專利名稱:羅漢果苷v的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物提取物的純化，具體是從羅漢果提取物中制備羅漢果苷V的方法。
背景技術(shù)：
羅漢果，為葫蘆科植物羅漢果屬多年生草質(zhì)藤本植物羅漢果Momordica grosvenori Swingle的干燥成熟果實，為一常用中藥，具有清熱解暑、潤肺止渴作用，臨床 上可用于治療高血壓、肺結(jié)核、哮喘、胃炎、百日咳、急慢性支氣管炎和急慢性扁桃體炎等多 種疾病，同時羅漢果也是常用飲料干果，提取物是常用甜味劑，大量出口，遠銷日本、韓國、 臺灣、東南亞、加拿大、美國等地。
羅漢果及羅漢果提取物中的主要成分為葫蘆烷型三萜皂苷，包括羅漢果苷 IV(mogrosidelV)、羅漢果苷V(mogroside V)、賽門苷 I (siamenoside I)、11_氧-羅漢果苷 V(ll-oxo-mogrosideV)、羅漢果苷 IIE(mogroside IIE)、羅漢果苷 IIIE(mogroside IIIe)等 多種皂苷，其中羅漢果苷V為主要皂苷類成分。羅漢果苷V也是羅漢果的主要甜味成分，其 甜度高，為蔗糖的四百多倍。由于制藥工業(yè)及食品工業(yè)的發(fā)展，目前國內(nèi)外對高純度的羅漢 果V的需求量非常大，但目前尚未見有高純度的羅漢果苷V生產(chǎn)、銷售。雖有多項專利申請 涉及羅漢果甜苷的提取，方法簡單，但所得產(chǎn)物為羅漢果總苷，提取物中羅漢果苷V的純度 均較低，不超過80 %，限制了其應(yīng)用范圍和發(fā)展前景。
公開號為CN101029071A的“從羅漢果中制備高純度羅漢果苷V的方法”是將醇浸 膏用乙醇乙酯萃取，繼用正丁醇萃取得正丁醇浸膏，再用聚酰胺柱處理正丁醇浸膏得粗皂 苷，然后用氯仿一甲醇一水作為流動相進行硅膠柱層析，最后進行C18反相硅膠柱層析，水 洗、乙醇洗脫、收集純度在95 %以上的流分得純度大于95 %的羅漢果苷V。該法使用的氯 仿、甲醇毒性較大。硅膠柱層析的收得率低，C18反相硅膠柱層析的純化效果不理想，收得率 也低，只有50%左右，而且操作過程復(fù)雜，對流出物需分成小分(如接收的每一小杯20ml) 都要頻繁進行HPLC檢測，不利于實際生產(chǎn)應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供新的操作方便、收得率高、產(chǎn)品純度高、純化效果好的羅漢果 苷V的制備方法，該方法能順利地應(yīng)用于規(guī)模化生產(chǎn)實際，并可降低生產(chǎn)成本。
本發(fā)明提供的羅漢果苷V的制備方法，包括粗苷的硅膠柱層析和后續(xù)的C18反相 柱層析，
(1)在對含有羅漢果苷V的粗苷進行硅膠柱層析時，用兩種比例的二氯甲烷/乙醇 混合物作為流動相進行兩次洗脫，第二次洗脫時的流動相中二氯甲烷的比例小于第一次洗 脫時的流動相，收集第二次洗脫的組份，濃縮干燥后得A ；
(2)將A進行C18反相柱層析時，用乙腈/水混合物洗脫，通過紫外檢測器結(jié)合記 錄儀監(jiān)控，收集波長為198nm 220nm時記錄儀顯示的峰值最大的峰所代表的組份，濃縮干燥即得。
本發(fā)明中，兩種比例的二氯甲烷/乙醇混合物的重量比例分別為58/42 70/30， 45/55 55/45。其中的乙醇為市售的重量百分濃度為95%產(chǎn)品。
新的羅漢果苷V的制備方法，硅膠的粒度為200 300目，上樣量為硅膠重量的 1/40 1/20，第一次洗脫時，流動相的用量為硅膠重量的5 10倍(體積/重量，ml/g或 L/kg)，第二次洗脫時，流動相的用量為硅膠重量的10 20倍(體積/重量，ml/g或L/kg)， 當?shù)诙蜗疵撚?倍流動相進入硅膠后，開始收集流出的組份，直至規(guī)定量的流動相洗脫 完畢。
在本發(fā)明的羅漢果苷V的制備方法的第二步將A進行C18反相柱層析時，所用流 動相乙腈/水混合物的體積比為20/80 30/70。監(jiān)控時紫外檢測器的波長設(shè)于200nm 210nm。C18反相柱層析的反相填料的粒徑為20 μ m 50 μ m，上樣量為反相填料重量的 1/250 1/180。
本發(fā)明在對羅漢果粗苷進行硅膠柱層析時，采用梯度層析，即進行兩次洗脫。第一 次洗脫時所用流動相的二氯甲烷比例較高，由于粗苷中苷V以及其它苷類溶于水，而脂肪 酸、油脂、黃酮、留體類屬于脂溶性成份，所以二氯甲烷比例較高的流動相可以有效地洗除 脂溶性成份，而將苷V及其苷類留在柱中。第二次洗脫時，二氯甲烷的比例降低，適當提高 乙醇比例，從而增大了流動相的極性，有利于水溶性成份的洗脫，但是，乙醇比例不能無限 制提高，本發(fā)明經(jīng)過實驗驗證，乙醇比例在45% 55%之間，有利于最大限度地洗脫苷V而 將其它苷類仍留在柱中，從而使羅漢果苷V與其它苷類得到很好的分離。
用乙腈/水作流動相的C18反相柱層析，并結(jié)合紫外檢測器和記錄儀進行過程監(jiān) 控，是本發(fā)明的關(guān)鍵所在。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，C18反相材料作為填料進行柱層析時，乙腈/水的混 合物作流動相，比其它溶劑如乙醇、乙醇/水、丙酮/水等具有更好的效果。乙醇的粘度較 大，在柱中流速慢，需要較高的壓力才能使其達到正常流速，由于壓力的增加，提高了對生 產(chǎn)設(shè)備的要求。丙酮作流動相時，實踐證明分離效果不好，各組分不集中，在柱中分散，容易 互相污染，既達不到純化效果，也降低了各組分的收得率。另外，乙醇和丙酮均有較強的紫 外吸收，用紫外檢測器進行過程監(jiān)控時也會出峰，抬高了基線，甚至覆蓋了部分含量較少的 物質(zhì)峰和最大峰(主要組分)的下部。這時如果從起峰時接收流出物，無疑會大大降低接 收組分的收得率，因為接收到的流出物只是峰的尖尖的一小部分。但是，若接收起始時間提 前，并將結(jié)束時間延后，一是無法在看不到峰的情況下準確判斷時間點，二是有可能也將沒 有看見的挨近的其他物質(zhì)一起接收了，這樣就影響了純化效果，也提高了操作難度，甚至無 法操作。而乙腈粘度小，紫外吸收很弱，與水完全混容，所以本發(fā)明采用乙腈/水作C18反 相柱層析的流動相，克服了乙醇、乙醇/水、丙酮/水作流動相的缺陷，結(jié)合紫外檢測器和記 錄儀進行過程監(jiān)控，大大提高了純化效果和產(chǎn)品收得率。
紫外檢測器結(jié)合記錄儀對層析過程進行適時監(jiān)控，可以很直觀地看到物料中各成 份在層析過程中的流出情況。在紫外檢測器的波長為198nm 220nm內(nèi)，羅漢果苷V的響 應(yīng)靈敏，因此，在記錄儀上能清晰顯示出峰情況。由于進入C18反相柱層析的物料中，羅漢 果苷V的含量已經(jīng)較高，是主要組分，所以記錄儀上顯示的峰值最大(峰高最高，峰面積最 大)的峰所代表的組份就是羅漢果苷V，經(jīng)過取樣，采用HPLC用法定對照品進行確認，也證 明了事實確是如此。由此可以很準確地判斷苷V的起始流出時間和流出結(jié)束時間，據(jù)此收集流份，不需要頻繁進行HPLC檢測，操作方便，可以確保產(chǎn)品純度，提高純化效果，提高羅 漢果苷V的收得率，適于規(guī)模化生產(chǎn)，而且大大降低監(jiān)測費用(HPLC檢測費用高)。
本發(fā)明中，羅漢果苷V的檢測方法采用HPLC法，即高效液相色譜外標法。色譜條 件為
檢測波長203nm
色譜柱ZORBAXSB-C18 5μπι 250mmX4. 6mm
Symmetry Shield RP18 250mmX4. 6mm
溶劑比例水乙腈=77 :23
流速L0ml/min
柱溫35°C
進樣量10μ 1
稀釋劑甲醇
試劑水(超純水)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)
具體操作步驟為，取樣品約25mg，精密稱定，置25ml容量瓶中，加入稀釋劑溶解并 稀釋至刻度，制成約lmg/ml的樣品溶液，置超聲儀中震蕩5S，搖勻待用。用注射器吸取約 2ml樣品溶液經(jīng)過0. 45 μ m濾頭過濾后，裝入樣品瓶中，放入液相色譜儀樣品盤內(nèi)，按上述 色譜條件運行。記錄圖譜，并計算結(jié)果。
本發(fā)明所得的羅漢果苷V為白色或類白色粉末，無異味，含量達到99%以上，色譜 純度99%以上，符合單一化合物質(zhì)量要求，可作為高級甜味劑，特別適宜作為抗糖尿病保健 品的甜味劑或添加劑，也可直接作為治療適應(yīng)病癥的藥品的原料藥。


圖1是本發(fā)明的方法中C18反相柱層析時記錄儀記錄的過程監(jiān)控圖之一；
圖2是根據(jù)圖1所示過程收集所得羅漢果苷V的HPLC圖譜；
圖3是本發(fā)明的方法中C18反相柱層析時記錄儀記錄的過程監(jiān)控圖之二 ；
圖4是根據(jù)圖3所示過程收集所得羅漢果苷V的HPLC圖譜；
圖5是本發(fā)明的方法中C18反相柱層析時記錄儀記錄的過程監(jiān)控圖之三；
圖6是根據(jù)圖5所示過程收集所得羅漢果苷V的HPLC圖譜；
圖7是本發(fā)明的方法中C18反相柱層析時記錄儀記錄的過程監(jiān)控圖之四；
圖8是根據(jù)圖7所示過程收集所得羅漢果苷V的HPLC圖譜；
圖9是本發(fā)明的方法所得最終產(chǎn)品羅漢果苷V的HPLC檢測結(jié)果圖譜。
具體實施方式
實施例1
羅漢果粗苷(含羅漢果苷V38. 53%) 1.005g，溶于95%乙醇中，200 300目硅膠 20g干法裝柱于內(nèi)徑2. 5cm玻璃柱內(nèi)。上樣，以二氯甲烷/乙醇=60/40共IOOml洗柱，然 后換用二氯甲烷/乙醇=50/50的流動相200ml洗脫。兩次洗脫的流速均為lml/2min。于 第二次洗脫開始后流動相有IOOml進入硅膠時，開始收集流份，直至第二次洗脫完畢。所收 集的流份濃縮干燥，得到經(jīng)HPLC檢測羅漢果苷V含量為68. 13%的產(chǎn)物AO. 371g，羅漢果苷V的收得率為65. 27%。
實施例2
羅漢果粗苷(含羅漢果苷V38. 53%) 1.003g，溶于95%乙醇中，200 300目硅膠 30g干法裝柱于內(nèi)徑2. 5cm玻璃柱內(nèi)。上樣，以二氯甲烷/乙醇=60/40共150ml洗柱，然 后換用二氯甲烷/乙醇=50/50的流動相300ml洗脫。兩次洗脫的流速均為lml/2min。于 第二次洗脫開始后流動相有150ml進入硅膠時，開始收集流份，直至第二次洗脫完畢。所收 集的流份濃縮干燥，得到經(jīng)HPLC檢測羅漢果苷V含量為72. 44%的產(chǎn)物AO. 368g，羅漢果苷 V的收得率為68. 98%。
實施例3
羅漢果粗苷(含羅漢果苷V38. 53%) 1.502g，溶于95%乙醇中，200 300目硅膠 45g干法裝柱于內(nèi)徑2. 5cm玻璃柱內(nèi)。上樣，以二氯甲烷/乙醇=68/32共360ml洗柱，然 后換用二氯甲烷/乙醇=50/50的流動相855ml洗脫。兩次洗脫的流速均為lml/2min。于 第二次洗脫開始后流動相有225ml進入硅膠時，開始收集流份，直至第二次洗脫完畢。所收 集的流份濃縮干燥，得到經(jīng)HPLC檢測羅漢果苷V含量為76. 58%的產(chǎn)物AO. 529g，羅漢果苷 V的收得率為70. 00%。
實施例4
羅漢果粗苷(含羅漢果苷V38. 53%) 1.002g，溶于95%乙醇中，200 300目硅膠 30g干法裝柱于內(nèi)徑2. 5cm玻璃柱內(nèi)。上樣，以二氯甲烷/乙醇=60/40共150ml洗柱，然 后換用二氯甲烷/乙醇=53/47的流動相600ml洗脫。兩次洗脫的流速均為lml/2min。于 第二次洗脫開始后流動相有150ml進入硅膠時，開始收集流份，直至第二次洗脫完畢。所收 集的流份濃縮干燥，得到經(jīng)HPLC檢測羅漢果苷V含量為67. 67 %的產(chǎn)物AO. 41 lg，羅漢果苷 V的收得率為72. 04%。
實施例5
羅漢果粗苷(含羅漢果苷V38. 53%) 1.495g，溶于95%乙醇中，200 300目硅膠 45g干法裝柱于內(nèi)徑2. 5cm玻璃柱內(nèi)。上樣，以二氯甲烷/乙醇=65/35共450ml洗柱，然 后換用二氯甲烷/乙醇=47/53的流動相450ml洗脫。兩次洗脫的流速均為lml/2min。于 第二次洗脫開始后流動相有225ml進入硅膠時，開始收集流份，直至第二次洗脫完畢。所收 集的流份濃縮干燥，得到經(jīng)HPLC檢測羅漢果苷V含量為66. 81 %的產(chǎn)物AO. 604g,羅漢果苷 V的收得率為70. 05%。
實施例6
C18填料80g，濕法裝柱于內(nèi)徑3cm玻璃柱內(nèi)，物料A (含羅漢果苷 V72. 44% )0. 403g溶于流動相，流動相為23/77的乙腈/水(體積比)混合物，上樣后以流 動相洗脫，流速為15ml/min，使用紫外檢測器與記錄儀對流出液進行監(jiān)控，紫外檢測器波長 設(shè)置為203nm，收集記錄儀顯示的響應(yīng)值最大的峰所代表的組份，從起峰開始，直至峰回落 到平衡線，減壓濃縮干燥收集的組份得0. 214g，經(jīng)HPLC檢測，羅漢果苷V色譜純度(峰面積 百分數(shù))為99. 51%，含量為99. 56%，計算羅漢果苷V的收得率為72. 98%。
實施例7
C18填料16kg，濕法裝柱，柱內(nèi)徑20cm。物料A(含羅漢果苷V72. 44% )80g溶 于流動相，流動相為23/77的乙腈/水(體積比)混合物，上樣后以流動相洗脫，流速為400ml/min,使用紫外檢測器與記錄儀對流出液進行監(jiān)控，紫外檢測器波長設(shè)置為203nm，收 集圖1中的III部分(最大峰的上升段III-II)的流出液，減壓濃縮干燥收集的流出液，得 43. 49g，經(jīng)HPLC檢測，羅漢果苷V色譜純度(峰面積百分數(shù))為99. 74%，含量為95.94% (見圖2)。計算羅漢果苷V的收得率為72.00%。
實施例8
C18填料16kg，濕法裝柱，柱內(nèi)徑20cm。物料A(含羅漢果苷V71. 41 % ) 86. 5g溶 于流動相，流動相為27/73的乙腈/水(體積比)混合物，上樣后以流動相洗脫，流速為 400ml/min,使用紫外檢測器與記錄儀對流出液進行監(jiān)控，紫外檢測器波長設(shè)置為200nm，收 集圖3中的III部分(最大峰的上升段III-III)的流出液，減壓濃縮干燥收集的流出液，得 46. 66g，經(jīng)HPLC檢測，羅漢果苷V色譜純度(峰面積百分數(shù))為99. 63%，含量為93.97% (見圖4)。計算羅漢果苷V的收得率為。70.98%
實施例9
C18填料16kg，濕法裝柱，柱內(nèi)徑20cm。物料A(含羅漢果苷V75. 33% ) 66. 7g溶 于流動相，流動相為27/73的乙腈/水(體積比)混合物，上樣后以流動相洗脫，流速為 400ml/min,使用紫外檢測器與記錄儀對流出液進行監(jiān)控，紫外檢測器波長設(shè)置為206nm，收 集圖5中的III部分(最大峰的上升段III-II)的流出液，減壓濃縮干燥收集的流出液，得
38.41g，經(jīng)HPLC檢測，羅漢果苷V色譜純度(峰面積百分數(shù))為99. 17%，含量為98. 26% (見圖6)。計算羅漢果苷V的收得率為75. 12%。
實施例10
C18填料16kg，濕法裝柱，柱內(nèi)徑20cm。物料A(含羅漢果苷V76. 58% ) 66. 7g溶 于流動相，流動相為27/73的乙腈/水(體積比)混合物，上樣后以流動相洗脫，流速為 400ml/min,使用紫外檢測器與記錄儀對流出液進行監(jiān)控，紫外檢測器波長設(shè)置為216nm，收 集圖7中的III部分(最大峰的上升段III-II)的流出液，減壓濃縮干燥收集的流出液，得
39.74g，經(jīng)HPLC檢測，羅漢果苷V色譜純度(峰面積百分數(shù))為99. 51%，含量為94. 598% (見圖8)。計算羅漢果苷V的收得率為73. 05%。
實施例11
將實施例7、8、9、10的所得產(chǎn)物混在一起，繼續(xù)干燥，HPLC檢測純度為99. 57%，具 體結(jié)果見圖9，含量為99.7%。
權(quán)利要求
羅漢果苷V的制備方法，包括粗苷的硅膠柱層析和后續(xù)的C18反相柱層析，其特征在于(1)對含有羅漢果苷V的粗苷進行硅膠柱層析時，用兩種比例的二氯甲烷/乙醇混合物作為流動相進行兩次洗脫，第一次洗脫時的流動相的重量比例為58/42～70/30，第二次洗脫時的流動相的重量比例45/55～55/45，收集第二次洗脫的組份，濃縮干燥后得A；(2)將A進行C18反相柱層析時，用乙腈/水混合物洗脫，通過紫外檢測器結(jié)合記錄儀監(jiān)控，收集波長為198nm～220nm時記錄儀顯示的峰值最大的峰所代表的組份，濃縮干燥即得。
2.如權(quán)利要求
1所述的羅漢果苷V的制備方法，其特征在于硅膠的粒度為200 300 目，上樣量為硅膠重量的1/40 1/20，第一次洗脫時，流動相的用量為硅膠重量的5 10 倍(體積/重量，ml/g)，第二次洗脫時，流動相的用量為硅膠重量的10 20倍(體積/重 量，ml/g)，當?shù)诙蜗疵撚?倍流動相進入硅膠后，開始收集流出的組份，直至規(guī)定量的流 動相洗脫完畢。
3.如權(quán)利要求
1所述的羅漢果苷V的制備方法，其特征在于將A進行C18反相柱層 析時，乙腈/水混合物的體積比為20/80 30/70，監(jiān)控時紫外檢測器的波長設(shè)于200nm 210nm, C18反相柱層析的反相填料的粒徑為20 μ m 50 μ m，上樣量為反相填料重量的 1/250 1/180。
專利摘要
本發(fā)明提供了新的操作方便、收得率高、產(chǎn)品純度高、純化效果好的羅漢果苷V的制備方法，該方法能順利地應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)實際，并可降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明提供的羅漢果苷V的制備方法，包括粗苷的硅膠柱層析和后續(xù)的C18反相柱層析，(1)在對含有羅漢果苷V的粗苷進行硅膠柱層析時，用兩種比例的二氯甲烷/乙醇混合物作為流動相進行兩次洗脫，第二次洗脫時的流動相中二氯甲烷的比例小于第一次洗脫時的流動相，收集第二次洗脫的組份，濃縮干燥后得A；(2)將A進行C18反相柱層析時，用乙腈/水混合物洗脫，通過紫外檢測器結(jié)合記錄儀監(jiān)控，收集波長為198nm～220nm時記錄儀顯示的峰值最大的峰所代表的組份，濃縮干燥即得。
文檔編號C07J17/00GKCN101402665 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200810073876
公開日2010年12月8日 申請日期2008年10月31日
發(fā)明者徐位坤, 李倩強, 楊雄輝, 潘遠蕻, 聶軍, 韓臻 申請人:桂林暉昂生化藥業(yè)有限責任公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (1),