專利名稱:新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胸苷的生物法生產(chǎn)。更具體地是，本發(fā)明涉及ー種利用遺傳操作的生物材料(genetically manipulated biological materials)的方法。該遺傳操作的生物材料包括產(chǎn)胸苷的生物，如細(xì)菌或ー個(gè)或多個(gè)DNA構(gòu)建體如質(zhì)粒，該構(gòu)建體與合適的宿主細(xì)胞結(jié)合，當(dāng)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，將以生物法生產(chǎn)胸苷。
背景技術(shù)：
嘧啶脫氧核糖核苷胸苷可用作藥物中間體。在也被稱為疊氮或疊氮胸苷(zidovidine或azidothymidine)的AZT的化學(xué)合成中尤為重要。它是核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)類的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，以“立妥威”(“Retrovir”)為商標(biāo)，是第一種批準(zhǔn)用于治療HIV感染的藥物。
通常使用三種或更多種抗逆轉(zhuǎn)錄藥物的組合來治療HIV/AIDS(DeClercq，Med.Chem. Res. 13 =439-478,2004)。AZT作為組合治療的主要成分具有重要和擴(kuò)展(expanded)的作用，并且以多種商標(biāo)名出售，包括立妥威，齊多唯(Zidovir)，齊多夫定(Viro-Z)，阿齊多夫定(Aviro-Z)和齊多耶奇(Zido-H)。
AZT在與NRTI藥物3TC (拉米夫定(Iamivudine))結(jié)合時(shí)，尤具價(jià)值。這兩種藥物是能夠得到的，將它們配制成單ー的丸劑，商標(biāo)名為卡貝茲(Combivir)和多卩隹(Duovir)。AZT、3TC和阿巴卡韋(abacavir)三種NRTI的組合以商品名三協(xié)唯(Trizivir)出售。其他用于與AZT聯(lián)用的NRTI藥物包括地丹諾辛(didanosine),恩曲他濱(emtricitabine)和扎西他濱(zalcitabine)。
AZT也可以用于和HIV蛋白酶抑制劑藥物包括安普納韋(amprenavir)，阿扎那韋(atazanavir),卻地納宰(indinavir),利托納宰(ritonavir)和沙奎納宰(saquinavir)聯(lián)用，以及和非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)包括地拉夫定(delavirdine)，依法韋侖(efavirenz)和奈,拉平(nevirapine)聯(lián)用。
AZT是唯一批準(zhǔn)可于懷孕期間使用的抗-HIV的藥物(Lyall，et al.，HIVMed. 2 314-334, 2001) o在1997年，約有600，000兒童死于母嬰傳染而感染的AIDS。懷孕期最后三個(gè)月服用AZT,可將病毒傳染的風(fēng)險(xiǎn)降低67% (Mitchla & Sharland, Expert Opin.Pharmacother. I :239-248,2000)。
對于商業(yè)制備在AZT生產(chǎn)中所需的大量胸苷而言,發(fā) 酵技術(shù)是ー種相對于化學(xué)合成具有吸引力的可供選擇的方式。發(fā)酵エ藝是エ業(yè)領(lǐng)域中行之有效的ー種大規(guī)模且相對低成本生產(chǎn)生物分子如抗生素、氨基酸和維生素的方式(Atkinson,& Mavituna,BiochemicalEngineering and BiotechnologyHandbook,2nd Edition, New fork, Stockton Press,1991)。
但是自然界中通常找不到“游離”形式的胸苷，但是能以單磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸的形式產(chǎn)生并以三磷酸形式并入到DNA中。生物系統(tǒng)不能天然地生產(chǎn)大量的胸苷，因此需要突變或工程得到的生物。[0009]在EP 0，344，937中，公開了選定用于在有氧培養(yǎng)中生產(chǎn)胸苷的短桿菌屬(Brevibacterium)的菌株。同時(shí)可參考日本專利公開號No. 39-16345,其中教導(dǎo)了在發(fā)酵生產(chǎn)含有胸苷的多糖中，使用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtlis)突變菌株。
在US. 5，2I3, 972 (McCandliss & Anderson)中，公開了用于生產(chǎn)諸如胸苷和2’ -脫氧尿苷的嘧啶脫氧核糖核苷(PdN)的エ藝，該文獻(xiàn)全部內(nèi)容引用到本文作為參考，同時(shí)讀者可詳細(xì)的參考該文獻(xiàn)全文。其教導(dǎo)了一種可復(fù)制的微生物，所述微生物包含(incorporating)并表達(dá)編碼PdN磷酸水解酶的DNA序列，該酶能將PdN單磷酸轉(zhuǎn)化為PdN。
更具體地是,上述McCandliss & Anderson,描述了用于生產(chǎn)胸苷的發(fā)酵方法,包括表達(dá)來自枯草芽孢桿菌噬菌體PBSl的脫氧胸苷酸磷酸水解酶(dTMPase)。自然條件下這種類型的酶由噬菌體表達(dá)，該噬菌體將諸如2’ -脫氧尿苷或5-羥甲基-2’ -脫氧尿 苷的PdN代替胸苷納入自身DNA。
在US. 5，213，972中描述的胸苷發(fā)酵中，已通過突變?nèi)コ私到庑剀盏拿?胸苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶)從而使胸苷積累。所以，dTMPase酶的應(yīng)用有助于創(chuàng)造允許胸苷合成的途徑。但是，dTMPase的単獨(dú)表達(dá)不能保證胸苷生產(chǎn)處于商業(yè)上可行的水平。
在WO 01/02580(其全部內(nèi)容加入本發(fā)明作為參考，同時(shí)讀者也可詳細(xì)地全文參考該專利)中，描述了通過表達(dá)dTMPase的細(xì)胞導(dǎo)致胸苷產(chǎn)生提高的改進(jìn)。
但是在生物法產(chǎn)生胸苷的生產(chǎn)中存在的問題在于發(fā)酵エ藝中伴隨生產(chǎn)出2’ -脫氧尿苷(UdR)。這兩種分子具有相似的性質(zhì)，只是在結(jié)構(gòu)上具有一個(gè)甲基的不同，因而下游處理過程中的分離是困難并且費(fèi)用昂貴的。對于醫(yī)藥應(yīng)用如AZT的合成而言，可能需要高純度、低UdR水平的胸苷。
如果通過發(fā)酵以生物法生產(chǎn)的胸苷能相比于目前エ藝表現(xiàn)出顯著降低的UdR水平，從而最小化或消除對于為了去除該物質(zhì)而進(jìn)行的下游純化的需求，那么這將是有益的。
“顯著降低”意味著在發(fā)酵獲得的胸苷產(chǎn)品中，(污染的)UdR水平組成低于25%，更優(yōu)選地更低于10%，更優(yōu)選地更低于5%到4%、3%和2%，到I %以及更低的水平。
理想地是，應(yīng)該獲得“高”水平的胸苷。胸苷水平可以作為“單位產(chǎn)率(specificproductivity) ”數(shù)據(jù)表示,其中測定量在誘導(dǎo)4-6小時(shí)后確定。優(yōu)選大于5mg TdR/1/hr/g細(xì)胞干重的水平，更具體地是大于IOmg TdR/1/hr/g細(xì)胞干重的水平,還更優(yōu)選大于15到20和25的單位產(chǎn)率數(shù)據(jù)。
這些水平的TdR應(yīng)該最優(yōu)選與上述降低的UdR水平一起獲得，由此可將數(shù)據(jù)組合為，例如可獲得效價(jià)為5g/l的TdR，其含有少于如5%的UdR。
確實(shí)，現(xiàn)有技術(shù)的エ藝，如W001/02580中公開的，在宿主菌株CMG2451中使用質(zhì)粒PCG532，可在搖瓶試驗(yàn)中產(chǎn)生34. 5%的平均UdR含量。在如此高的水平，使得從UdR中分離胸苷的下游處理是困難的并且代價(jià)昂貴。
本發(fā)明的目標(biāo)在于修飾生產(chǎn)胸苷的生物，從而使它們能生產(chǎn)胸苷而不大量伴生出UdR。
這里運(yùn)用的術(shù)語“生物(organism) ”包括通過表達(dá)其染色體中的編碼DNA (如EP0344937中所公開)或?qū)⑵渥鳛樗拗鞯腄NA (如US 5，213，927和WO 01/02580中所公開)而能夠生產(chǎn)胸苷的生物。該宿主DNA可能作為ー個(gè)或多個(gè)DNA構(gòu)建體存在，如作為ー個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒存在。[0022]具體地，本發(fā)明的目標(biāo)在于提供ー種與W001/02580公開的構(gòu)建體/宿主組合相比，在生產(chǎn)的胸苷質(zhì)量方面的改進(jìn)。
進(jìn)ー步地，本發(fā)明的目標(biāo)在于確保對構(gòu)建體的任何基因修飾是穩(wěn)定的，從而當(dāng)構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞并且培養(yǎng)其組合時(shí)，該宿主無法在構(gòu)建體不存在時(shí)進(jìn)行自身増殖，即如果構(gòu)建體丟失，則生物死亡。

發(fā)明內(nèi)容
意想不到地是，在胸苷生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)ー個(gè)顯著的限速步驟，該步驟發(fā)生于dUMP到dTMP的轉(zhuǎn)化過程中，從而使dUMP可能同時(shí)指向UdR的產(chǎn)生。這種限制作用不能通過簡單的過表達(dá)催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的胸苷酸合酶來緩解。但是，通過確保供應(yīng)就緒(ready supply)的甲基供體的可用性，本申請人確定能生產(chǎn)污染性UdR水平顯著下降(從約35%到少于5%并 且有些情況少于1% )的胸苷。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能產(chǎn)生胸苷的生物，該生物含有一個(gè)或多個(gè)對其DNA進(jìn)行的遺傳修飾或ー些對其生長必需的染色體外DNA，其特征在于該生物含有一個(gè)或多個(gè)遺傳修飾，由于所述一個(gè)或多個(gè)遺傳修飾增加了 dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP所需單碳単位的可用性，所以所述修飾使胸苷生物合成途徑以消耗UdR為代價(jià)優(yōu)先地產(chǎn)生TdR。
上述一個(gè)或多個(gè)修飾優(yōu)選地是這樣的修飾，所述修飾增加了用于將dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP的胸苷酸合酶可用的5，10-亞甲基四氫葉酸(CH2-THF)量。CH2-THF是兩類已知胸苷酸合酶(EC2. I. I. 45和EC2. I. I. 148)的常見ー碳單位供體。對這兩種酶催化的反應(yīng)的比較如圖2。
在大多數(shù)情況下，供體分子的亞甲基還原為甲基所需的氫原子由CH2-THF自身提供，因此dUMP到dTMP的轉(zhuǎn)化反應(yīng)需要同時(shí)發(fā)生CH2-THF到ニ氫葉酸(DHF)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。這種形式的酶以EC2. I. I. 45表示，由諸如大腸桿菌thyA基因或T4噬菌體td基因編碼。
在以EC2. I. I. 148表示，由諸如幽門螺桿菌(Helicobacter pulori)的thyX基因編碼的酶的可選形式中，以還原形式的黃素核苷酸如黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)提供兩個(gè)氫原子。在這種情況下，在胸苷酸合酶反應(yīng)中將CH2-THF轉(zhuǎn)化為四氫葉酸(THF)，同時(shí)將FADH2 轉(zhuǎn)化為 FAD (MyIlykalIio，H. et al. , Science 297 :105-107,2002)
通常情況下通過將ー碳單位轉(zhuǎn)移到THF來再生CH2_THF。在利用EC2. I. I. 45胸苷酸合酶的生物體內(nèi)，必須存在通過ニ氫葉酸還原酶(EC1. 1.5.3)的作用將DHF轉(zhuǎn)化為THF作為第一歩，ニ氫葉酸還原酶由例如大腸桿菌folA基因或T4 frd基因表達(dá)。使用EC2. I. I. 148形式的胸苷酸合酶則不需要這一歩。
由THF產(chǎn)生CH2-THF的主要代謝路徑是ー種經(jīng)過絲氨酸和甘氨酸的途徑，起始于糖代謝中間體3-磷酸甘油酸。這種絲氨酸-甘氨酸-C1途徑如圖3所示。第一關(guān)鍵步驟是在磷酸甘油酸脫氫酶的作用下產(chǎn)生3-磷酸羥基丙酮酸，該酶由例如大腸桿菌serA基因編碼。
在該途徑中，CH2-THF在兩步反應(yīng)中產(chǎn)生第一步是通過如大腸桿菌glyA基因編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的作用將L-絲氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸。第二步是通過是至少四個(gè)基因的產(chǎn)物的甘氨酸裂解酶復(fù)合體將甘氨酸轉(zhuǎn)化為ニ氧化碳和氨。[0032]在許多生物體內(nèi)，也能使用甲酸提供碳原子通過三步反應(yīng)從THF產(chǎn)生CH2-THF,如圖4所示。甲酸可來源于中心代謝中間體丙酮酸。在真核生物中這三種所需的酶活性可存在于單一的三功能蛋白質(zhì)中，如通過例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ADE3基因編碼。
在促進(jìn)CH2-THF的可用性的生產(chǎn)胸苷的生物中，染色體或染色體外DNA的基因修飾，致使在UdR水平顯著下降的同時(shí)，胸苷以令人滿意的產(chǎn)率生產(chǎn)。這種類型的基因修飾能用于逆轉(zhuǎn)UdR的增加，所述UdR的增加是使用如US 5，213，972和WO 01/02580中教導(dǎo)的遺傳操作來增加總PdN產(chǎn)量時(shí)的結(jié)果，因此這種類型的修飾能改善エ藝產(chǎn)量而沒有不可接受的UdR雜質(zhì)的増加。
優(yōu)選地但不是必需地是，所述生物是細(xì)菌，更優(yōu)選地是大腸桿菌。但是如先前鑒定的現(xiàn)有技術(shù)文件公開的短桿菌屬(Brevibacterium)和芽孢桿菌屬(Bacillus)菌種，以及其他產(chǎn)胸苷的生物如棒狀桿菌屬(Corynebacterium)細(xì)菌或酵母也能根據(jù)本發(fā)明的描述進(jìn)行選用和修飾。可以理解地是，在產(chǎn)胸苷的生物中有多種不同的可以提高CH2-THF可用性的模式，同時(shí)在每種情況下最高效的模式將依賴于生物的遺傳背景。
優(yōu)選地，該生物也包括能夠過表達(dá)胸苷酸合酶的轉(zhuǎn)錄單位(染色體上的或染色體外的)，所述胸苷酸合酶由例如td或thyA基因編碼；和ー個(gè)或多個(gè)能使胸苷自dTMP產(chǎn)生的基因，例如，由例如dTMPase基因編碼的脫氧胸苷酸磷酸水解酶。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在胸苷酸合酶是產(chǎn)生DHF的EC 2. I. I. 45型時(shí)，該生物包括ー種在表達(dá)時(shí)能促進(jìn)DHF轉(zhuǎn)化為THF的基因。所述基因可以是ニ氫葉酸還原酶基因，如folA或frd。優(yōu)選的ニ氫葉酸還原酶基因是噬菌體基因，更優(yōu)選地是T偶數(shù)噬菌體(T evenphage)基因，最優(yōu)選地是T4噬菌體基因frd。
可將ニ氫葉酸還原酶基因直接導(dǎo)入生物的染色體DNA中；或者可將其納入DNA構(gòu)建體，接下來使該構(gòu)建體以所述生物作為宿主。優(yōu)選地，DNA構(gòu)建體是載體，如質(zhì)粒，病毒，轉(zhuǎn)座子或者微型染色體。
當(dāng)使用DNA構(gòu)建體將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞吋，優(yōu)選地保證設(shè)計(jì)的構(gòu)建體在供試宿主體內(nèi)穩(wěn)定存在。
在詳細(xì)的優(yōu)選實(shí)施方式和最佳模式中，該生物是大腸桿菌宿主菌株CMG2576，該菌株來源于WO 01/02580公開的菌株CMG2451，帶有質(zhì)粒pCG609，該質(zhì)粒來源于WO 01/02580公開的PCG532。它們的構(gòu)成在實(shí)施例3和4中更全面的詳細(xì)說明。兩次穩(wěn)定化處理這種組合以確保在“非誘導(dǎo)”條件下生長期間將質(zhì)粒保持在宿主菌株中。
將TMPase基因與噬菌體入啟動子偶聯(lián)插入到宿主染色體。該質(zhì)粒攜帯在其自身啟動子控制下的噬菌體入Cl857溫度敏感型阻遏物，該阻遏物從WO 01/02580中公開的宿主菌株染色體上重新定位。如果質(zhì)粒丟失將沒有阻遏物產(chǎn)生，同時(shí)表達(dá)TMPase基因，從而將TMP轉(zhuǎn)化為胸苷，繼而使生物死亡。
申請人:確定該穩(wěn)定化機(jī)制在需要培養(yǎng)多代的大規(guī)模培養(yǎng)中使用是不足的，因?yàn)橘|(zhì) 粒丟失伴隨著染色體上定位的TMPase基因的同時(shí)失活是頻繁的足以使缺少質(zhì)粒的衍生菌株生長的情況。添加第二種穩(wěn)定化的機(jī)理，其中將一種生長和存活必需的基因從染色體上缺失并將其重新定位于質(zhì)粒上。在CMG2576和pCG609組合中，這種基因是ThyA，將其克隆進(jìn)質(zhì)粒，使其在Iac啟動子的控制下。[0042]沒有功能性ThyA基因，細(xì)胞不能產(chǎn)生TMP，因此不能產(chǎn)生用于合成DNA的TTP，進(jìn)而死亡。該機(jī)制特別有效，因?yàn)榛蚰軌蛉菀椎剡M(jìn)行突變而喪失功能，但是不容易重新產(chǎn)生ー個(gè)完全喪失功能的基因。此外，缺失的酶的產(chǎn)物是磷酸化的化合物，該化合物不能通過從功能細(xì)胞傳出并且進(jìn)入那些丟失質(zhì)粒所帯基因的細(xì)胞來“互養(yǎng)共棲”(cross-feed)。
為了說明本發(fā)明更概括的方面，在詳細(xì)說明中給出了進(jìn)ー步的實(shí)例，所述實(shí)例不總是直接可比的。搖瓶試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)常包括在第二個(gè)質(zhì)粒中導(dǎo)入“試驗(yàn)基因”。但是這種多質(zhì)粒系統(tǒng)沒有進(jìn)行標(biāo)度試驗(yàn)(scale test),同時(shí)它們在大規(guī)模培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性尚未確定。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供一種生產(chǎn)胸苷的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)生物，該生物包括對其DNA進(jìn)行的一個(gè)或多個(gè)遺傳修飾或ー些對其生長必需的染色體外DNA，其特征在于該生物含有一個(gè)或多個(gè)遺傳修飾，由于所述一個(gè)或多個(gè)遺傳修飾增加了 dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP所需單碳単位的可用性，結(jié)果使胸苷生物合成途徑以消耗UdR為代價(jià)優(yōu)先地產(chǎn)生TdR。
優(yōu)選地，UdR含量低于胸苷含量的5%。
以單位產(chǎn)率表示的胸苷含量，優(yōu)選大于5mg TdR/1/hr/g細(xì)胞干重，更優(yōu)選大于7. 5到10，再以2. 5為ー級直到25mg TdR/1/hr/g細(xì)胞干重和更高。
根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供能支持本發(fā)明所述生物的生長和胸苷生產(chǎn)的培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供自胸苷生產(chǎn)的疊氮胸苷，所述胸苷根據(jù)本發(fā)明所述的方法生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式
在第一個(gè)并且是優(yōu)選的實(shí)施方式中，將基因間接導(dǎo)入生物作為染色體外DNA，最優(yōu)選地是以質(zhì)粒形式導(dǎo)入(而不是直接導(dǎo)入染色體)。優(yōu)選的基因是表達(dá)這樣ー種酶的基因，該酶能確保將脫氧尿苷單磷酸(dUMP)轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶脫氧核苷單磷酸(dTMP)的胸苷酸合酶(如EC 2. I. I. 45，EC 2. I. I. 148)與供應(yīng)就緒(ready supply)的甲基一起提供，從而與轉(zhuǎn)化為UdR相反，將大多數(shù)的dUMP甲基化為dTMP。
在該優(yōu)選的實(shí)施方式中，優(yōu)選的胸苷酸合酶是EC 2. I. I. 45型，同時(shí)優(yōu)選的基因是幫助將ニ氫葉酸(DHF)轉(zhuǎn)化為四氫葉酸(THF)的基因。合適的基因是編碼ニ氫葉酸還原酶的基因。這可以是野生型或去調(diào)控的細(xì)菌基因或噬菌體基因。特別優(yōu)選的基因，同時(shí)也是用作示例性說明本發(fā)明的ー個(gè)基因是噬菌體T4的frd基因(T4frd)。
在另ー個(gè)實(shí)施方式中，進(jìn)行基因修飾用于幫助將THF轉(zhuǎn)化為5，10-亞甲基四氫葉酸(CH2-THF)。所有這些遺傳修飾有ー個(gè)共同的目的就是推動dUMP優(yōu)先轉(zhuǎn)化為dTMP而非UdR。
已顯示有作用的ー些基因修飾不是作為優(yōu)選修飾的ー種替代方式，就是與其組合起作用，這些基因修飾包括如下
對酶進(jìn)行修飾，該酶直接作用于轉(zhuǎn)化THF為CH2-THF的反應(yīng)。一個(gè)這樣的修飾是導(dǎo)入ー個(gè)表達(dá)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的基因，該酶將L-絲氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸的同時(shí)催化THF 轉(zhuǎn)化成CH2-THF,例如大腸桿菌的glyA。其它這樣的修飾可包括導(dǎo)入表達(dá)ー個(gè)或多個(gè)甘氨酸裂解酶復(fù)合體成分的ー種或多種基因，該酶復(fù)合體催化THF轉(zhuǎn)化成CH2-THF,同時(shí)轉(zhuǎn)化甘氨酸成為ニ氧化碳和氨，如大腸桿菌的gcvT, gcvH, gcvP和Ipd基因。[0055] 進(jìn)行基因修飾，該修飾直接作用于由甲酸提供所需單碳単位的THF到CH2-THF的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。一種這樣的修飾是導(dǎo)入ー個(gè)或多個(gè)表達(dá)甲酰四氫葉酸合酶(formyl-THF-synthase)，次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶和CH3-THF脫氫酶活性的基因。ー個(gè)例子是編碼具有全部這些活性的三功能蛋白質(zhì)的酵母ADE3基因。另ー個(gè)例子是，僅向大腸桿菌中導(dǎo)入甲酰四氫葉酸合酶基因，該轉(zhuǎn)化所需的其它酶已存在。
進(jìn)行基因修飾，該修飾增加反應(yīng)底物的可用性，該反應(yīng)作用于THF向CH2-THF的轉(zhuǎn)化。一個(gè)這種例子是通過導(dǎo)入基因來促進(jìn)作為絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶底物的L-絲氨酸的可用性，該基因例如表達(dá)3-磷酸甘油酸脫氫酶的大腸桿菌serA基因，所述3-磷酸甘油酸脫氫酶能催化從糖到L-絲氨酸途徑中的第一歩反應(yīng)。另ー些例子包括導(dǎo)入表達(dá)從3-磷酸-D-甘油酸產(chǎn)生L-絲氨酸所涉及的隨后酶的基因，例如大腸桿菌的serC和serB，或者任何的基因修飾，該修飾能增加酵母ADE3基因編碼的酶復(fù)合體所需甲酸的可用性。
本發(fā)明的各個(gè)方面與US 5，213，972和WO 01/02580 二者的教導(dǎo)相比有顯著的進(jìn) 歩，同時(shí)提供了改進(jìn)的DNA構(gòu)建體和含有該構(gòu)建體的宿主細(xì)胞以用于商業(yè)生產(chǎn)胸苷。它們還能應(yīng)用于對其它產(chǎn)胸苷生物的修飾。
本發(fā)明其它的目的，特點(diǎn)和優(yōu)勢將在接下來的描述中變得清晰。但應(yīng)當(dāng)理解地是，這些代表了本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式并且僅以舉例方式說明。在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種不同修飾和改變對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明的構(gòu)建體可能是染色體上的或更優(yōu)選是染色體外的，如位于載體上。
本發(fā)明的載體包括質(zhì)粒，病毒(包括噬菌體)，轉(zhuǎn)座子，和微型染色體，優(yōu)選地是質(zhì)粒。
可以根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方便的方法將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，所述方法例如Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)，電穿孔或者轉(zhuǎn)化。
用于本發(fā)明中合適的宿主細(xì)胞包括真核生物(如真菌)和原核生物(如細(xì)菌)。原核生物包括大腸桿菌、沙門氏菌屬(Salmonella)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、短桿菌屬、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株以及它們的突變菌株。
優(yōu)選地，本發(fā)明的載體包括調(diào)控元件(例如啟動子如/匕，操縱基因，激活劑，阻遏物如、阻遏物，尤其是溫度敏感性變體，和/或增強(qiáng)子)，合適的終止序列，啟始序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。另外載體還可包括選擇性標(biāo)記?？晒┻x擇地，調(diào)控元件(尤其是入阻遏物)可位于宿主細(xì)胞染色體上。
根據(jù)本發(fā)明修飾的宿主細(xì)胞在胸苷的商業(yè)生產(chǎn)中特別有用。在本發(fā)明特別有利地應(yīng)用中，含有(攜帶或者并入)根據(jù)本發(fā)明(尤其與US 5，213，972或者WO 01/02580的教導(dǎo)相結(jié)合)修飾的質(zhì)粒的大腸桿菌宿主細(xì)胞能用在胸苷的商業(yè)生產(chǎn)中。所以，根據(jù)本發(fā)明修飾的宿主細(xì)胞另外還可包括來源于如PBSl的dTMPase和US 5，213，972教導(dǎo)的突變?nèi)鏳eoA，tdk-l和udp-1，以及在WO 01/02580中教導(dǎo)的對構(gòu)建體的進(jìn)ー步改進(jìn)如T4 nrdCAB，T4 td, dcd和 udko
一般來說，使用如WO 01/02580教導(dǎo)的發(fā)酵方法，該方法涉及將細(xì)胞浸沒(submerge)在合適容器內(nèi)包含的培養(yǎng)基中。在合適的條件下培養(yǎng)之后，收集產(chǎn)生的胸苷并純化(富集)，如果需要，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方案純化至藥用的級別。該純化的胸苷隨后能用于藥物的生產(chǎn),如用于藥用組合物如AZT的生產(chǎn)。[0066]
附圖簡述
僅以實(shí)例的方式，參考下列的附圖來說明本發(fā)明，其中
圖I顯示胸苷生物合成的途徑；
圖2顯示胸苷酸合酶反應(yīng)(轉(zhuǎn)化dUMP為dTMP)；
圖3顯示從L-絲氨酸和甘氨酸再生CH2-THF ；
圖4顯示從甲酸再生CH2-THF ；
圖5總結(jié)了改進(jìn)CH2-THF再生的方法；
圖6顯示質(zhì)粒pCG532的圖譜(現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo));
圖7顯示質(zhì)粒pCG609的圖譜；
圖8顯示質(zhì)粒pCG376的圖譜；和
圖9對比了ー些宿主/質(zhì)粒中的胸苷生產(chǎn)。
詳細(xì)描述
圖I使用添加有TMPase基因的大腸桿菌K12為例顯示了胸苷生物合成途徑的復(fù)雜性及相關(guān)的遺傳學(xué)。胸苷以TdR表示，2’-脫氧尿苷以UdR表示，在圖示的右下角。UdR在化學(xué)上不同于TdR之處在干，比TdR缺少ー個(gè)甲基。這兩種化合物間的結(jié)構(gòu)類似性使純化困難并且代價(jià)昂貴。本發(fā)明涉及進(jìn)行基因修飾，該修飾能以消耗UdR的生產(chǎn)為代價(jià)影響TdR的優(yōu)先形成。
本申請人確定，通過確保向dUMP到dTMP的エ藝步驟提供增加的一碳單位如CH2-THF的供給，可有效的控制TdR相對于UdR的水平，所述エ藝步驟由例如胸苷酸合酶基因(如td，thyA或者thyX)表達(dá)的胸苷酸合酶催化。
這主要是通過確保dUMP轉(zhuǎn)化成dTMP所產(chǎn)生的消耗后的一碳供體分子能快速循環(huán)到其作為CH2-THF的活化狀態(tài)而實(shí)現(xiàn)。圖2顯示胸苷酸合酶的兩種可供選擇的機(jī)理，每ー種產(chǎn)生不同的消耗后的ー碳供體。當(dāng)胸苷酸合酶是EC 2. I. I. 45型，例如由thyA或td基因編碼時(shí)，消耗后的供體是DHF。當(dāng)該酶是EC 2. I. I. 148型，例如由thyX基因編碼時(shí)，消耗后的供體是THF。
因?yàn)镃H2-THF直接的前體是THF，顯而易見地，在使用EC2. I. I. 45型胸苷酸合酶的生物，如大腸桿菌中，第一步反應(yīng)必須是DHF到THF的轉(zhuǎn)化。通過向這種生物導(dǎo)入ニ氫葉酸還原酶基因，其編碼催化上述反應(yīng)的酶，本申請人能夠顯著降低污染性UdR水平，并且額外地増加胸苷的生產(chǎn)量，如實(shí)施例6所述。
這種方法能實(shí)現(xiàn)對根據(jù)US 5，213,972和/或WO 01/02580教導(dǎo)原理產(chǎn)生的胸苷發(fā)酵エ藝產(chǎn)量的進(jìn)ー步改進(jìn)。用于增加嘧啶脫氧核糖核苷總量的以前的遺傳修飾，通過導(dǎo)入ニ氫葉酸還原酶基因，主要導(dǎo)致UdR水平的增加，這種額外的產(chǎn)物現(xiàn)在能直接成為TdR，如實(shí)施例7所述。
在實(shí)施例8中，已將這種方法與其它修飾結(jié)合以確保質(zhì)粒構(gòu)建體穩(wěn)定的存在于它的合適的大腸桿菌宿主菌株內(nèi)，該質(zhì)粒構(gòu)建體攜帯ニ氫葉酸還原酶和其它TdR生產(chǎn)所需的克隆的基因。這代表了目前對WO 01/02580教導(dǎo)的現(xiàn)有技術(shù)エ藝的最佳模式的改進(jìn)，但不意味著達(dá)到了本發(fā)明期望的極限。
由圖2顯而易見地是，通過導(dǎo)入ニ氫葉酸還原酶基因以增加DHF到THF轉(zhuǎn)化是一種遺傳修飾，該修飾能在產(chǎn)胸苷生物中的CH2-THF再生方面產(chǎn)生期望的增加。但是，這種方法不適合應(yīng)用于有EC 2. I. I. 148型 胸苷酸合酶的生物。在這些情況下，正如在DHF轉(zhuǎn)化為THF不是或不再是CH2-THF再生的限制步驟的情況下，有多種可選擇的或其他的遺傳修飾能用于達(dá)到期望的TdR生產(chǎn)產(chǎn)量且使UdR處于低水平。
這些可供選擇的修飾通過考慮THF生物轉(zhuǎn)化為CH2-THF的路徑將變得顯而易見，如通過L-絲氨酸和甘氨酸，如圖3所示，或者通過甲酸，如圖4所示。各種可能的解決方法如圖5總結(jié)。一般來說，合適的修飾或者増加CH2-THF合成的總速率或者改進(jìn)轉(zhuǎn)化THF為CH2-THF所需ー碳単位的提供速率。
申請人:已試驗(yàn)了這些方法的一些實(shí)施例。在實(shí)施例9中，過表達(dá)ー種酶，該酶能通過將L-絲氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸來將THF轉(zhuǎn)化為CH2-THF。在實(shí)施例10中，過表達(dá)另ー種酶，目的是通過增加代謝物向如圖3所示的絲氨酸/甘氨酸途徑的流動，來改進(jìn)THF轉(zhuǎn)化為CH2-THF所需的ー碳單位的供應(yīng)。實(shí)施例11和12運(yùn)用不同的方法將非固有途徑導(dǎo)入大腸桿菌，所述途徑用于使用甲酸作為ー碳供體將THF轉(zhuǎn)化為CH2-THF。
每種情況中有i)UdR水平小幅下降，或ii)TdR小幅上升，無相對的UdR增加，或者iii)前兩者的組合。與實(shí)施例6，7，8中所述增加ニ氫葉酸還原酶的效果相比，改進(jìn)是相對較小的，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，在可選擇的或另外的改進(jìn)型產(chǎn)胸苷生物中，每種情況能更顯著，所以是本發(fā)明有效的實(shí)施例。
實(shí)施例I.(比較例)
_9] 現(xiàn)有技術(shù)的構(gòu)建體/菌株
以WO 01/02580公開的現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建體/菌株作為對照，說明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。圖6顯示構(gòu)建體PCG532，表I給出大腸桿菌宿主菌株CMG2451的基因型。但是，應(yīng)當(dāng)理解的是，并非其中公開的所有基因都構(gòu)成本發(fā)明必需部分，雖然胸苷酸合酶基因(td，在質(zhì)粒上)和TMPase (整合到染色體)的存在對其優(yōu)選實(shí)施方式很重要。
表I :現(xiàn)有技術(shù)宿主菌株CMG2451的基因型
菌株基因型
CMG2451 hsdR-2 supE thi deoA-15 tdk-1 (入 clg57 ABAM AHI)


nic bio A(chlD-pgl) nadA-S^wJnXQ udp-/
_chr: :Tn5: :d丁MPase AZT R FUdR R _
實(shí)施例2.
胸苷牛產(chǎn)的搖瓶試驗(yàn)
根據(jù)以下方法，將實(shí)施例I涉及的構(gòu)建體和菌株在培養(yǎng)基(表2)中培養(yǎng)。獲得的數(shù)據(jù)用于比較TdR產(chǎn)率和UdR雜質(zhì)的相對量(以TdR的百分?jǐn)?shù)表示)的目的。
所有的實(shí)驗(yàn)在250ml帶擋板的搖瓶中進(jìn)行，每個(gè)試驗(yàn)菌株7到12個(gè)瓶。使用在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的新鮮種子液以大約2. 5%體積的接種量接種于每瓶20mL的培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物在31°C培養(yǎng)至0D600nm = 5。然后將搖瓶移至不同的搖床，使溫度從35. 7°C上調(diào)到36. 8°C。溫度誘導(dǎo)4到6小時(shí)后取樣品分析。
表2:搖瓶富集培養(yǎng)基配方
權(quán)利要求
1.ー種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能產(chǎn)生胸苷的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌具有TMPase和胸苷酸合酶基因，其特征在于該細(xì)菌含有遺傳修飾，該遺傳修飾通過增加dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP所需單碳単位的可用性，結(jié)果使胸苷生物合成途徑以消耗UdR為代價(jià)優(yōu)先地產(chǎn)生TdR，其中所述遺傳修飾包含大腸桿菌的thyA基因或噬菌體T4的td基因的過表達(dá)和導(dǎo)入能夠表達(dá)ニ氫葉酸還原酶(EC1. 5. I. 3)的T4 frd轉(zhuǎn)錄單位，并且其中已將編碼核苷ニ磷酸激酶(EC2. 7. 4. 6)的宿主菌株基因敲除或以其它方式失活或切去，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌。
專利摘要
本發(fā)明公開了包括DNA構(gòu)建體宿主細(xì)胞組合在內(nèi)的新生物。該生物包括含有編碼酶的DNA序列的轉(zhuǎn)錄單位(如操縱子)，這些酶促進(jìn)dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP所需單碳單位的供應(yīng)。實(shí)例包括二氫葉酸還原酶基因，如T4 frd；絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因，如glyA；3-磷酸甘油酸脫氫酶基因，如serA；以及THF合酶基因，如ADE3。該生物用于生產(chǎn)所含尿苷水平顯著下降的胸苷的生物方法中。
文檔編號C12N9/12GKCN101379185 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200780004615
公開日2012年8月29日 申請日期2007年2月5日
發(fā)明者克里斯托弗·普雷斯頓, 劉林, 安德魯·J·科利斯, 戴維·M·安德森, 瑟吉·波德科維羅夫 申請人:葛蘭素集團(tuán)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),