專利名稱:一種基于超支化聚合物的酶固定化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域：
，特別涉及在各種聚合物薄膜上以及無機材料上固
定酶以及其它生物活性成分的方法。
技術背景
隨著生物技術的飛速發(fā)展，生物工程作為技術革命的前沿領域，在工業(yè)，農(nóng)業(yè)，醫(yī) 藥方面得到了廣泛的應用，對解決當今人類所面臨的許多問題如資源，能源，環(huán)保等起著舉 足輕重的作用。
作為生物工程的組成部分之一，酶工程已經(jīng)廣泛的應用于工業(yè)生產(chǎn)中的食品，紡
織等部門，但是由于天然酶穩(wěn)定性低，對高溫、有機溶劑極為敏感，容易失活，且無法重復利
用，催化反應后酶混合在產(chǎn)品中，使其難以純化，從而限制了它的應用。酶的固定化技術就
是為了解決這一問題而發(fā)展起來的。酶的固定化技術是指利用一定的材料將活性酶束縛在
某一區(qū)域內(nèi)，但是保留酶的催化活性，并能實現(xiàn)酶的回收利用的一種新技術。與游離酶相
比，固定化酶利于回收，從而消除了酶對產(chǎn)物的污染，降低了酶的使用成本。利用固定化技
術能夠大大提高酶的儲存以及操作穩(wěn)定性，從而延長了酶的使用壽命，在非水介質(zhì)中，固定
化技術能夠有效的減小有機溶劑對酶的影響，另外利用固定化技術還能實現(xiàn)多重酶對話。
常用的酶的固定化方法有如下幾種1)非共價結合法，又可分為結晶法，分散法，
物理吸附法，離子結合法，這種方法的特點是操作簡單，但是非共價法所利用的作用力比較
弱，在工業(yè)生產(chǎn)中的高濃度及高離子強度下，固定化酶容易脫落。2)包埋法，又可分為微囊
法，網(wǎng)格法，這種方法的特點是利用溶膠凝膠法，多孔纖維或微膠囊將酶束縛在載體上，通
過物理或化學作用力使其穩(wěn)定，通常要求在合成聚合物網(wǎng)狀結構的同時加入酶，這種方法
的缺點是對材料要求比較特殊，普適性不強。3)化學結合法，又可分為交聯(lián)法，共價結合法，
這類方法能夠有效的克服非共價結合法的缺點，提高酶的操作穩(wěn)定性，缺點是利用共價法
固定酶需要經(jīng)過幾步反應，例如先對固定化材料進行表面修飾，使其帶上能與酶發(fā)生化學
反應的官能團，然后再利用酶與官能團之間化學反應將酶固定到材料表面，對于不同的材
料，由于其表面性質(zhì)不同，需要采用不同的官能團來修飾，所以步驟比較煩瑣，且在固定化
過程中會降低酶的催化活性。
由上可見，各種固定化酶的方法都有各自的局限性，尤其是隨著生物工程的發(fā)展， 要求將酶固定在各種材料如高分子膜表面來制備性能良好的器件，然而高分子材料表面具 有一定的疏水性，普通生物分子很難吸附到其表面，雖然有一些方法如通過在基材表面修 飾，再固定化酶(中國專利，公開號CN86100565)，這種方法只對某些材料適用，還有通過利 用中介聚合物將酶和材料連接在一起(中國專利，公開號CN1358856)，這種方法要求材料 表面帶負電荷，而且要在pH高于酶等電點的溶液里吸附酶，都有比較大的局限性。 王曉工等人在Chem Lett 2004， 33 :22-33中介紹了一類新型的外圍帶有大量重 氮鹽基團的超支化聚合物新合成方法，以典型的超支化聚合物(DAS)為例，合成路線如下 式
3<formula>formula see original document page 4</formula>[0008] 首先將N， N-二羥乙基苯胺氯化反應成為N， N-二 (2-氯乙基)苯胺。然后使 N， N-二 (2-氯乙基)苯胺與4-氨基苯甲酸發(fā)生親核取代反應制備AB2型的單體N， N-二 [2-(4-氨基苯甲酰氧)乙基]苯胺(AEA)。超支化聚合物如DAS采用AEA單體重氮偶合反 應縮聚制備。制備好的超支化聚合物溶液在4t:以下保存，可以穩(wěn)定存放。通過改變單體上 的取代基團，可以得到不同的此類超支化聚合物的衍生物，如在單體的苯環(huán)上引入取代基 團(氰基，硝基等等)，如以下式的分子a，分子b作為單體可以分別得到類似的超支化聚合 物DAS-1， DAS-2，同樣DAS-1， DAS-2在4°C以下保存，也可以穩(wěn)定存放。<formula>formula see original document page 4</formula>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服已有技術的不足之處，提出一種基于超支化聚合物的酶固
定化方法。本方法能夠大大簡化固定化酶的操作步驟，無須對材料和酶進行前期修飾，普適
性很高；能夠用于多種酶和載體上，并對酶的催化活性沒有明顯影響。
本發(fā)明提出一種基于超支化聚合物的酶固定化方法，其特征在于，包括以下步 驟
1)在合成好的外圍帶有大量重氮鹽基團的超支化聚合物溶液中，或在將該超支 化聚合物溶液用水或有機溶劑N， N- 二甲基甲酰胺稀釋100倍以下的稀釋溶液中(在低于 4°C，以保證酶不失活的條件下)，將載體浸泡半個小時以上；
2)然后將載體取出，用水清洗，再將其浸入含酶的緩沖溶液中(緩沖溶液用以保 證酶不失活)，在4°C以下吸附4小時以上，以達到飽和吸附，即完成固定化酶的過程。
所述載體可包括聚乙烯，及其衍生物如聚氯乙烯，聚苯乙烯；或聚丙烯及其衍生 物；或尼龍66 ;聚甲基丙烯酸甲酯類材料；或聚碳酸酯類材料；或二氧化硅類材料；或單晶 硅中的一種材料。
所述載體材料可采用片狀、管狀、纖維薄膜之中任一種形狀。
所述酶包括beta-葡萄糖苷酶，木瓜蛋白酶，辣根過氧化物酶之中任一種。
4[0017] 上述外圍帶有大量重氮鹽基團的超支化聚合物的合成方法采用王曉工等人在 Chem Lett 2004,33 :22-33中所設計的路線。
所述外圍帶有大量重氮鹽基團的超支化聚合物還可包括通過改變單體上的取代 基團，得到不同的該類超支化聚合物的衍生物。
本發(fā)明的技術特點及效果
本發(fā)明的關鍵是采用一種外圍帶有大量重氮鹽基團的高反應性超支化聚合物。利 用其高反應活性以及多官能團性質(zhì)，，可將載體材料和酶連接在一起。由于這種超支化聚合 物具有很強的吸附性，并且自身所帶的重氮鹽基團能和材料表面以及酶都發(fā)生反應形成共 價鍵。這種方法能夠大大簡化固定化酶的操作步驟，無須對材料和酶進行前期修飾，普適性 很高；能夠用于多種酶和載體上，并對酶的催化活性沒有明顯影響。
上述所采用的材料如聚乙烯、聚丙烯、硅片、石英片等本身對酶沒有明顯的吸附作
用，當采取了用外圍帶有大量重氮鹽基團的超支化聚合物作為酶固定化試劑，各種材料固
定化酶的效率大大增加。而且，對各種不同的材料，不同的酶都有很好的效果。將酶固定到
載體表面后，酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性大大增加，而且可以實現(xiàn)循環(huán)利用。
本發(fā)明方法可適用于各種形態(tài)的材料，如聚合物膜、纖維、無機晶體等等。本發(fā)明
方法對材料的厚度以及結構沒有特殊要求，可適用于無定形材料、晶體、均質(zhì)膜、不對稱膜、
多孔膜等等。本發(fā)明所得到的固定化酶材料可適用于許多領域，如酶反應器、酶膜電極等
等，也可以用于生物產(chǎn)品的合成與分離。
與以前的文獻與專利中報道的方法比，本發(fā)明有如下優(yōu)勢
1)可應用材料的范圍廣這種方法能夠?qū)⒚腹潭ㄔ诓煌再|(zhì)的材料上，這種材料 可以是聚合物如聚乙烯、聚丙烯，也可以是無機材料如硅、石英等等。這種固定化方法本身 對材料的形態(tài)和性質(zhì)等沒有特殊的要求。
2)固定化方法簡單主要是利用外圍帶有大量重氮鹽基團的超支化聚合物的強 吸附性以及高反應性，不需要對材料和基材進行預處理，從而大大簡化了操作步驟，提高了效率。
3)所得到的固定化酶材料穩(wěn)定性高，可以重復利用。
4)該固定化方法可適用于各種酶的固定化，應用范圍廣。
具體實施方式
實施例1 :
將聚乙烯薄膜裁剪成2cmX2cm的薄膜，用超純水洗凈，將合成好的DAS溶液用水 稀釋10倍，然后在fC下在稀釋后的DAS溶液中浸泡吸附30min，將聚乙烯薄膜取出，用水 洗凈，再加入到pH = 7. 0的beta-葡萄糖苷酶的磷酸緩沖液中，在4。C下放置4小時，使之 吸附飽和，將薄膜取出，洗凈。
將材料浸入已配好的一定濃度的底物溶液中，通過測定產(chǎn)物的紫外吸收來確定固 定化酶量，結果發(fā)現(xiàn)當采用超支化的重氮鹽作為酶固定化試劑后，能夠測到明顯的紫外吸 收；而不采用重氮鹽作為酶固定化試劑時，檢測不到產(chǎn)物的紫外吸收，說明利用重氮鹽作為 酶固定化試劑能起到良好的固定化效果，而且通過測試發(fā)現(xiàn)固定化酶的熱穩(wěn)定性有了顯著 的提高，而且實現(xiàn)了循環(huán)利用。
5[0031] 實施例2:
取一定量的聚丙烯管狀材料，用超純水洗凈，將合成好的DAS-1溶液用DMF稀釋20 倍，然后在3t:下在DAS溶液中浸泡吸附40min，將聚丙烯取出，用超純水洗凈，再加入到pH =6. 5的beta-葡萄糖苷酶的檸檬酸_檸檬酸鈉緩沖液中，在2。C下放置6小時，使之吸附 飽和，將材料取出，洗凈，然后將其浸入已配好的一定濃度的底物溶液中，通過測定產(chǎn)物的 紫外吸收來確定固定化酶量。
實施例3 :
將尼龍66薄膜裁剪成2cmX 2cm的薄膜，用水洗凈，將合成好的DAS-2溶液用水稀 釋90倍，然后在rC下在DAS溶液中浸泡吸附1小時，將尼龍66薄膜取出，用超純水洗凈， 再加入到pH = 6. 0的beta-葡萄糖苷酶的磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖液中，在4。C下放置24 小時，使之吸附飽和，將薄膜取出，洗凈，然后將其浸入已配好的一定濃度的底物溶液中，通 過測定產(chǎn)物的紫外吸收來確定固定化酶量。
實施例4 :
取一定量的醋酸纖維素纖維，用水洗凈，將合成好的DAS溶液用水稀釋50倍，然后 在2t:下在稀釋后的DAS溶液中浸泡吸附3小時，將醋酸纖維素纖維取出，用超純水洗凈， 再加入到pH = 7. 2的beta-葡萄糖苷酶的巴比妥鈉_鹽酸緩沖液中，在4。C下放置24小 時，使之吸附飽和，將材料取出，洗凈，然后將其浸入已配好的一定濃度的底物溶液中，通過 測定產(chǎn)物的紫外吸收來確定固定化酶量。
實施例5 :
將聚甲基丙烯酸甲酯薄膜裁剪成2cmX2cm的薄膜，用超純水洗凈，然后在rC下 在未稀釋的DAS-2溶液中浸泡吸附30分鐘，將聚甲基丙烯酸甲酯薄膜取出，用超純水洗凈， 再加入到pH = 6. 5的beta-葡萄糖苷酶的磷酸緩沖液中，在3。C下放置13小時，使之吸附 飽和，將薄膜取出，洗凈，然后將其浸入已配好的一定濃度的底物溶液中，通過測定產(chǎn)物的 紫外吸收來確定固定化酶量。
實施例6 :
將聚氯乙烯薄膜裁剪成lcmXlcm的薄膜，用超純水洗凈，然后在4。C下在未稀釋 的DAS-1溶液中浸泡吸附30min，將聚氯乙烯薄膜取出，用超純水洗凈，再加入到pH = 7. 0 的beta-葡萄糖苷酶的磷酸緩沖液中，在2t:下放置14小時，使之吸附飽和，將薄膜取出，洗 凈，然后將其浸入已配好的一定濃度的底物溶液中，通過測定產(chǎn)物的紫外吸收來確定固定 化酶量。
實施例7:
將聚碳酸酯薄膜裁剪成2cmX 2cm的薄膜，用超純水洗凈，然后在4。C下在未稀釋 的DAS溶液中浸泡吸附30min，將聚碳酸酯薄膜取出，用超純水洗凈，再加入到pH = 7. 3的 beta-葡萄糖苷酶的檸檬酸_檸檬酸鈉緩沖液中，在4t:下放置4小時，使之吸附飽和，將薄 膜取出，洗凈，然后將其浸入已配好的一定濃度的底物溶液中，通過測定產(chǎn)物的紫外吸收來 確定固定化酶量。
實施例8 :
將載玻片裁剪成2cmX2cm大小的片，用超純水洗凈，將合成好的DAS-1溶液用水 稀釋90倍，然后在2t:下在DAS溶液中浸泡吸附50min，將載玻片取出，用超純水洗凈，再加
6入到pH = 6. 4的beta-葡萄糖苷酶的磷酸緩沖液中，在4。C下放置4小時，使之吸附飽和， 將載玻片取出，洗凈，然后將其浸入已配好的一定濃度的底物溶液中，通過測定產(chǎn)物的紫外 吸收來確定固定化酶量。
實施例9 :
將硅片裁剪成2cmX2cm大小的片，用超純水洗凈，將合成好的DAS-2溶液用DMF 稀釋30倍，然后在3t:下在DAS溶液中浸泡吸附3小時，將硅片取出，用超純水洗凈，再加入 到pH = 7. 6的beta-葡萄糖苷酶的巴比妥鈉_鹽酸緩沖液中，在4。C下放置14小時，使之 吸附飽和，將硅片取出，洗凈，然后將其浸入已配好的一定濃度的底物溶液中，通過測定產(chǎn) 物的紫外吸收來確定固定化酶量。
實施例10 :
將石英片裁剪成2cmX 2cm大小的片，用超純水洗凈，然后在4。C下在未稀釋的DAS 溶液中浸泡吸附2小時，將石英片取出，用超純水洗凈，再加入到pH = 6. 8的beta-葡萄糖
苷酶的磷酸緩沖液中，在4t:下放置6小時，使之吸附飽和，將石英片取出，洗凈，然后將其
浸入已配好的一定濃度的底物溶液中，通過測定產(chǎn)物的紫外吸收來確定固定化酶量。 實施例11 :操作步驟類似于實施例l，只是將beta-葡萄糖苷酶換成木瓜蛋白酶。 實施例12 :操作步驟類似于實施2，只是將beta-葡萄糖苷酶換成木瓜蛋白酶。 實施例13 :操作步驟類似于實施例3，只是將beta-葡萄糖苷酶換成木瓜蛋白酶。 實施例14 :操作步驟類似于實施例4，只是將beta-葡萄糖苷酶換成木瓜蛋白酶。 實施例15 :操作步驟類似于實施例5，只是將beta-葡萄糖苷酶換成木瓜蛋白酶。 實施例16 :操作步驟類似于實施例6，只是將beta-葡萄糖苷酶換成木瓜蛋白酶。 實施例17 :操作步驟類似于實施例l，只是將聚乙烯薄膜換成聚碳酸酯薄膜，將 beta-葡萄糖苷酶換成木瓜蛋白酶。
實施例18 :操作步驟類似于實施例2，只是將聚丙烯管狀材料換成載玻片，將 beta-葡萄糖苷酶換成木瓜蛋白酶。
實施例19 :操作步驟類似于實施例3，只是將尼龍66薄膜換成硅片，將beta-葡萄 糖苷酶換成木瓜蛋白酶。
實施例20 :操作步驟類似于實施例4，只是將醋酸纖維素纖維換成石英片，將 beta-葡萄糖苷酶換成木瓜蛋白酶。
實施例21 :操作步驟類似于實施例l，只是將beta-葡萄糖苷酶換成辣根過氧化物 酶。
實施例22 :操作步驟類似于實施例2，只是將beta-葡萄糖苷酶換成辣根過氧化物 酶。
實施例23 :操作步驟類似于實施例3，只是將beta-葡萄糖苷酶換成辣根過氧化物 酶。
實施例24 :操作步驟類似于實施例4，只是將beta-葡萄糖苷酶換成辣根過氧化物 酶。
實施例25 :操作步驟類似于實施例5，只是將beta-葡萄糖苷酶換成辣根過氧化物 酶。
實施例26 :操作步驟類似于實施例6，只是將beta-葡萄糖苷酶換成辣根過氧化物
7酶。
實施例27酶。
實施例28酶。
實施例29酶。
實施例30物酶。
實施例31
實施例32
實施例33
實施例34
實施例35
酯薄膜。
實施例36
烯薄膜。
實施例37
實施例38
實施例39
實施例40
實施例27 :操作步驟類似于實施例7，只是將beta-葡萄糖苷酶換成辣根過氧化物
實施例28 :操作步驟類似于實施例8，只是將beta-葡萄糖苷酶換成辣根過氧化物
實施例29 :操作步驟類似于實施例9，只是將beta-葡萄糖苷酶換成辣根過氧化物
:操作步驟類似于實施例IO，只是將beta-葡萄糖苷酶換成辣根過氧化
:操作步驟類似于實施例l，只是將beta-葡萄糖苷酶換成胰蛋白酶。 :操作步驟類似于實施例31，只是將聚乙烯薄膜換成聚丙烯薄膜。 :操作步驟類似于實施例32，只是將聚丙烯烯薄膜換成尼龍66薄膜. :操作步驟類似于實施例33，只是將尼龍66薄膜換成聚苯乙烯薄膜， :操作步驟類似于實施例34，只是將聚苯乙烯薄膜換成聚甲基丙烯酸甲
實施例36 :操作步驟類似于實施例35，只是將聚甲基丙烯酸甲酯薄膜換成聚氯乙
;作步驟類似于實施例36，只是將聚氯乙烯薄膜換成聚碳酸酯薄膜。 ;作步驟類似于實施例37，只是將聚碳酸酯薄膜換成載玻片。 ;作步驟類似于實施例38，只是將載玻片換成硅片。 ;作步驟類似于實施例39，只是將硅片換成石英片。
8
權利要求
一種基于超支化聚合物的酶固定化方法，其特征在于，該方法包括以下步驟1)在合成好的超支化聚合物DAS、DAS-1或DAS-2溶液中，或在將該超支化聚合物溶液用水或有機溶劑N，N-二甲基甲酰胺稀釋100倍以下的稀釋溶液中，在低于4℃，以保證酶不失活的條件下，將載體浸泡半個小時以上；所述DAS-1、DAS-2分別是以下式a)、b)作為單體，通過與超支化聚合物DAS相同的合成路線得到；該超支化聚合物DAS的合成路線為2)然后將載體取出，用水清洗，再將其浸入含酶的緩沖溶液中，在4℃以下吸附4小時以上，以達到飽和吸附，即完成固定化酶的過程。F2007101774565C00011.tif,F2007101774565C00012.tif
2. 如權利要求
1所述方法，其特征在于，所述載體包括聚乙烯，聚氯乙烯，聚苯乙烯； 或聚丙烯；或尼龍66 ;聚甲基丙烯酸甲酯類材料；或聚碳酸酯類材料；或二氧化硅類材料； 或單晶硅中的一種材料。
3. 如權利要求
1或2所述方法，其特征在于，所述載體采用片狀、管狀、纖維薄膜之中任 一種形狀。
4. 如權利要求
l所述方法，其特征在于，所述酶包括beta-葡萄糖苷酶，木瓜蛋白酶，辣 根過氧化物酶之中任一種。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種基于超支化聚合物的酶固定化方法該方法，屬于生物工程技術領域：
，該方法包括在合成好的外圍帶有大量重氮鹽基團的超支化聚合物溶液中，或在將該超支化聚合物溶液用水或有機溶劑N，N-二甲基甲酰胺稀釋100倍以下的稀釋溶液中，將載體浸泡半個小時以上；然后將載體取出，用水清洗，再將其浸入含酶的緩沖溶液中，在4℃以下吸附4小時以上，以達到飽和吸附；本方法能夠大大簡化固定化酶的操作步驟，無須對材料和酶進行前期修飾，普適性很高；能夠用于多種酶和載體上，并對酶的催化活性沒有明顯影響。
文檔編號C12N11/08GKCN101182510 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 200710177456
公開日2010年6月2日 申請日期2007年11月16日
發(fā)明者李昕陽, 林章凜, 王曉工, 范鵬偉, 黃哲 申請人:清華大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (5),