專利名稱:生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用寇氏隱甲藻[Crypthecodiniumcohnii (Se 1 igo) Javornicky]生產(chǎn)二十二碳六烯酸(DHA)油脂技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說是一種生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
近年來，多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)對人類健康的重要作用已愈來愈受到人們的重視。其中，二十二碳六烯酸因其在人體和動物體內(nèi)的重要生理功能而倍受人們的青睞。研究表明，DHA是人體某些組織中細(xì)胞膜的基本組分；對嬰幼兒視覺系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起著重要作用；還具有降低膽固醇作用，抗凝血功效以及抑制癌功效，防止老年性癡呆癥等，并且它是幼魚生長所必需的一種脂肪酸。利用寇氏隱甲藻生產(chǎn)二十二碳六烯酸(DHA)油脂已形成工業(yè)化生產(chǎn)，二十二碳六烯酸的生產(chǎn)工藝在不斷改進(jìn)。其中現(xiàn)在公開報(bào)道海洋微藻生產(chǎn)二十二碳六烯酸(DHA)油脂中藻細(xì)胞破壁方法有兩類。一類是物理方法破壁機(jī)械破壁如采用均質(zhì)機(jī)或膠體磨等機(jī)械進(jìn)行磨檫和擠壓使細(xì)胞壁破裂、干燥法等。采用機(jī)械破壁方法細(xì)胞破壁不完全，用有機(jī)溶劑萃取收得率為總油60-70%。采用干燥法耗時耗能，且加熱及通氣方法干燥后提取油脂過氧化值較高，毛油品質(zhì)較差，冷凍干燥成本較高，干燥后用有機(jī)溶劑萃取精煉后得率僅為毛油30-50%。
公開日為1995年4月5日、公開號為CN1101034A的專利申請公開的利用海洋微藻生產(chǎn)二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法是采用冷凍干燥或加熱及通氣方法干燥后進(jìn)行提取。另一類是化學(xué)方法破壁；采用化學(xué)試劑破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，然后用有機(jī)溶劑萃取得到毛油。
公開日為 2007年6月27日，公開號為CN1986822A的專利申請公開的用寇氏隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法是采用加破壁劑如十二烷基硫酸鈉等，其用量為濃縮發(fā)酵液重量的 0.1-0.6%。這種方法得到油脂中會有化學(xué)試劑殘留，影響油的品質(zhì)。且毛油質(zhì)量較差，精煉后得率僅為毛油30-50%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是研制一種將酶法破壁用于寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法，它大大地提高了二十二碳六烯酸(簡稱DHA)的收得率和毛油的品質(zhì)。
本發(fā)明生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法，包括以寇氏隱甲藻 [Crypthecodinium cohnii (Seligo)Javornicky]為出發(fā)菌株，在液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)寇氏隱甲藻得到海藻細(xì)胞，然后通過生物酶法破壁從海藻細(xì)胞中提取二十二碳六烯酸油脂。
本發(fā)明所用的寇氏隱甲藻菌種名稱是Crypthecodinium cohnii (Seligo) Javornicky?？梢詮陌ˋTCC(美國典型培養(yǎng)物收集中心)的保藏培養(yǎng)機(jī)構(gòu)獲得。
生物酶分為主體酶和輔助酶；
主體酶為堿性蛋白酶(2709)、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，可以使用其中的一種或幾種，若為幾種，其比例可按任意比例配合使用。其用量為發(fā)酵液重量的0. 12-0.5%，若為濃縮發(fā)酵液，其用量按濃縮前發(fā)酵液重量計(jì)算；
輔助酶為胰蛋白酶、靡蛋白酶，纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶，可以使用其中的一種或多種，若為多種，其比例可按任意比例配合使用。其用量為發(fā)酵液重量的0-0. 025%，若為濃縮發(fā)酵液，主體酶和輔助酶用量按濃縮前發(fā)酵液重量計(jì)算；
在使用時，單獨(dú)用主體酶或主體酶和輔助酶并用都可達(dá)到破壁。
本發(fā)明生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法在發(fā)酵液或過濾濃縮發(fā)酵液中加入主體酶，用量為發(fā)酵液重量的0. 12-0. 5%若為濃縮發(fā)酵液，其用量按濃縮前發(fā)酵液重量計(jì)算；輔助酶，用量為發(fā)酵液重量的0-0. 025%，若為濃縮發(fā)酵液，主體酶和輔助酶用量按濃縮前發(fā)酵液重量計(jì)算，升溫50-70°C，保溫?cái)嚢?-9小時，加入95%的乙醇，乙醇用量為發(fā)酵液濃縮發(fā)酵液的30% -150%，加入有機(jī)溶劑量為發(fā)酵液或濃縮發(fā)酵液重量的1. 5-4. 5倍，進(jìn)行萃取得到二十二碳六烯酸毛油。將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)水化、堿煉、 脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油。
其中所述的有機(jī)溶劑為正己烷或氯仿等。
本發(fā)明所述的濃縮發(fā)酵液中主體酶和輔助酶的加入量，是以過濾濃縮發(fā)酵液前的發(fā)酵液量來計(jì)算的。
本發(fā)明生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法的優(yōu)點(diǎn)是藻細(xì)胞破壁完全，破壁率為95%以上，不需要經(jīng)過干燥，可以防止二十二碳六烯酸毛油的氧化，使萃取油脂過氧化值極低，POV值在0.5以下，收得率為總油的90%以上，精煉得率為毛油的70%以上。 具體實(shí)施方式
實(shí)施例一
一種生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法采用寇氏隱甲藻斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和三級發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。在發(fā)酵液IOOkg中加入堿性蛋白酶O709) 0. 2kg,升溫50-70°C，保溫?cái)嚢?_9小時，加入95%的乙醇30kg，加入正己烷150kg，進(jìn)行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3kg。將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)水化、堿煉、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油2. 34kg。
實(shí)施例二
一種生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法采用寇氏隱甲藻斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和三級發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。在發(fā)酵液IOOkg中加入中性蛋白酶0. 35kg，升溫50-70°C，保溫?cái)嚢?_9小時，加入95%的乙醇30kg，加入正己烷150kg，進(jìn)行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3kg。將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)水化、堿煉、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油2. 34kg。
實(shí)施例三
一種生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法采用寇氏隱甲藻斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和三級發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。在發(fā)酵液IOOkg中加入木瓜蛋白酶0. 45kg，升溫50-70°C，保溫?cái)嚢?_9小時，加入95%的乙醇30kg，加入正已烷150kg，進(jìn)行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3kg。將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)水化、堿煉、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油2. 34kg。
4[0021]實(shí)施例四
一種生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法采用寇氏隱甲藻斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和三級發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。在發(fā)酵液IOOkg中加入堿性蛋白酶(2709)0. 12kg，加入糜蛋白酶0.001kg，升溫50-70°C，保溫?cái)嚢?-9小時，加入95%的乙醇30kg，加入正已烷150kg，進(jìn)行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3kg。將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)水化、堿煉、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油2. 34kg。
實(shí)施例五
一種生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法采用寇氏隱甲藻斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和三級發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。在發(fā)酵液IOOkg中加入中性蛋白酶0. Wkg，加入胰蛋白酶o.(^kg、靡蛋白酶共 0. 01kg，升溫50-70°C，保溫?cái)嚢?-9小時，加入95%的乙醇60kg，加入氯仿200kg，進(jìn)行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3. ^g。將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)水化、堿煉、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油3. 04kg。
實(shí)施例六
一種生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法采用寇氏隱甲藻斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和三級發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，在離心濃縮發(fā)酵液IOOkg(發(fā)酵液離心前為400kg)中加入堿性蛋白酶 0709)0. mcg，按纖維素酶葡聚糖酶木聚糖酶為1 3 1的比例加入纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶共0. OMkg，升溫50-70°C，保溫?cái)嚢?-9小時，加入95%的乙醇90kg，加入正已烷250kg，進(jìn)行萃取得到二十二碳六烯酸毛油16. Okgo將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)水化、 堿煉、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油12kg。
實(shí)施例七
一種生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法采用寇氏隱甲藻斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和三級發(fā)酵培養(yǎng)， 得到發(fā)酵液，在離心濃縮發(fā)酵液IOOkg(發(fā)酵液離心前為400kg)中均等地加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶共OJkg，按胰蛋白酶靡蛋白酶纖維素酶為2 3 5的比例加入胰蛋白酶、靡蛋白酶、纖維素酶共0. OWkg，升溫50-70°C，保溫?cái)嚢?-9小時，加入95%的乙醇 120kg，加入氯仿300kg，進(jìn)行萃取得到二十二碳六烯酸毛油12.8kg。將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)水化、堿煉、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油9. 2kgo
實(shí)施例八
一種生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法采用寇氏隱甲藻斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和三級發(fā)酵培養(yǎng)， 得到發(fā)酵液，在離心濃縮發(fā)酵液IOOkg (發(fā)酵液離心前為450kg)中均等地加入堿性蛋白酶 O709)和木瓜蛋白酶共OJkg，按胰蛋白酶靡蛋白酶纖維素酶葡聚糖酶為1 :4:1 的比例加入胰蛋白酶、靡蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶共0. 02kg，升溫50-70°C，保溫?cái)嚢?3-9小時，加入95 %的乙醇13^g，加入正已烷350kg，進(jìn)行萃取得到二十二碳六烯酸毛油 14kg。將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)水化、堿煉、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油10kg。
實(shí)施例九[0032] 一種生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法采用寇氏隱甲藻斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和三級發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。在發(fā)酵液IOOkg中加入中性蛋白酶0. ^g，按胰蛋白酶靡蛋白酶纖維素酶 葡聚糖酶木聚糖酶為1 :2:1:1: 1的比例加入胰蛋白酶、靡蛋白酶，纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶共0. 025kg,升溫50-70°C，保溫?cái)嚢?-9小時，加入95%的乙醇150kg，加入氯仿450kg，進(jìn)行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3. 5kgo將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)水化、 堿煉、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油2. 6kgo
權(quán)利要求
1. 一種生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法，其特征在于包括以寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii (Seligo) Javornicky]為出發(fā)菌株，在液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)寇氏隱甲藻得到海藻細(xì)胞，然后通過生物酶法破壁從海藻細(xì)胞中提取二十二碳六烯酸油脂；所述生物酶法是在發(fā)酵液或過濾濃縮發(fā)酵液中加入主體酶和輔助酶，升溫50-70°C， 保溫?cái)嚢?-9小時，加入95%的乙醇，乙醇用量為發(fā)酵液的30% -150%，加入有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取得到二十二碳六烯酸毛油；將二十二碳六烯酸毛油經(jīng)水化、堿煉、脫色、脫臭后得到二十二碳六烯酸精煉油；所述主體酶為堿性蛋白酶2709、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或幾種，若為幾種，其比例可按任意比例配合使用；輔助酶為胰蛋白酶、靡蛋白酶，纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶中的一種或多種，若為多種，其比例按任意比例配合使用；所述主體酶用量為發(fā)酵液重量的0. 12-0. 5%;輔助酶用量為發(fā)酵液重量的0-0. 025%，若為濃縮發(fā)酵液，所述主體酶和輔助酶用量均按濃縮前發(fā)酵液重量計(jì)算。
專利摘要
一種生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生產(chǎn)方法，包括以寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]為出發(fā)菌株，在液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)寇氏隱甲藻得到海藻細(xì)胞，然后通過生物酶法破壁從海藻細(xì)胞中提取二十二碳六烯酸油脂。其優(yōu)點(diǎn)是藻細(xì)胞破壁完全，破壁率為95％以上，不需要經(jīng)過干燥，可以防止二十二碳六烯酸毛油的氧化，使萃取油脂過氧化值極低，POV值在0.5以下，收得率為總油的90％以上，精煉得率為毛油的70％以上。
文檔編號C12R1/89GKCN101307341 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200810047859
公開日2012年1月4日 申請日期2008年5月29日
發(fā)明者過群 申請人:羅蓋特生物營養(yǎng)品(武漢)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (2),