專利名稱:一種提高哈茨木霉菌產(chǎn)木霉素水平的方法
一種提高哈茨木霉菌產(chǎn)木霉素水平的方法 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及提高哈茨木霉菌產(chǎn)素水平的方法。
背景技術(shù)：
微生物發(fā)酵中效價(jià)往往是決定生產(chǎn)成本以及實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸所在。對(duì)菌株進(jìn)行遺傳改造、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化等是提高產(chǎn)素水平的常用方法。 近年來(lái)，真菌誘導(dǎo)子在植物細(xì)胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵生產(chǎn)次生產(chǎn)物的研究中得到廣泛應(yīng)用。研究組從枸骨中分離篩選到一株產(chǎn)木霉素(Trichodermin)的活性內(nèi) 生真菌——哈茨木霉菌(7Hc/w血m!a /rara'a,m)。木霉素對(duì)多種農(nóng)作物病原真菌 具有很強(qiáng)的抑制作用，在防治作物病害中具有廣泛的應(yīng)用前景。從自然界分離 的野生型菌株往往產(chǎn)素水平較低，生產(chǎn)能力低下。
發(fā)明內(nèi)容
在研究提高哈茨木霉菌產(chǎn)素水平的試驗(yàn)中，生物活性測(cè)定表明病原真菌立 枯絲核菌(i /^Mto"f" )活菌絲的加入能夠提高哈茨木霉菌發(fā)酵液的抑菌效 果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，滅活的立枯絲核菌菌絲體的加入同樣能夠提高哈茨木霉 菌發(fā)酵液的抑菌效果。釆用氣相色譜分析發(fā)酵液中木霉素的含量，顯示添加滅 活的立枯絲核菌菌絲體后發(fā)酵液中木霉素的濃度與對(duì)照相比提高了數(shù)倍。本發(fā)明通過(guò)在哈茨木霉菌培養(yǎng)液中添加滅活的立枯絲核菌菌絲體，提高發(fā)酵液中木霉素的濃度。該發(fā)明為哈茨木霉菌的產(chǎn)素水平提高提供了一種可靠的方 法。
本發(fā)明的目的是針對(duì)野生型菌株哈茨木霉產(chǎn)素水平低的不足，提供一種提 高其產(chǎn)素水平的方法；本發(fā)明的另一目的是提供利用該菌株代謝產(chǎn)物木霉素制 備微生物農(nóng)藥的方法。
本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)
一種提高哈茨木霉菌產(chǎn)素水平的方法按以下步驟進(jìn)行
(1) 立枯絲核菌的培養(yǎng) 立枯絲核菌可以通過(guò)常規(guī)的組織分離法從發(fā)病的植物中分離得到。
培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)， 300mL三角瓶裝PD液體培養(yǎng)基 60mL，用接種鉤挑取少許立枯絲核菌菌絲于滅菌的培養(yǎng)瓶中，置26'C 28'C搖 床，200r/min，振蕩培養(yǎng)6天，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心10min，收集菌絲體， 在-53。C、0.5mbar條件下真空冷凍千燥15h，滅活的菌絲體研磨成小顆粒，備用；
(2) 哈茨木霉菌液體發(fā)酵 哈茨木霉菌為從枸骨中分離的內(nèi)生真菌。發(fā)酵培養(yǎng)基配方其組分與含量(每升培養(yǎng)基中所含的質(zhì)量)為立枯絲核菌菌絲體小顆粒60mg，蛋白胨30g、 牛肉浸膏10g、葡萄糖24g、 MnCl20.01g、 KH2PO40.1g、 MgSO40.05g;對(duì)照中不 添加立枯絲核菌菌絲體，其余組分與含量同發(fā)酵培養(yǎng)基配方；300rnL三角瓶裝 發(fā)酵培養(yǎng)基60mL，用無(wú)菌的吸管吸取lmL哈茨木霉菌孢子懸液(lXl(^個(gè)/mL) 于滅菌的培養(yǎng)瓶中，置28"C搖床，180r/min，振蕩培養(yǎng)108h，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min 離心10min，上清液用于木霉素含量的測(cè)定；
(3) 木霉素的檢測(cè)方法采用氣相色譜法測(cè)定，色譜柱HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(以5%苯基 甲基硅氧烷為固定液，30 mx320 pmx0.25 pm);檢測(cè)器氫火焰離子檢測(cè)器 (FID);檢測(cè)器溫度270 °C;進(jìn)樣口溫度250 °C;柱溫度程序升溫，初始溫 度10(TC，保持5min，以10 °C mii^1升溫至260 。C保持5 min;載氣氮?dú)猓?流速1.5 mL min"。 本發(fā)明的有益效果一是本發(fā)明通過(guò)在哈茨木霉菌培養(yǎng)液中添加立枯絲核菌菌絲體，提高發(fā)酵 液中木霉素的濃度，這為哈茨木霉菌的產(chǎn)素水平提高提供了一種可靠的方法；二是本發(fā)明提供了制備防治作物真菌病害的微生物源農(nóng)藥的活性成分木霉 素，為農(nóng)用殺菌劑的開發(fā)增添了新的途徑。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提高木霉素產(chǎn)素水平的方法作進(jìn)一步描述。 實(shí)施例1-立枯絲核菌的培養(yǎng)培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)， 300mL三角 瓶裝PD液體培養(yǎng)基60mL，用接種鉤挑取少許立枯絲核菌菌絲于滅菌的培養(yǎng)瓶 中，置26。C 28。C搖床，200r/min，振蕩培養(yǎng)6天，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心10min， 收集菌絲體，在-53t:、 0.5mbar條件下真空冷凍干燥15h，滅活的菌絲體研磨成 小顆粒，備用；哈茨木霉菌液體發(fā)酵哈茨木霉菌為從枸骨中分離的內(nèi)生真菌，該菌株己 在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月 14日，保藏登記號(hào)CGMCCNo. 1780參見專利申請(qǐng)200710066843.1的公開文本， 公開號(hào)為CN101037656。發(fā)酵培養(yǎng)基配方其組分與含量(每升培養(yǎng)基中所含的質(zhì)量)為立枯絲核菌菌絲體小顆粒60mg，蛋白胨30g、牛肉浸膏10g、葡萄 糖24g、 MnCl20.01g、 KH2PO40.1g、 MgSO40.05g;對(duì)照中不添加立枯絲核菌菌 絲體，其余組分與含量同發(fā)酵培養(yǎng)基配方；300mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基60mL， 用無(wú)菌的吸管吸取lmL哈茨木霉菌孢子懸液(lXl(^個(gè)/mL)于滅菌的培養(yǎng)瓶 中，置28。C搖床，驗(yàn)/min，振蕩培養(yǎng)108h，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心10min， 上清液用于木霉素含量的測(cè)定；木霉素的檢測(cè)采用氣相色譜法測(cè)定，色譜柱HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(以 5%苯基甲基硅氧垸為固定液，30mx320 nmx0.25^im);檢測(cè)器氫火焰離子檢測(cè)器(FID);檢測(cè)器溫度270 °C;進(jìn)樣口溫度250 °C;柱溫度程序升溫，初始溫度100 °C ，保持5 min，以10 °C min"升溫至260 。C保持5 niin;載氣氮 氣；流速1.5 mL mirf1;結(jié)果表明添加立枯絲核菌菌絲體后，哈次木霉菌發(fā)酵液中木霉素的含量 與對(duì)照相比提高了 5.3倍(從0.0678g/L升高至0.35934g/L)。 實(shí)施例2:立枯絲核菌的培養(yǎng)同實(shí)施例l;哈茨木霉菌液體發(fā)酵哈茨木霉菌為從枸骨中分離的內(nèi)生真菌，該菌株已 在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月 14日，保藏登記號(hào)CGMCCNo. 1780參見專利申請(qǐng)200710066843.1的公開文本， 公開號(hào)為CN101037656。發(fā)酵培養(yǎng)基配方其組分與含量(每升培養(yǎng)基中所含 的質(zhì)量)為立枯絲核菌菌絲體小顆粒90mg，蛋白胨30g、牛肉浸膏10g、葡萄 糖24g、 MnCl20.01g、 KH2PO40.1g、 MgSO40.05g;對(duì)照中不添加立枯絲核菌菌 絲體，其余組分與含量同發(fā)酵培養(yǎng)基配方；300mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基60mL，用無(wú)菌的吸管吸取lmL哈茨木霉菌孢子懸液(lXl()S個(gè)/mL)于滅菌的培養(yǎng)瓶 中，置28。C搖床，180r/min，振蕩培養(yǎng)108h,發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心10min， 上清液用于木霉素含量的測(cè)定；木霉素的檢測(cè)同實(shí)施例h 結(jié)果表明添加立枯絲核菌菌絲體后，哈次木霉菌發(fā)酵液中木霉素的含量 與對(duì)照相比提高了 8.2倍(從0.0678g/L升高至0.55596g/L)。 實(shí)施例3:立枯絲核菌的培養(yǎng)同實(shí)施例l;哈茨木霉菌液體發(fā)酵哈茨木霉菌為從枸骨中分離的內(nèi)生真菌，該菌株已 在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月 14日，保藏登記號(hào)CGMCC No. 1780。發(fā)酵培養(yǎng)基配方其組分與含量(每升 培養(yǎng)基中所含的質(zhì)量)為立枯絲核菌菌絲體小顆粒90mg (在哈茨木霉菌液體發(fā) 酵24小時(shí)后添加)，蛋白胨30g、牛肉浸膏10g、葡萄糖24g、 MnCl20.01g、 KH2PO40.1g、 MgSO40.05g;對(duì)照中不添加立枯絲核菌菌絲體，其余組分與含量 同發(fā)酵培養(yǎng)基配方；300mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基60mL，用無(wú)菌的吸管吸取lmL 哈茨木霉菌孢子懸液(lXl(^個(gè)/mL)于滅菌的培養(yǎng)瓶中，置28"C搖床，180r/min， 振蕩培養(yǎng)108h，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心10min，上清液用于木霉素含量的測(cè)定；木霉素的檢測(cè)同實(shí)施例l; 結(jié)果表明添加立枯絲核菌菌絲體后，哈次木霉菌發(fā)酵液中木霉素的含量 與對(duì)照相比提高了 6.5倍(從0.0678g/L升高至0.4407g/L)。
權(quán)利要求
1、一種生產(chǎn)木霉素的方法，其特征在于將滅活的立枯絲核菌菌絲體加入到哈茨木霉菌的培養(yǎng)基中，對(duì)哈茨木霉菌進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，然后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心。
2、 權(quán)利要求
1所述的生產(chǎn)木霉素的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基中含有蛋 白胨、牛肉浸膏、葡萄糖、MnCl2、 KH2P04、 MgS04。
3、 權(quán)利要求
1所述的生產(chǎn)木霉素的方法，其特征在于立枯絲核菌的培養(yǎng)過(guò)程 為培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，用接種鉤挑取少許立枯絲核菌菌絲 于滅菌的培養(yǎng)瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)；然后發(fā)酵液離心，收集菌絲體，真空冷 凍干燥，滅活的菌絲體研磨成小顆粒。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種提高哈茨木霉菌產(chǎn)木霉素水平的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域：
。該方法通過(guò)在哈茨木霉菌培養(yǎng)液中添加滅活的立枯絲核菌菌絲體，提高發(fā)酵液中木霉素的濃度。
文檔編號(hào)C12R1/885GKCN101270373SQ200810062335
公開日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2008年5月19日
發(fā)明者俞曉平, 王為民, 申屠旭萍, 董勝?gòu)?申請(qǐng)人:中國(guó)計(jì)量學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan