(xì)胞中的Msxl基因或Msx2基因表達(dá)。 步驟(i)中可分化成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞優(yōu)選收集自胚胎
中腦腹側(cè)區(qū)域，或收集自含有由ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元祖細(xì)胞的培養(yǎng)物 細(xì)胞。
通過例如在含有能分化成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞的培養(yǎng)物 細(xì)胞中加入待測試物質(zhì)，即可進(jìn)行步驟(i)中的"與待測試物質(zhì)接觸"。
"待測試物質(zhì)"包括合成的低分子量化合物、蛋白質(zhì)、合成的肽、純化或 部分純化的多肽、抗體、細(xì)菌-釋放物質(zhì)(含有細(xì)菌代謝產(chǎn)物)和核酸(如反義 核酸、核酶和RNAi)，優(yōu)選為化合物或其鹽，或其溶劑化物(如水合物)，但 并不局限于此。"待測試物質(zhì)"可以是新物質(zhì)或已知物質(zhì)。
在步驟(ii)中，根據(jù)本發(fā)明的檢測方法，可檢測到Msxl基因或Msx2基 因的表達(dá)。
具體地說，進(jìn)行步驟(a)和(b)以利用雜交法進(jìn)行檢測。進(jìn)行步驟(c)和(d) 以利用核酸擴(kuò)增法進(jìn)行檢測。進(jìn)行步驟(e)和(f)以利用抗原-抗體反應(yīng)進(jìn)行檢 測。因此，可檢測到Msxl基因和Msx2基因的表達(dá)。
在步驟(ii)中，當(dāng)通過與待測試物質(zhì)接觸檢測到細(xì)胞樣品中的Msxl基 因和Msx2基因表達(dá)時，可將該物質(zhì)測定為能有效誘導(dǎo)生成多巴胺能神經(jīng)元 增殖祖細(xì)胞的分化過程的物質(zhì)。
通過本發(fā)明的篩選方法篩選出的物質(zhì)可用作能有效誘導(dǎo)生成多巴胺能 神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過程的物質(zhì)。
本發(fā)明提供了篩選物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)能有效誘導(dǎo)生成多巴胺能神 經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過程，所述方法還包括下述步驟
(iii) 檢測除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞 標(biāo)記基因的表達(dá)。
當(dāng)在步驟(ii)中檢測到Msxl基因或Msx2基因的表達(dá)，在步驟(iii)中檢 測到除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因 的表達(dá)時，可以高準(zhǔn)確度將物質(zhì)測定為能有效誘導(dǎo)生成多巴胺能神經(jīng)元增 殖祖細(xì)胞的分化過程的物質(zhì)。
步驟(iii)可在步驟(i)之后進(jìn)行，可在步驟(ii)之前或之后進(jìn)行。"除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基 因"包括在中腦最腹側(cè)腦室區(qū)域(VZ區(qū))表達(dá)的、除Msxl基因和Msx2基因 以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因，其包括例如Lrp4基因、Nato3 基因和Mashl基因。
對除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基 因的檢測沒有特別的限制，只要使用可檢測已知基因表達(dá)的方法即可，例 如，所述方法包括上述的雜交法、核酸擴(kuò)增法和抗原-抗體反應(yīng)法。
本發(fā)明的檢測方法可^r測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。多巴胺 能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞可用于治療帕金森氏病。因此，可使用Msxl基因或 Msx2基因的表達(dá)為指標(biāo)，由被檢測或選擇的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞制 備可用于治療帕金森氏病的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
本發(fā)明提供了制備多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的方法，所述方法包括 下述步驟
(iv) 獲得含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞；
(v) 使用本發(fā)明的檢測方法檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞；和
(vi) 培養(yǎng)步驟(v)中檢測或選擇的細(xì)胞。
本發(fā)明提供了治療帕金森氏病的方法，所述方法包括將通過本發(fā)明的 檢測方法檢測或選擇的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞，或通過本發(fā)明的制備 方法產(chǎn)生的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞移植到包括人的哺乳動物體內(nèi)的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的治療方法，移植的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞能產(chǎn)生多 巴胺，因此，可預(yù)防和/或治療帕金森氏病。
當(dāng)進(jìn)行本發(fā)明的治療方法時，可能含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的 細(xì)胞可收集自哺乳動物，包括人，優(yōu)選收集自接受移植的個體或流產(chǎn)胎兒。
多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞可^:移植到腦，優(yōu)選移植到中腦。
在本說明書中，"檢測"包括"區(qū)分"。
實施例
下文將通過實施例具體解釋本發(fā)明，但下文的實施例不會限制本發(fā)明 的范圍。[實施例11 Msxl基因和Msx2基因的表達(dá)分析 (1)通過RT-PCR法進(jìn)行分析
為了證實Msxl基因和Msx2基因在多巴胺能神經(jīng)元系的細(xì)胞中表達(dá)， 根據(jù)下述方法，通過RT-PCR法研究Msxl， Msx2， DAT, Lmxla和Lrp4的 mRNA在小鼠胚胎中腦各個區(qū)域中的表達(dá)。此處，DAT是多巴胺能神經(jīng)元 的標(biāo)記基因(Development. 2004; 131(5):1145-55.)， Lmxla是多巴胺能神經(jīng)元 和多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的標(biāo)記基因(W02005/052190), Lrp4是多巴胺能 神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的標(biāo)記基因(W02004/065599)。
從12.5日齡小鼠(得自SLC)胚胎中切下圖2所示的中腦的4個區(qū)域(V 區(qū)最腹側(cè)區(qū)域，VL區(qū):.腹側(cè)區(qū)域，DL區(qū)背側(cè)區(qū)域，和D區(qū):最背側(cè) 區(qū)域)，使用RNeasy微型試劑盒(Qiagen)制備總RNA,使用cDNA合成試劑 盒(TAKARA)合成雙鏈cDNA。接著，用限制性酶Rsal (TAKARA)消化合成 的cDNA,然后在其中加入ad2,使用ad2S為引物進(jìn)行PCR，籍此擴(kuò)增出 cDNA并用作RT-PCR的模板。在下述條件下進(jìn)行擴(kuò)增72。C保溫5分鐘， 然后于94。C反應(yīng)30秒，65。C反應(yīng)30秒，72°C反應(yīng)2分鐘，共15個循環(huán)， 最后，于72。C保溫2分鐘。
ad2S: cagctccacaacctacatcattccgt (SEQ ID N0:71)
ad2A: acggaatgatgt (SEQ ID NO:72)
接著，使用與4ng、 0.4ng和0.04ng經(jīng)擴(kuò)增的cDNA相當(dāng)?shù)腸DNA為模 板，在下述反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR。10xExTaq 1 fil
2.5 mM dNTP 0.8 jal
ExTaq 0.05 |il
100pM引物 各為0.1(il cDNA 1 pl
蒸餾水 6.95 pi
94。C保溫2分鐘之后，94。C30秒，65。C30秒，72。C2分鐘以進(jìn)行擴(kuò) 增反應(yīng)，最后，于72。C保溫2分鐘。對Lrp4, DAT和Lmxla進(jìn)行26個PCR 擴(kuò)增循環(huán)，對Msxl進(jìn)行32個PCR擴(kuò)增循環(huán)，對Msx2進(jìn)行27個PCR擴(kuò) 增循環(huán)。
PCR中使用了下列引物。Lrp4: tagtctaccactgctcgactgtaacg (SEQ ID NO:73)
cagagtgaacccagtggacatatctg (SEQ ID NO:74)
DAT: cagaatcctgtgctcacggtagttgc (SEQ ID NO: 75)
actaaagtggctgcaagctgaccagg (SEQ ID NO:76)
Lmxla:tggttcaggtgtggttccagaaccag (SEQ ID NO:77)
tctgaggttgccaggaagcagtctcc (SEQ ID NO:78)
Msxl: tagcctacatgggcggtgtagagtcc (SEQ ID NO:79)
caccgagacccaggtgaagatgatgg (SEQ ID NO:80)
Msa2: atatccaaccggcgtggcatagagtc (SEQ ID NO:81)
tggttccagaaccgaagggctaaggc (SEQ ID NO: 82) 結(jié)果，揭示出Msxl基因和Msx2基因的mRNA在中腦的V區(qū)和D區(qū) 中選擇性表達(dá)，在所述區(qū)域中，多巴胺能神經(jīng)元和多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì) 胞的標(biāo)記基因被表達(dá)(圖3)。
(2)通過原位雜交進(jìn)行分析
另外，為了詳細(xì)研究表達(dá)模式，根據(jù)下述方法，通過原位雜交進(jìn)行Msxl 、 Nurrl和酪氨酸羥化酶(TH) mRNA的表達(dá)分析。Nurrl和TH是標(biāo)記基因， 已知它們在多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞中，能在有絲分裂后最先被誘導(dǎo)表達(dá) (Science. 1997 11; 276(5310):248-50.)。
首先，通過下述方法產(chǎn)生DIG-探針。
從12.5日齡小鼠(得自SLC)胚胎中切下中腦后腦區(qū)域，使用RNeasy微 型試劑盒(Qiagen)制備總RNA，使用cDNA合成試劑盒(TAKARA)合成雙鏈 cDNA。使用合成的cDNA為模板，擴(kuò)增Msxl、 Nurrl和TH的cDNA。
10xExTaq 5 )al
2.5 mM dNTP 4 jixl
ExTaq 0.25 pi
100)iM引物 各為0.5pl
cDNA 1 pi
蒸餾水 38.75 |il
在下述條件下進(jìn)行擴(kuò)增94°C保溫5分鐘，然后于94。C反應(yīng)30秒， 65。C反應(yīng)30秒，72。C反應(yīng)2分鐘，共35個循環(huán)，最后，于72。C保溫2 分鐘。PCR中使用了下列引物。
Msxl: gccttcggcctctcttttcctcttgg (SEQ ID NO:83) ttcaaaagggatgcttgagagccacg (SEQ ID NO:84) TH:
gctgtcacgtccccaaggttcattgg (SEQ ID NO: 8 5) ggagcgcatgcagtagtaagatgtgg (SEQ ID NO:86) Nurrl: catatgatcgagcagaggaagacacc (SEQ ID NO:87) agtgcgaacaccgtagtgctgacagg (SEQ ID NO:88) 將擴(kuò)增的cDNA片段克隆至pCRII (Invitrogen)并用作模板，從而通過下 述反應(yīng)體系合成DIG-探針(所有試劑皆購自Roche)。 RNA聚合酶緩沖液 2)^1 NTP標(biāo)記混合物 2jil Rnase^中制劑 1 |il
RNA聚合酶(T7或SP6) 2 模板DNA 1嗎
蒸餾水 總量為20 pi
37。C放置2小時之后，于37°C用DNasel (Roche)處理15分鐘，通過 乙醇沉淀收集DIG-RNA探針。
接著，取出11.5日齡的小鼠胚胎，于4。C使用4%PFA(WAKO)/PBS(-) 固定2小時，然后，于4。C,替換成20。/。蔗糖(WAKO)/PBS (-)溶液放置過夜， 用OCT (Sakura Seiki Co.， Ltd.)包埋胚胎。制備12 pm厚的切片，在載玻片 上干燥，然后于室溫使用4。/。PFA再固定30分鐘。用PBS洗滌之后，于68。C 雜交(lpg/ml DIG-RNA探針，50%曱酰胺(Nacalai Tesque， Inc.), 5xSSC, 1% SDS, 50嗎/ml酵母RNA(Sigma)， 50jag/ml肝素)40小時。然后于68。C進(jìn)行 洗滌(50%甲酰胺，5xSSC和1°/。SDS),于68。C再次進(jìn)4亍洗滌(50%甲酰胺， 5xSSC)。室溫用lxTBST洗滌，然后進(jìn)行封閉(封閉劑Roche)。于4。C將 經(jīng)堿性磷酸酶-標(biāo)記的抗-DIG抗體(DAKO)反應(yīng)過夜，洗滌(lxTBST, 2mM 左旋。米唑)之后，將NBT/BCIP (DAKO)用作生色底物。
結(jié)果表明在處于生成多巴胺能神經(jīng)元階段的11.5日齡小鼠胚胎中， Msxl的mRNA按照與TH和Nurrl的mRNA相同的方式在V區(qū)強(qiáng)表達(dá)(圖 4)。另外，TH和Nurrl的mRNA僅在存在有絲分裂后的神經(jīng)元的套層(ML) 區(qū)表達(dá)，與之形成對照的是，Msxl的mRNA不在ML區(qū)表達(dá)，而僅在存在增殖祖細(xì)胞的腦室區(qū)(VZ)表達(dá)(圖4)。上述結(jié)果揭示出Msxl的mRNA在多 巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中選擇性地表達(dá)。
Msxl蛋白和Msx2蛋白的表達(dá)分析
才妄著，通過4吏用才元-Msxl/2 ^元體(Developmental Studies Hybridoma Bank (http:〃www.uiowa.edu/ dshbwww/))研究Msx 1/2蛋白的表達(dá)。另夕卜，通過l吏 用抗-Lmxla抗體進(jìn)4亍雙染色。
取出11.5日齡的小鼠胚胎，于4。C使用4Q/oPFA(WAKO)/PBS(-)固定2 小時，然后，于4。C，替換成20。/。蔗糖(WAKO)/PBS (-)溶液放置過夜，用 OCT(SakuraSeikiCo.，Ltd.)包埋胚胎。制備12pm厚的切片，固定在載玻片 上，室溫干燥30分鐘，然后再用PBS(-)潤濕。接著，于室溫封閉(BIockase (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.))30分鐘，然后，室溫與第一抗體 (Developmental Studies Hybridoma Bank)反應(yīng)1小時，隨后，于4。C反應(yīng)過 夜。室溫使用0.1。/。吐溫-20/PBS(-)洗滌15分鐘，共3次。接著，室溫使經(jīng) 熒光-標(biāo)記的第二抗體(Jackson)反應(yīng)1小時，按相同的方式進(jìn)4亍洗滌，然后 于室溫用PBS(-)洗滌IO分鐘，并密封。
結(jié)果表明Msxl/2在11.5日齡小鼠胚胎的中腦中被表達(dá)成蛋白質(zhì)以及 mRNA(圖5)。抗-Lmxla抗體的雙染色結(jié)果表明Msxl/2蛋白與Lmxla蛋 白共表達(dá)在VZ區(qū)的相同細(xì)胞中，因此揭示出在背腹側(cè)方向，表達(dá)區(qū)域彼 此完全對應(yīng)(圖5)。
另外，當(dāng)根據(jù)上述方法研究與Msxl/2蛋白表達(dá)有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū) 域特異性時，得出以下結(jié)果Msxl/2蛋白在產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元的中腦腹 側(cè)區(qū)，特別是VZ區(qū)選擇性地表達(dá)(圖6)。
Msxl基因和Msx2基因在由ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神 經(jīng)元中的表達(dá)
本實施例研究了當(dāng)ES細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元時，Msxl基 因和Msx2基因是否表達(dá)。
首先，根據(jù)SDIA法(Kawasaki et al. Neuron. 2000 28(1):31-40.)， ES細(xì)胞 (小鼠CCE品系，由Riken CDB的Mr. Nishikawa才是供，Kawasaki et al. Neuron. 2000 28(1):31-40.)被誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元。誘導(dǎo)4, 6, 8， 10, 12天后收 集細(xì)胞。使用Rneasy微型試劑盒(Qiagen)制備總KNA,進(jìn)行RT-PCR。首先， 對于1嗎總RNA，使用RNA PCR試劑盒(TAKARA)進(jìn)行cDNA合成。使用相當(dāng)于10ng, 1 ng和O.l ng的cDNA為模板，在下述反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR。 10xExTaq 2 jil
2.5mMdNTP 1.6 |il
ExTaq 0.1 |il
100pM引物 各為0.2pl cDNA 1 pi
蒸餾水 14.9 pi
94。C保溫2分鐘，然后于94。C反應(yīng)30秒，65。C反應(yīng)30秒，72。C反 應(yīng)2分鐘，共35個循環(huán)，最后，于72。C保溫2分鐘。 PCR中使用了下列引物。
TH:
gttcccaaggaaagtgtcagagttgg (SEQ ID NO:89) gaagctggaaagcctccaggtgttcc (SEQ ID NO:90) DAT: ctccgagcagacaccatgaccttagc (SEQ ID NO:91) aggagtagggcttgtctcccaacctg (SEQ ID NO:92) Nurrl: cactcctgtgtctagctgccagatgc (SEQ ID NO:93) agtgcgaacaccgtagtgctgacagg (SEQ ID NO:94) Ptx3: tgagccgcaggtctgtggatccatcc (SEQ ID NO:95) tccctgttcctggccttagtcctagg (SEQ ID NO:96) Enl: atcctccgagtggacattcacatagg (SEQ ID NO:97) atgtccagcaaatagagatcgctacac (SEQ ID NO:98) 另外，對于Msxl、 Msx2和Lmxla而言，使用的是實施例1中的引物。 此外，已知Ptx3和Enl是有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的標(biāo)記物。 結(jié)果，在ES細(xì)胞(CCE)中未檢測到Msxl mRNA的表達(dá)，但該結(jié)果表 明作為分化誘導(dǎo)的結(jié)果，從第4天開始，按照與Lmxla相同的方式誘導(dǎo) 表達(dá)，所述Lmxla是多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的標(biāo)記基因(圖7)。
另 一方面，在ES細(xì)胞(CCE)中檢測到Msx2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明 經(jīng)分化誘導(dǎo)后，表達(dá)有所增加(圖7)。
Msxl基因和Msx2基因在通過Lrp4分選的多巴胺能神經(jīng)元 增殖祖細(xì)胞中的表達(dá)
為了證實Msxl基因和Msx2基因在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中表 達(dá)，使用在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中選擇性表達(dá)的Lrp4作為標(biāo)記物，分別從得自12.5日齡小鼠胚胎中腦的細(xì)胞和SDIA分化誘導(dǎo)細(xì)胞中分離多 巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞，并研究這些細(xì)胞中的Msxl mRNA和Msx2 mRNA表達(dá)。
首先，將編碼Lrp4基因胞外區(qū)域(161-502氨基酸)的基因序列轉(zhuǎn)染至 293E細(xì)胞(ATCC),表達(dá)并收集Lrp4蛋白的胞外區(qū)域。用收集的蛋白質(zhì)免 疫倉鼠(得自SLC),然后，提取淋巴細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞(ATCC)融合，以獲 得能產(chǎn)生抗-Lrp4抗體的雜交瘤。
使用細(xì)胞解離緩沖液TM(Invitrogen)分散細(xì)胞群，該細(xì)胞群含有得自12.5 曰齡小鼠胚胎中腦，或在體外由ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化成的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì) 胞，然后，無需經(jīng)固定和透化處理，于4。C用抗-Lrp4單克隆抗體(由雜交瘤 (保藏號為FERM BP-10315和FERM BP-10316)產(chǎn)生的抗體，稀釋至1/2的 培養(yǎng)物上清液，P/。胎牛血清(JRH), lmMEDTA/SDIA分化培養(yǎng)基(Kawasaki et al. Neuron (2000)28(1):31-40))將細(xì)胞染色20分鐘。然后，于4。C用1%胎 牛血清和lmM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基洗滌3分鐘，共3次，于4。C使用 經(jīng)生物素標(biāo)記的抗-倉鼠IgG抗體(Jackson, 10嗎/ml， 1。/。胎牛血清，lmM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基)將細(xì)胞染色20分鐘，然后，按相同的方式進(jìn)行洗 滌。于4。C使用經(jīng)PE標(biāo)記的鏈霉親和素(Pharmingen， 20 pg/ml， 1%胎牛血 清，lmMEDTA/SDIA分化培養(yǎng)基)將細(xì)胞染色20分鐘，然后，按相同的方 式進(jìn)行洗滌。染色后，通過細(xì)胞分選儀(FACS vantage SE,Becton Dickinson) 分離Lrp4陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞(圖8)。分離后，立即使用Rneasy微型試劑 盒(Qiagen)從細(xì)胞中制備總RNA，使用eDNA合成試劑盒(TAKARA)合成雙 鏈cDNA。用限制性酶RsaI(TAKARA)消化之后，在其中加入ad2，將ad2S 用作引物，通過15個PCR循環(huán)擴(kuò)增cDNA,并用作RT-PCR的模板。在下 述條件下進(jìn)行擴(kuò)增72。C保溫5分鐘，然后于94。C反應(yīng)30秒，65。C反應(yīng) 30秒，72。C反應(yīng)2分鐘，共15個循環(huán)，最后，于72。C保溫2分鐘。
接著，使用相當(dāng)于4ng、 0.4ng和0.04ng擴(kuò)增cDNA的cDNA為模板， 在下述反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR。
10xExTaq 1 jul
2.5 mM dNTP 0.8
ExTaq 0.05 pl
100pM引物
各為0.1 plcDNA 1 |il
蒸餾水 6.95 j^l
使用了具有上述序列的引物。
94。C保溫2分鐘之后，94。C30秒，65。C30秒，72。C2分鐘以進(jìn)行擴(kuò) 增反應(yīng)，最后，于72。C保溫2分鐘。對Lmxla和Nurrl進(jìn)行24個PCR擴(kuò) 增循環(huán)，對其它的進(jìn)行26個PCR擴(kuò)增循環(huán)。
結(jié)果，在得自12.5日齡小鼠胚胎中腦的細(xì)胞中，Msxl mRNA和Msx2 mRNA在Lrpl陽性細(xì)胞群體(即多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞)中強(qiáng)表達(dá)(圖 9)。另外，在SDIA分化誘導(dǎo)細(xì)胞中，Msxl mRNA或Msx2 mRNA在Lrp4-陽性細(xì)胞群體中強(qiáng)表達(dá)(圖9)。因此揭示出Msxl mRNA或Msx2 mRNA在 多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞、SDIA分化誘導(dǎo)細(xì)胞以及得自小鼠胚胎中腦的 細(xì)胞中表達(dá)。
因此，本發(fā)明揭示出Msxl基因和Msx2基因是有用的標(biāo)記物，它不僅 可區(qū)分得自胚胎中腦的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞，還能區(qū)分在體外由ES 細(xì)胞誘導(dǎo)分化成的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.用于檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的多核苷酸探針或多核苷酸引物，所述探針或引物能與由Msx1基因或Msx2基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列組成的多核苷酸雜交。
2. 根據(jù)權(quán)利要求
1的多核苷酸探針或多核苷酸引物，所述探針或引物 由含有Msxl基因或Msx2基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中至少10個連 續(xù)核苷酸的多核苷酸組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求
1或2的多核苷酸探針或多核苷酸引物，其中Msxl基 因或Msx2基因的核苦酸序列含有部分或完整的選自由以下核苦酸序列組 成的組的核苦酸序列SEQ ID NO:l的核苦酸1-710和963-1713, SEQ ID NO:3的核苷酸1-677和943-1546, SEQ ID NO:5的核苷酸1-484和 736-1316， SEQ ID NO:7的核苷酸1-612和864-1801, SEQIDNO:9的核苷 酸1-737和976-1724, SEQ ID NO: 11的核苷酸1-525和777-1189, SEQ ID NO:13的核苷酸1-612和864-1810, SEQ ID NO:15的核苷酸1-754和 994-1754， SEQ ID NO:16的核芬酸1-744和996-1935, SEQIDNO:17的核 苦酸1-610和864-1806, SEQ ID NO: 19的核苦酸1-610和864-1785, SEQ ID NO:21的核苷酸1-1456和1710-1905， SEQ ID NO:23的核苷酸1-625和 891-1062, SEQ ID NO:25的核香酸1-709和963-1895, SEQIDNO:27的核 苷酸1-520和786-1310， SEQ ID NO:29的核苦酸1-510和767-1259, SEQ ID NO:31的核香酸1-473和712-2180, SEQ ID NO:33的核苷酸1-468和 707-1138， SEQIDNO:35的核香酸1-435和674-1143， SEQIDNO:37的核 香酸1-473和712-1164, SEQ ID NO:39的核苷酸1-473和712-1164, SEQ ID NO:41的核瞽酸1-473和712-2048, SEQ ID NO:43的核苷酸1-473和 712-2182, SEQ ID NO:45的核苷酸1-413和651-804, SEQ ID NO:47的核苷 酸1-431和670-2605， SEQ ID NO:49的核苷酸1-435和674-2136, SEQ ID NO:51的核苷酸1-778和1015-1452， SEQ ID NO:53的核苷酸1-780和 1017-1453， SEQ ID NO:55的核苦酸1-370和609-800, SEQIDNO:57的核 苷酸1-29和267-420， SEQIDNO:59的核苷酸1-1340和1578-1731, SEQ ID NO:61的核苷酸1-541和778-2225， SEQ ID NO:63的核苷酸1-404和 651-804， SEQIDNO:65的核苷酸1-632, SEQIDNO:67的核苷酸1-489和728-1107,和SEQIDNO:69的核苦酸1-487和708-2569。
4. 根據(jù)權(quán)利要求
1至3中任一項的多核苷酸探針或多核苷酸引物，其 長度至少為15個;威基。
5. 多核苷酸引物套，含有根據(jù)權(quán)利要求
1至4中任一項的多核苷酸引物。
6. 抗Msxl蛋白或Msx2蛋白或其部分的抗體，是用于檢測或選擇多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求
6的抗體，其中Msxl蛋白或Msx2蛋白或其部分含有 選自下組的氨基酸序列中的至少6個氨基酸殘基或其整個序列SEQ ID NO:2的氨基酸1-143和242-297, SEQIDNO:4的氨基酸1-216和315-370, SEQ ID NO:6的氨基酸1-143和242-297, SEQ ID NO:8的氨基酸1-149和 248-299， SEQIDNO:10的氨基酸1-143和242-297, SEQIDNO:12的氨基 酸1-149和248-303, SEQ ID NO: 14的氨基酸1-143和242-323, SEQ ID NO: 18 的氨基酸1-143和242-297， SEQ IDNO:20的氨基酸1-143和242-297， SEQ ID NO:22的氨基酸1-472和571-634, SEQ ID NO:24的氨基酸1-208和 298-353, SEQIDNO:26的氨基酸1-143和242-297, SEQIDNO:28的氨基 酸1-138和237-288， SEQ ID NO:30的氨基酸1-100和199-242, SEQ ID NO:32 的氨基酸1-120和218-267， SEQIDNO:34的氨基酸1-120和218-268， SEQ ID NO:36的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:38的氨基酸1-120和219- 267, SEQ ID NO:40的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:42的氨基 酸1 -120和219-267 ， SEQ ID NO:44的氨基酸1 -120和219-267, SEQ ID NO:46 的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:48的氨基酸1-120和219-267， SEQ ID NO:50的氨基酸1-119和218-266, SEQ ID NO:52的氨基酸1-121和220- 268， SEQ ID NO:54的氨基酸1-121和220-269, SEQ ID NO:56的氨基 酸1-9和99-139， SEQ ID NO:58的氨基酸1-9和99-139， SEQIDNO:60的 氨基酸i_466和527-576， SEQ ID NO:62的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:64的氨基酸1-120和219-267， SEQ ID NO:66的氨基酸1-120, SEQ ID NO:68的氨基酸1-112和211-259,和SEQ ID NO:70的氨基酸1-112和 211-259。
8. 檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的方法，其包括4企測Msxl基 因或Msx2基因表達(dá)的步驟。
9. 根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其中檢測Msxl基因或Msx2基因表達(dá)的步 驟包括下述步驟(a) 使得自待測試細(xì)胞樣品的多核苷酸與根據(jù)權(quán)利要求
1至4中任一項 的多核苦酸探針接觸；和(b) 檢測雜交復(fù)合物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求
9的方法，其中在步驟(a)中，將制備自待測試細(xì)胞 樣品的mRNA或由該mRNA轉(zhuǎn)錄出的互補(bǔ)DNA(cDNA)與所述多核苷酸探 針接觸。
11. 根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其中檢測Msxl基因或Msx2基因表達(dá) 的步驟包括下述步驟(c) 使用得自待測試細(xì)胞樣品的多核苷酸作為模板，并使用根據(jù)權(quán)利要 求1至4中任一項的多核苷酸引物或根據(jù)權(quán)利要求
5的多核苷酸引物對， 進(jìn)4亍核酸擴(kuò)增；和(d) 檢測所形成的擴(kuò)增產(chǎn)物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求
11的方法，其中在步驟(c)中，將制備自待測試細(xì) 胞樣品的mRNA或由該mRNA轉(zhuǎn)錄出的互補(bǔ)DNA(cDNA)用作模板。
13. 根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其中檢測Msxl基因或Msx2基因表達(dá) 的步驟包括下述步驟(e) 使得自待測試細(xì)胞樣品的蛋白質(zhì)與根據(jù)權(quán)利要求
6或7的抗體接 角蟲；牙口(f) 測定抗原-抗體復(fù)合物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求
9至13中任一項的方法，其中待測試細(xì)胞樣品是 經(jīng)誘導(dǎo)而向多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞分化的ES細(xì)胞。
15. 根據(jù)權(quán)利要求
14的方法，其中通過SDLA法進(jìn)行分化誘導(dǎo)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求
9至13中任一項的方法，其中待測試細(xì)胞樣品是 得自胚胎中腦腹側(cè)區(qū)域的細(xì)胞。
17. 根據(jù)權(quán)利要求
9至16中任一項的方法，其中在步驟(a)、步驟(c) 或步驟(e)中，將沖全測到除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增 殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)的細(xì)胞用作待測試細(xì)胞樣品。
18. 根據(jù)權(quán)利要求
9至16中任一項的方法，其中在步驟(b)、步驟(d) 或步驟(f)之后，還包括步驟(g),其檢測除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)。
19. 根據(jù)權(quán)利要求
17或18的方法，其中除Msxl基因和Msx2基因 以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因是選自Lrp4基因、Nato3基因 和Mashl基因中的至少一個基因。
20. 用于檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的試劑盒，其至少含 有根據(jù)權(quán)利要求
1至4中任一項的多核苷酸探針。
21. 根據(jù)權(quán)利要求
20的試劑盒，其進(jìn)一步包括能檢測除Msxl基因和 Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的探針、引物、 引物套或抗體。
22. 用于檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的試劑盒，其至少含 有根據(jù)權(quán)利要求
1至4中任一項的多核苷酸引物或根據(jù)權(quán)利要求
5的多核 芬酸引物套。
23. 根據(jù)權(quán)利要求
22的試劑盒，其進(jìn)一步包括能檢測除Msxl基因或 Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的探針、引物、 引物套或抗體。
24. 用于檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的試劑盒，其至少含 有根據(jù)權(quán)利要求
6或7的抗體。
25. 根據(jù)權(quán)利要求
24的試劑盒，其進(jìn)一步包括能檢測除Msxl基因或 Msx2基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的探針、引物、 引物套或抗體。
26. 篩選物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)能有效誘導(dǎo)生成多巴胺能神經(jīng)元增殖 祖細(xì)胞的分化過程，所述方法包括下述步驟(i) 使能分化成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞與待測試的物質(zhì)接 觸^ 和(ii) 檢測與待測試物質(zhì)接觸后的細(xì)胞中的Msxl基因或Msx2基因表達(dá)。
27. 根據(jù)權(quán)利要求
26的方法，其進(jìn)一步包括下述步驟(iii) 在與待測試物質(zhì)接觸后的細(xì)胞中^r測除Msxl基因和Msx2基因以 外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)。
28. 根據(jù)權(quán)利要求
27的方法，其中除Msxl基因和Msx2基因以外的 多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因是選自Lrp4基因、Nato3基因和Mashl 基因中的至少一個基因。
29. 制備多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的方法，所述方法包括下述步驟(iv) 獲得多個細(xì)胞，其中含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞；(v) 使用根據(jù)權(quán)利要求
8至19中任一項的方法檢測或選擇多巴胺能神 經(jīng)元增歹直3且細(xì)月包；禾口(vi) 培養(yǎng)步驟(v)中檢測到或選擇出的細(xì)胞。
30. 多核苦酸用于檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的用途，所 述多核苷酸能與由Msxl基因或Msx2基因的核苷酸序列組成的多核苷酸或 其互補(bǔ)序列雜交。
31. 根據(jù)權(quán)利要求
30的用途，其中能雜交的多核苷酸由Msxl基因或 Msx2基因核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中至少10個連續(xù)核苷酸的序列組成。
32. 根據(jù)權(quán)利要求
30或31的用途，其中Msxl基因或Msx2基因的 核苦酸序列含有部分或完整的選自由以下核苷酸序列組成的組的核苦酸序 列SEQIDNO:l的核苷酸1-710和963-1713, SEQIDNO:3的核苷酸1-677 和943-1546， SEQ ID NO:5的核苷酸1-484和736-1316, SEQ ID NO:7的 核苷酸1-612和864-1801, SEQ ID NO:9的核香酸1-737和976-1724, SEQ ID NO:ll的核香酸1-525和777-1189， SEQ ID NO:13的核苷酸1-612和 864-1810, SEQ IDNO:15的核香酸1-754和994-1754, SEQIDNO:16的核 苦酸1-744和996-1935， SEQ ID NO: 17的核苷酸1-610和864-1806, SEQ ID NO:19的核香酸1-610和864-1785, SEQ ID NO:21的核芬酸1-1456和 1710-1905, SEQIDNO:23的核芬酸1-625和891-1062, SEQIDNO:25的核 苷酸1-709和963-1895, SEQ IDNO:27的核苦酸1-520和786-1310, SEQ ID NO:29的核香酸1-510和767-1259, SEQ ID NO:31的核苦酸1-473和 712-2180, SEQ ID NO:33的核苦酸1-468和707-1138, SEQIDNO:35的核 芬酸1-435和674-1143, SEQ IDNO:37的核苷酸1-473和712-1164， SEQ ID NO:39的核芬酸1-473和712-1164, SEQ ID NO:41的核苦酸1-473和 712-2048, SEQIDNO:43的核苦酸1-473和712-2182, SEQIDNO:45的核 苷酸1-413和651-804， SEQIDNO:47的核苦酸1-431和670-2605， SEQ ID NO:49的核苷酸1-435和674-2136， SEQ ID NO:51的核苦酸1-778和 1015-1452, SEQIDNO:53的核苷酸1-780和1017-1453， SEQIDNO:55的 核苷酸1-370和609-800, SEQ IDNO:57的核苷酸1-29和267-420, SEQ IDNO:59的核苦酸1-1340和1578-1731, SEQ ID NO:61的核苷酸1-541和 778-2225， SEQIDNO:63的核芬酸1-404和651-804， SEQIDNO:65的核香 酸1-632, SEQIDNO:67的核芬酸1-489和728-1107,和SEQ ID NO:69的 核苷酸1-487和708-2569。
33. 根據(jù)權(quán)利要求
30至32中任一項的用途，其中能雜交的多核苷酸 的長度至少為15個堿基。
34. 抗Msxl蛋白或Msx2蛋白或其部分的抗體用于檢測或選擇多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的用途。
35. 根據(jù)權(quán)利要求
34的用途，其中Msxl蛋白或Msx2蛋白或其部分 含有選自下組的氨基酸序列中的至少6個氨基酸殘基或其整個序列SEQ ID NO:2的氨基酸1-143和242-297， SEQIDNO:4的氨基酸1-216和315-370, SEQ ID NO:6的氨基酸1-143和242-297， SEQ ID NO:8的氨基酸1-149和 248-299, SEQIDNO:10的氨基酸1-143和242-297, SEQ ID NO:12的氨基 酸1-149和248-303 ， SEQ ID NO: 14的氨基酸1-143和242-323, SEQ ID NO: 18 的氨基酸1-143和242-297, SEQIDNO:20的氨基酸1-143和242-297, SEQ ID NO:22的氨基酸1-472和571-634, SEQ ID NO:24的氨基酸1-208和 298-353, SEQ ID NO:26的氨基酸1-143和242-297, SEQ ID NO:28的氨基 酸1-138和237-288, SEQ ID NO:30的氨基酸1-100和199-242， SEQ ID NO:32 的氨基酸1-120和218-267, SEQIDNO:34的氨基酸1-120和218-268, SEQ ID NO:36的氨基酸1-120和219-267， SEQ ID NO:38的氨基酸1-120和219- 267， SEQIDNO:40的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:42的氨基 酸1-120和219-267, SEQ ID NO:44的氨基酸1-120和219-267， SEQ ID NO:46 的氨基酸1-120和219-267， SEQIDNO:48的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:50的氨基酸1-119和218-266, SEQ ID NO:52的氨基酸1-121和220- 268, SEQIDNO:54的氨基酸1-121和220-269, SEQIDNO:56的氨基 酸1-9和99-139, SEQ ID NO:58的氨基酸1-9和99-139， SEQIDNO:60的 氨基酸1-466和527-576, SEQ ID NO:62的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:64的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:66的氨基酸1-120, SEQ ID NO:68的氨基酸1-112和211-259，和SEQ ID NO:70的氨基酸1-112和 211-259。
專利摘要
本發(fā)明提供了用于檢測多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的探針、引物和抗體。本發(fā)明還提供了用于檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的多核苷酸探針和多核苷酸引物，所述探針和引物能與由Msx1基因或Msx2基因的核苷酸序列組成的多核苷酸或其互補(bǔ)序列雜交，本發(fā)明還提供了用于檢測或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的抗Msx1蛋白或Msx2蛋白或其部分的抗體。
文檔編號C12Q1/02GKCN101292030SQ200680038826
公開日2008年10月22日 申請日期2006年8月18日
發(fā)明者中川康子, 中谷智哉, 坂本佳正, 尾野雄一 申請人:衛(wèi)材R&D管理有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan