專利名稱:用于產(chǎn)生三磷酸腺苷的系統(tǒng)的制作方法
用于產(chǎn)生三磷酸腺苷的系統(tǒng)
本申請(qǐng)要求2007年10月17日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/980，636的權(quán) 益，其通過(guò)引用以其整體在此并入。
本發(fā)明在政府支持下由國(guó)立衛(wèi)生研究院給予的獎(jiǎng)助金編號(hào)K01-RR00188和 HD-33052產(chǎn)生。政府具有本發(fā)明中的某些權(quán)利。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生三磷酸腺苷(〃 ATP")的系統(tǒng)。
發(fā)明背景
生物技術(shù)的一個(gè)最引人注目的前景用途是產(chǎn)生可以執(zhí)行生物學(xué)功能的雜合有 機(jī)-無(wú)機(jī)裝置。對(duì)于這樣的裝置的應(yīng)用是眾多的。例如，它們可以被植入并執(zhí)行診斷或治 療的功能，例如提供需要的酶活性或釋放藥物至特定組織。這些裝置可以在血液內(nèi)循環(huán)并 在通過(guò)暴露至特定分子、病原體、患病細(xì)胞或組織類型的刺激時(shí)釋放藥物或催化反應(yīng)。它們 甚至可以進(jìn)入其中它們可以補(bǔ)償有缺陷的或缺乏的生物反應(yīng)的單個(gè)細(xì)胞?？蛇x擇地，它們 可以以"納米機(jī)器人(nanobot)"的方式執(zhí)行機(jī)械功能。
納米顆粒遞送載體的實(shí)例存在于現(xiàn)有技術(shù)中(Franzen等的美國(guó)專利號(hào) 7，332，586和美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2008/0199529)。然而，可以執(zhí)行生物學(xué)功能的自供動(dòng)力 的有機(jī)_無(wú)機(jī)裝置的應(yīng)用更加廣泛。例如，執(zhí)行生物學(xué)功能的雜合有機(jī)_無(wú)機(jī)裝置可以攜 帶酶以替代失去的功能，例如患者出生而沒(méi)有特定酶的先天性缺陷。這將提出其中患者的 DNA必須被改變的"基因治療"的一種替代方案?？蛇x擇地，人們潛在地可以使用這樣的裝 置以攜帶能夠降解毒素或識(shí)別并消滅病原體的酶。另一種潛在的功能將是產(chǎn)生可以與病原 體或癌細(xì)胞結(jié)合，然后直接在那些細(xì)胞特異性泵出藥物或代謝物的裝置。類似地，人們可以 產(chǎn)生外科醫(yī)生可以將其包裝進(jìn)感染性創(chuàng)口以在缺乏血管供應(yīng)的區(qū)域中泵出抗生素的裝置。 兩種方法都將增加藥物的局部濃度并減少全身毒性。然而，如何為這樣的裝置一特別是在 非常小的，納米尺度上一提供動(dòng)力的問(wèn)題仍然是這樣的裝置的發(fā)展和實(shí)際使用的關(guān)鍵性 障礙。
雜合有機(jī)-無(wú)機(jī)納米裝置的實(shí)例已經(jīng)被報(bào)道了。例如，重組體Fl-ATP酶已經(jīng)產(chǎn) 生，其一端拴(tether)到固體表面而另一端支持小的鎳桿(Soong et al. , “ Powering an Inorganic Nanodevice with a BiomolecularMotor, " Science, 290 :1555-8(2000))。 Soong證明依靠水解ATP (對(duì)于生物反應(yīng)最常見的細(xì)胞能量形式)，該分子進(jìn)行旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)并 且該桿可以被看出移動(dòng)?？赡娼Y(jié)合位點(diǎn)形式的"開關(guān)(on-off switch)“已經(jīng)被設(shè)計(jì)進(jìn)該 相同的分子馬達(dá)(Liu et al. , “ Control of a BiomolecularMotor-powered Nanodevice with an Engineered Chemical Switch, " Nat. Mater.，1 :173-7 (2002))，顯示這樣的裝置 可以被調(diào)控。類似地，其它納米馬達(dá)基于RNA螺旋酶、驅(qū)動(dòng)蛋白、動(dòng)力蛋白或肌球蛋白。然 而，為了有功能，ATP必須外源提供或者在該裝置本身局部地產(chǎn)生。
已經(jīng)報(bào)道了產(chǎn)生ATP的系統(tǒng)，使用細(xì)菌視紫紅質(zhì)和F0F1-ATP合酶(Luo et al. , “ Photo-Induced Proton Gradients and ATP BiosynthesisProduced byVesicles Encapsulated in a Silica Matrix, " Nat. Mater. , 4 :220_4(2005) ；Choi et al. , " Advances in Nano Biotic/Abiotic HybridSystems Protein-Based Engineered Devices, “ Nanobiotechnol 3:66-75(2007))。然而，該系統(tǒng)需要外源光，其對(duì)于體內(nèi)的 醫(yī)學(xué)應(yīng)用是不實(shí)際的。
納米生物機(jī)器的第二個(gè)實(shí)例從微管和具有丙酮酸激酶的異_雙功能聚合物粒子 產(chǎn)生，其通過(guò)利用自給的ATP在涂有驅(qū)動(dòng)蛋白的玻璃表面上驅(qū)動(dòng)(Du et al, “ Motor Protein Nano-biomachine Powered bySe If-supplying ATP, " Chem Commun., 2080-82(2005))。然而，該納米機(jī)器涉及與越過(guò)玻璃表面的微管一起體外用于運(yùn)動(dòng)性測(cè)定。 它不需要葡萄糖或果糖作為起始物料，而需要外源二磷酸腺苷(“ADP")和磷酸烯醇丙酮 酸鹽(“PEP")以產(chǎn)生ATP。
把蛋白質(zhì)附著或連接到固體支持物在本領(lǐng)域是眾所周知的。然而，維持偶聯(lián)到固 體支持物的蛋白質(zhì)的活性挑戰(zhàn)了本領(lǐng)域的科學(xué)家，而只有少數(shù)連接單個(gè)蛋白質(zhì)到固體支持 物并且維持該蛋白質(zhì)活性的情況已經(jīng)被顯示。
本發(fā)明涉及克服本領(lǐng)域的這些和其它缺陷。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于產(chǎn)生ATP的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括支持物和偶聯(lián)到該支持 物的能夠共同從葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生ATP的一種或更多種酶。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于進(jìn)行包括ATP到ADP轉(zhuǎn)化的反應(yīng)的裝置。該裝置包 括用于產(chǎn)生ATP的系統(tǒng)，其包括支持物和偶聯(lián)到該支持物的能夠共同從葡萄糖或果糖代謝 產(chǎn)生ATP的一種或更多種酶。該裝置另外包括與該系統(tǒng)相關(guān)并且能夠把ATP轉(zhuǎn)變?yōu)锳DP和 進(jìn)行該反應(yīng)的部件。
本發(fā)明還涉及用于進(jìn)行包括ATP到ADP轉(zhuǎn)化的反應(yīng)的方法。該方法包括提供用于 從葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生ATP的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括支持物和偶聯(lián)到該支持物的能夠共同從 葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生ATP的一種或更多種酶。該系統(tǒng)在從葡萄糖或果糖代謝有效產(chǎn)生 ATP的條件下與葡萄糖或果糖接觸。ATP被轉(zhuǎn)變成ADP，并且該反應(yīng)進(jìn)行。
本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案還涉及用于產(chǎn)生ATP的方法。這包括提供用于從 葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生ATP的系統(tǒng)。該裝置包括支持物和偶聯(lián)到該支持物的能夠共同從葡 萄糖或果糖代謝產(chǎn)生ATP的一種或更多種酶。該系統(tǒng)在從葡萄糖或果糖代謝有效產(chǎn)生ATP 的條件下與葡萄糖或果糖接觸。
本發(fā)明涉及改進(jìn)的用于體內(nèi)醫(yī)學(xué)應(yīng)用的產(chǎn)生ATP的機(jī)制。這構(gòu)成了在把一個(gè)途徑 中的酶順序拴到固體支持物并且讓那些酶連續(xù)地執(zhí)行它們的功能中的重要進(jìn)步。這構(gòu)成了 用于從存在于血清的葡萄糖或果糖體內(nèi)產(chǎn)生ATP的新方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示潛在的醫(yī)學(xué)納米裝置設(shè)計(jì)的示意圖。在該圖像中，把支持物包封在脂質(zhì) 體內(nèi)，葡萄糖通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)進(jìn)入，并且拴住的糖酵解途徑加工葡萄糖成為 ATP，其可以1)催化共拴到該支持物的需要的酶促反應(yīng)，或2)為膜"泵"(例如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白)提供動(dòng)力，其將釋放負(fù)荷(cargo)(例如包含在該脂質(zhì)體內(nèi)的化學(xué)療法藥物或抗生素)。 丙酮酸鹽形式的"廢物"將通過(guò)添加另外的酶(LDH)被轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗猁}，然后將通過(guò)另一種 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MCT)去除。添加該能力將允許補(bǔ)充糖酵解需要的中間產(chǎn)物以繼續(xù)發(fā)揮功能。還將把啟動(dòng)數(shù)量的ATP、和ADP、無(wú)機(jī)磷酸鹽、以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)共包封入該 裝置中以支持需要的反應(yīng)。
圖2顯示使用芯片亞組裝件代替在單個(gè)芯片上具有全部10種(或11種，如果包 括LDH)酶。
圖3顯示在整個(gè)糖酵解途徑中代謝葡萄糖或果糖的酶的位置。丙酮酸鹽通過(guò)乳酸 脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗猁}顯示為另外的步驟，因?yàn)槿缭诖擞懻摰钠錆撛诘膽?yīng)用重要性。
圖4顯示利用本發(fā)明產(chǎn)生的用于生產(chǎn)設(shè)計(jì)的分子產(chǎn)品(例如特定形式的蛋白質(zhì)、 納米顆粒、或更復(fù)雜的"分子機(jī)器"一可以共同發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)的組)的ATP。這可以 是大規(guī)模或小規(guī)模的。
圖5顯示一種從前面的圖片中顯示的應(yīng)用中除去產(chǎn)生ATP的納米裝置的方法。如 果該裝置是磁性的，它們潛在地可以應(yīng)用磁體分離。
圖6顯示潛在地可以與〃生物電池〃或使用ATP發(fā)電的其它技術(shù)，無(wú)論單個(gè)裝置 或多個(gè)亞組裝件，連接的本發(fā)明的技術(shù)。應(yīng)用可以包括在身體中發(fā)電以為泵、起搏器、去纖 顫器或其它需要電的裝置提供動(dòng)力。可選擇地，該動(dòng)力可用于對(duì)這樣的裝置的電池再充電。
圖7A-C顯示重組體蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)和純化的His-HK以及His-GPI的證實(shí)。在圖7A 中，把六組氨酸標(biāo)簽引入HK和GPI的N末端。直接用His標(biāo)簽替代HKl-sc的已知的生殖 細(xì)胞特異性靶向結(jié)構(gòu)域。實(shí)施His-HK(圖7B)和His-GPI (圖7C)的SDS-PAGE和免疫印跡 分析作為純化過(guò)程的質(zhì)量控制以及檢驗(yàn)產(chǎn)品的身份。實(shí)施考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色以顯現(xiàn)到 純化最后存在的總蛋白質(zhì)。針對(duì)His標(biāo)簽(His)的抗體指示包含該標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的表觀分 子量，而針對(duì)HK(HK)和GPI(GPI)的抗體用于證實(shí)酶的身份。
圖8A-B顯示當(dāng)分別拴住時(shí)結(jié)合的His-HK和His-GPI的活性。把重組體蛋白質(zhì) 拴到具有M-NTA表面的金芯片并充分洗滌以除去任何松弛結(jié)合或未結(jié)合的蛋白質(zhì)。偶 聯(lián)的酶促反應(yīng)用于測(cè)定與支持物結(jié)合的蛋白質(zhì)的活性，按照描述利用用分光光度法測(cè)定在 340nm的吸收度的改變?；钚源韥?lái)自η = 9個(gè)樣品的平均值，來(lái)自3種蛋白質(zhì)制劑各3個(gè) 樣品。條形圖指示標(biāo)準(zhǔn)差。
圖9Α-Β顯示氨基末端His標(biāo)簽/Ni-NTA連接化學(xué)作用的使用相對(duì)于隨機(jī)吸附到 表面的GPI改進(jìn)了 GPI的結(jié)合和比活性。利用表達(dá)載體提供的腸激酶位點(diǎn)將His標(biāo)簽從 His-GPI裂開。在圖9A中，與沒(méi)有His標(biāo)簽的對(duì)照GPI相比大約兩倍的His-GPI與Ni-NTA 支持物結(jié)合(ρ = 0.012，成對(duì)student T檢驗(yàn)；η = 9個(gè)樣品，來(lái)自3種蛋白質(zhì)制劑各3個(gè) 樣品。條形圖指示標(biāo)準(zhǔn)差。)。圖9Β顯示把結(jié)合的蛋白質(zhì)的量標(biāo)準(zhǔn)化允許定量吸附的蛋白 質(zhì)的比活性。His-GPI的比活性為隨機(jī)吸附的GPI的大約9倍，雖然溶液中的酶活性是相 對(duì)相當(dāng)?shù)?P = 0.006，成對(duì)student T檢驗(yàn)；η = 9個(gè)樣品，來(lái)自3種蛋白質(zhì)制劑各3個(gè)樣 品。條形圖指示標(biāo)準(zhǔn)差。)。
圖10顯示His-HK和His-GPI被拴到一起，允許順序催化葡萄糖為葡萄糖_6_磷 酸然后是果糖-6-磷酸。通過(guò)描述的偶聯(lián)反應(yīng)途徑檢測(cè)該反應(yīng)的完成?！癏K-GPI “表示 與0. 5nM His-HK和0.5nM His-GPI—起孵育的支持物。用InM濃度的蛋白質(zhì)溶液獲取與 His-HK單獨(dú)(HK)或His-GPI單獨(dú)(GPI) —起孵育的支持物的讀數(shù)。利用在MOPS緩沖液 (緩沖液)中孵育的M-NTA表面進(jìn)行空白試驗(yàn)。該圖顯示來(lái)自一組蛋白質(zhì)制劑的有代表性 的結(jié)果，使用重復(fù)三次的樣品(條形圖表示標(biāo)準(zhǔn)差)。因?yàn)榭梢灶A(yù)見對(duì)于各組制劑的各種蛋白質(zhì)結(jié)合略微地不同，對(duì)于該實(shí)驗(yàn)集中數(shù)據(jù)不會(huì)是有效的；然而，實(shí)驗(yàn)使用三個(gè)單獨(dú)組的制 劑進(jìn)行，每次具有非常相似結(jié)果。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于產(chǎn)生ATP的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括支持物和偶聯(lián)到支持物 的能夠共同從葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生ATP的一種或更多種酶。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于進(jìn)行包括ATP到二磷酸腺苷(“ADP")轉(zhuǎn)變的反 應(yīng)的裝置。該裝置包括用于產(chǎn)生ATP的系統(tǒng)，其包括支持物和偶聯(lián)到該支持物的能夠共同 從葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生ATP的一種或更多種酶。該裝置另外包括與該系統(tǒng)相關(guān)并且能夠 把ATP轉(zhuǎn)變?yōu)锳DP和進(jìn)行該反應(yīng)的部件。
圖1提供了根據(jù)本發(fā)明具有其中葡萄糖通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(“GLUT")進(jìn)入的 包封的支持物的裝置的示意圖。拴住的糖酵解途徑，包括復(fù)數(shù)的酶，加工葡萄糖成為丙酮酸 鹽，產(chǎn)生ATP (2個(gè)凈分子的ATP來(lái)源于每個(gè)葡萄糖分子)。該途徑的示意圖顯示于圖3。在 該途徑中，通過(guò)己糖激酶把葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?-P，而以葡萄糖6-異構(gòu)酶把葡萄糖6-P轉(zhuǎn) 變?yōu)楣?-P。6-磷酸果糖激酶把果糖6-P轉(zhuǎn)變?yōu)楣莑，6-bisP。醛縮酶把果糖l，6-bisP 轉(zhuǎn)變?yōu)镚AP和DHAP。以甘油醛-3-P脫氫酶把GAP轉(zhuǎn)變?yōu)?，3_bisPG。以磷酸甘油酸激酶 把該反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)?-PG。以磷酸甘油酸變位酶把3-PG轉(zhuǎn)變?yōu)?-PG。烯醇化酶把2-PG 轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐急猁}。丙酮酸激酶把磷酸烯醇丙酮酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)楸猁}。在有些情況 下，以乳酸脫氫酶把丙酮酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗猁}。
糖酵解中涉及的酶或蛋白質(zhì)可以與一種或更多種支持物連接。在該情況中，每組 拴著的酶執(zhí)行在ATP生產(chǎn)中它們的連續(xù)步驟，然后該反應(yīng)的產(chǎn)物給由拴到相同或不同支持 物的另一種酶執(zhí)行的反應(yīng)的后續(xù)部分提供燃料。后者的實(shí)施方案顯示于圖2，其證明糖酵解 的酶可以分開并拴到分離的支持物而仍然執(zhí)行整個(gè)糖酵解途徑。這是有益的，因?yàn)榭梢园?要拴的每種酶以不同的連接化學(xué)作用偶聯(lián)到表面以便于它們的精確模式化。通過(guò)使較少的 酶附著于特定表面，對(duì)偶聯(lián)不同酶的不同連接化學(xué)作用的需要將減少。這是因?yàn)椴煌缚?以以相同的連接化學(xué)作用偶聯(lián)到不同的表面。
圖1的裝置中產(chǎn)生的ATP可以1)催化其中必需的酶共拴到該支持物的需要的酶 促反應(yīng)或者2)為膜"泵"提供動(dòng)力。在執(zhí)行前者的應(yīng)用中，底物χ進(jìn)入該裝置，在其中它 和偶聯(lián)到固體支持物的酶接觸，在該固體支持物上該酶把底物χ轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物1。然后產(chǎn)物y 從該裝置輸出。在為膜泵提供動(dòng)力中，ATP驅(qū)動(dòng)ATP結(jié)合盒(“ABC")轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或多藥轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白(“MDR")，引起包含在脂質(zhì)體中的負(fù)荷(例如化學(xué)療法藥物或抗生素)的釋放。 丙酮酸鹽形式的廢物通過(guò)乳酸脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗猁}。為了除去乳酸鹽，把單羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白(“MCT")定位于包封試劑中。這允許該反應(yīng)進(jìn)行而不被終末產(chǎn)物或pH的改變抑制。 可以把溶質(zhì)載體家族2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(“GLUT")定位于包封試劑中以把葡 萄糖或果糖運(yùn)送至偶聯(lián)到該支持物的酶。包封試劑也可以包括底物的進(jìn)口和反應(yīng)產(chǎn)物的出 口。進(jìn)口和出口是，例如通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和/或孔。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，己糖激酶、葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸果糖激酶、 醛縮酶、丙糖_磷酸_異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位 酶、烯醇化酶和丙酮酸激酶附著于固體支持物。
可以把酶以選擇的位置連續(xù)排列在支持物上以連續(xù)地進(jìn)行從葡萄糖或果糖代謝生產(chǎn)ATP。此外，可以把乳酸脫氫酶偶聯(lián)到該支持物以進(jìn)行丙酮酸鹽到乳酸鹽的轉(zhuǎn)變。用這 種方法，NAD+可以被補(bǔ)充以進(jìn)行隨后的糖酵解反應(yīng)。
雖然存在許多不同的潛在連接化學(xué)作用，一種偶聯(lián)機(jī)制用把偶聯(lián)的連接劑結(jié)合到 納米粒子支持物的酶替代糖酵解酶的靶向或支架結(jié)構(gòu)域。一種偶聯(lián)機(jī)制用多聚組氨酸標(biāo)簽 (“His-tag")替代糖酵解酶的靶向或支架結(jié)構(gòu)域。另一種偶聯(lián)機(jī)制用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移 酶(“GST融合標(biāo)簽")融合標(biāo)簽替代糖酵解酶的靶向結(jié)構(gòu)域。His標(biāo)簽和GST融合標(biāo)簽 允許重組體蛋白質(zhì)與附著到固體表面的連接劑結(jié)合。
適當(dāng)?shù)倪B接劑包括，但不限于次氮基三乙酸鎳或谷胱甘肽。
任選地，支持物首先被涂布。適當(dāng)?shù)耐繉影?，但不限于聚乙二醇或金?br>對(duì)于本發(fā)明的裝置適當(dāng)?shù)陌庠噭┌?，但不限于脂質(zhì)體、硅橡膠植入物和特氟 隆(Teflon)植入物。包封試劑的使用在本領(lǐng)域?yàn)榇蠹宜熘?br>該裝置的另一個(gè)實(shí)施方案還可以包括定位于或偶聯(lián)到支持物的酶以使底物磷酸 化。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，與該系統(tǒng)相關(guān)的部件執(zhí)行生物或生物化學(xué)反應(yīng)。
本發(fā)明還涉及用于進(jìn)行包括ATP到ADP轉(zhuǎn)變的反應(yīng)的方法。該方法包括提供用于 從葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生ATP的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括支持物和偶聯(lián)到支持物的能夠共同從葡 萄糖或果糖代謝產(chǎn)生ATP的一種或更多種酶。該系統(tǒng)在從葡萄糖或果糖代謝有效產(chǎn)生ATP 的條件下與葡萄糖或果糖接觸。ATP被轉(zhuǎn)變?yōu)锳DP并且該反應(yīng)進(jìn)行。
在執(zhí)行該方法中，該系統(tǒng)可以是與上面描述的那樣基本上相同的。
本發(fā)明的方法還可以包括用試劑，例如ATP、NAD+或Pi啟動(dòng)該系統(tǒng)的步驟。這通 過(guò)圖4大略地顯示，其中葡萄糖和底物的重復(fù)添加另外描述。通過(guò)用糖酵解期間使用的系 統(tǒng)的中間產(chǎn)物、起始材料和/或輔因子啟動(dòng)該裝置，ATP連續(xù)地產(chǎn)生并能驅(qū)動(dòng)該反應(yīng)無(wú)限期 地向前(直至該裝置上蛋白質(zhì)的壽命)。糖酵解的ATP生產(chǎn)的量還可以控制反應(yīng)速率(與 包封試劑中的ATP相反，其可以允許酶以其完全的動(dòng)力學(xué)速度運(yùn)轉(zhuǎn))。因此，仔細(xì)設(shè)計(jì)的裝 置通過(guò)包封試劑膜中的組分以限定的速率泵出其給定量的產(chǎn)物，只要血糖被限制在特定范 圍內(nèi)。ATP的生產(chǎn)還可以與葡萄糖的攝取相聯(lián)系以便該裝置不會(huì)執(zhí)行其功能直到葡萄糖進(jìn) 入該裝置。如果該裝置被包封在保護(hù)膜或基質(zhì)的第二外層中，這提供了一種另外的水平的 控制，可以經(jīng)過(guò)給定時(shí)期降解然后允許葡萄糖激活該裝置。用這種方法，人們可以容易地產(chǎn) 生為了它們內(nèi)容物的延遲釋放設(shè)計(jì)的多種亞組的裝置，并且亞型的混合物可以測(cè)定釋放的 速率和持續(xù)時(shí)間。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)納米顆粒系統(tǒng)產(chǎn)生的ATP用于給生物電池 (bio-cell)(參見圖6)或其它產(chǎn)生電的技術(shù)提供燃料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，ATP用于進(jìn)行反應(yīng)，例如ATP到ADP的轉(zhuǎn)變，借此產(chǎn)生氫。然后 該氫跨膜移動(dòng)產(chǎn)生電。氫還可以用于包封試劑的部件以便于室間(intercellular)運(yùn)輸。
本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案還涉及用于產(chǎn)生ATP的方法。這包括提供用于從 葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生ATP的系統(tǒng)。該裝置包括支持物和偶聯(lián)到該支持物的能夠共同從葡 萄糖或果糖代謝產(chǎn)生ATP的一種或更多種酶。該系統(tǒng)在從葡萄糖或果糖代謝有效產(chǎn)生ATP 的條件下與葡萄糖或果糖接觸。
如圖5中大略所示，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ATP生成系統(tǒng)可以
9為偶聯(lián)至能或不能一起發(fā)揮功能的一種或更多種酶或蛋白質(zhì)的其它次級(jí)納米顆粒支持物 或亞組裝件提供動(dòng)力。這些次級(jí)亞組裝件可以包括特定形式的酶或蛋白質(zhì)、納米顆粒、和/ 或更復(fù)雜的分子機(jī)器，其中偶聯(lián)至單個(gè)或復(fù)數(shù)個(gè)支持物的酶或蛋白質(zhì)協(xié)力地起作用，如圖5 中所示。
例如，可以把數(shù)組酶在來(lái)自本發(fā)明的系統(tǒng)的單獨(dú)的支持物上偶聯(lián)在一起，該系統(tǒng) 需要ATP以發(fā)揮功能或執(zhí)行反應(yīng)。該次級(jí)結(jié)構(gòu)也可以攜帶在與ATP或底物接觸時(shí)被功能化 的單個(gè)酶或蛋白質(zhì)。該二級(jí)結(jié)構(gòu)也可以通過(guò)釋放酶促反應(yīng)的產(chǎn)物并由此在另一個(gè)次級(jí)亞 組裝件上觸發(fā)反應(yīng)或事件一起起作用。此外，由本發(fā)明的裝置產(chǎn)生的ATP可以給更復(fù)雜的 分子工廠提供燃料，借此底物通過(guò)該分子工廠內(nèi)的一系列或級(jí)聯(lián)反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)樵O(shè)計(jì)的分子產(chǎn) 物。
在該實(shí)施方案中，可以通過(guò)對(duì)該裝置使用磁體除去不需要的亞組裝件或支持 物。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)磁體被用于該裝置時(shí)，可能如圖5中所示純化其它次級(jí)組件或 結(jié)構(gòu)的產(chǎn)品。更具體地說(shuō)，磁化的納米顆?？梢员还δ芑员阈枰牡孜锘蚍磻?yīng)產(chǎn)物可 以與磁化的結(jié)構(gòu)分離。這在本領(lǐng)域?yàn)榇蠹宜熘?Barry et al.，“ Applications of MagneticNanopartic1es in Biomedicine,“ J. Phys. D :Appl. Phys. 36 :R198-R206(2003)， 其通過(guò)引用全文在此并入)。
實(shí)施例
下列實(shí)施例提供來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案但絕非打算限制其范圍。
實(shí)施例1——重組體己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的產(chǎn)生
所有的試劑都從Sigma(St.L0UiS，M0)購(gòu)買，除非另有指示。使用下列引物通 過(guò) RT-PCR 從小鼠睪丸克隆全長(zhǎng) HKl-sc 和體細(xì)胞 GPI, 5' -ATGGGACAGAACTGCCAGCGAGGAC-3 ，(SEQ ID NO :1)(正向，HKl-sc)，5，-TTAGGCGTTCGTAGGGTCTCCTCTGAGCC-3，(SEQ ID NO: 2)(反向，HKl-sc) ,5' -ATGGCTGCGCTCACCCGGAACC-3，(SEQ ID NO :3)(正向，GPI)，以及 5，-TTATTCTAGTTTGGTGTCCCGCTGTTGC-3，(SEQ ID NO :4)(反向，GPI)。使用另一種正向 引物，5，-GAAAAGATTGATAAGTATCTGTATGCCATGCGGC-3，(SEQ ID NO 5)通過(guò)巢式 PCR 去除 HKl-sc的生殖細(xì)胞特異性靶向結(jié)構(gòu)域。把HK和GPI cDNA克隆進(jìn)表達(dá)載體pcDNA4/HisMax Τ0Ρ0 TAdnvitrogen)，其在氨基端添加了 6組氨酸重復(fù)，后面是腸激酶切割位點(diǎn)然后是 糖酵解酶序列。構(gòu)建體通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證然后使用293feCtinTM轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)轉(zhuǎn)染 進(jìn) HEK293-F-FreeStyle 細(xì)胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)。48h 以后使用 Ni-NTA 純化系 統(tǒng)(Invitrogen)從細(xì)胞裂解物中純化蛋白質(zhì)。純化的蛋白質(zhì)使用IL的50mM MOPS透析 3 次,然后使用 Amicon filtrationcentritubes (Mi 11 ipore, Billerica, ΜΑ)濃縮。使用 Micro-BCA試驗(yàn)(Pierce，Rockford，IL)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并且通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡 法分析樣品的純度。使用的初級(jí)抗體如下小鼠抗His標(biāo)簽(1 5000稀釋，Invitrogen)， 小鼠抗1型己糖激酶(1 1000稀釋，Chemicon，Temecula，CA)，和兔抗GPI(1 500稀釋， Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)。使用的二級(jí)抗體為 ECL 抗小鼠 IgG 和 ECL 抗兔 IgG，兩者都綴合辣根過(guò)氧化酶(Amersham，GE Healthcare, Piscataway, NJ)。
實(shí)施例2——重組體HKl和GPI的產(chǎn)生
通過(guò)RT-PCR從小鼠睪丸RNA獲得HKl (HKl-sc)和GPI的生殖細(xì)胞特異性同種型的cDNA，并且通過(guò)巢式PCR去除HK的生殖細(xì)胞特異性靶向結(jié)構(gòu)域(Travis AJ, et. al，J. Biol. Chem. 274,34467-34475(1990)，其通過(guò)引用在此全文并入)。把該構(gòu)建體插入在氨基端設(shè)置 六組氨酸標(biāo)簽的載體，由此替代HKl-sc生殖細(xì)胞特異性靶向結(jié)構(gòu)域。在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng) 中表達(dá)His-HK和His-GPI然后使用Ni-NTA系統(tǒng)純化。使用SDS-PAGE分離產(chǎn)物并且通過(guò) 考馬斯染色以及使用針對(duì)蛋白質(zhì)和針對(duì)His標(biāo)簽的抗體的免疫印跡法分別檢驗(yàn)它們的純 度和身份。發(fā)現(xiàn)兩種重組體酶都是非常純的(80-90%，在樣品制劑之間只有輕微的變動(dòng))， 具有與適當(dāng)?shù)目贵w的免疫反應(yīng)性，并且以預(yù)期的分子量遷移(圖7)。
實(shí)施例3——His-HK和His-GPI酶活性的定量
利用偶聯(lián)反應(yīng)途徑分別檢查溶液中的重組體蛋白質(zhì)活性，最終通過(guò)340nm處吸光 度的變化測(cè)定NADP+的還原。如上所述，對(duì)于兩種反應(yīng)，都添加外源葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (G6PDH)。通過(guò)在沒(méi)有外源G6PDH或底物的情況下進(jìn)行對(duì)照反應(yīng)，并且比較來(lái)自實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì) 與市場(chǎng)上可買到的純化的HKl和GPI的值，證實(shí)吸光度的變化特異地衡量了目標(biāo)酶活性。
His-HK證明無(wú)生殖細(xì)胞靶向區(qū)域的活性，具有等于11. 67U/mg的Vmax，以及等于 0. 274mM (葡萄糖)的&(表1)。
V maxKfflHis-HK11. 67 士 5. 820. 274 士 0. 12His-GPI48. 89 士 8. 890. 226 士 0. 086
該結(jié)果與溶液中的商品化HK酶獲得的值非常相似(Vmax= 12. 33U/mg, Kffl = 0. 245mM葡萄糖)。這些結(jié)果證明用六組氨酸標(biāo)簽替換生殖細(xì)胞特異性結(jié)構(gòu)域的重組體HK 仍然是有功能的。接下來(lái)測(cè)試了當(dāng)吸附至具有Ni-NTA表面的金薄片(圖8A)時(shí)His-HK的 活性。該重組體在表面上顯示活性，陰性對(duì)照是在缺少外源反應(yīng)部件的芯片上的重組體，以 及有該反應(yīng)部件的空白Ni-NTA芯片。為了鑒定占有(co-opt)生殖細(xì)胞特異性靶向結(jié)構(gòu)域 的價(jià)值，進(jìn)行了若干產(chǎn)生缺少天然靶向結(jié)構(gòu)域或His標(biāo)簽的重組體HK(利用載體提供的腸 激酶位點(diǎn))的嘗試。這些蛋白質(zhì)是非常不穩(wěn)定的，并且它們的降解防礙獲得可解釋的比較 數(shù)據(jù)。
把類似方法用于His-GPI，當(dāng)在溶液中測(cè)試時(shí)其具有等于48. 89U/mg的Vmax，以及 等于0. 226mM(果糖6-磷酸)的&(表1)。與HK不同，有可能利用腸激酶(Novagen,EMD/ Merck, Madison, WI)去除His標(biāo)簽。用腸激酶樹脂和Ni-NTA瓊脂糖來(lái)從裂開的His標(biāo)簽 去除殘余的腸激酶和蛋白質(zhì)。然后利用SDS-PAGE和使用針對(duì)His標(biāo)簽的抗體的免疫印跡 法證實(shí)沒(méi)有His-GPI殘存。裂解后，檢驗(yàn)了 GPI蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)活性具有相似的結(jié)果。不 帶His標(biāo)簽的GPI構(gòu)建體具有等于51. 28U/mg的Vmax，以及等于0. 308mM(果糖6-磷酸)的 Km。如同HK的情況一樣，這些值與商品化的酶獲得的那些(Vmax 54. 054U/mg,Km 0. 476mM果 糖6-磷酸)非常相似。當(dāng)于4°C存儲(chǔ)時(shí)實(shí)驗(yàn)和對(duì)照GPI重組體蛋白質(zhì)兩者都穩(wěn)定超過(guò)2個(gè) 月。
接下來(lái)測(cè)試了當(dāng)拴至Ni-NTA金芯片時(shí)His-GPI的活性(圖8B)。當(dāng)吸附至表面 時(shí)重組體顯示了活性，表明甚至當(dāng)拴住時(shí)重組體也是有功能的。芯片上的吸附和比活性在
11His-GPI和對(duì)照GPI之間顯著不同，其中對(duì)照GPI的His標(biāo)簽使用腸激酶去除(圖9)。因 此，氨基端連接物不僅提供更高的與芯片結(jié)合的量，而且提供顯著更高的結(jié)合的每單位蛋 白質(zhì)的活性。
實(shí)施例4——Ni-NTA表面的制備和蛋白質(zhì)固定
為了測(cè)定與芯片結(jié)合的蛋白質(zhì)的量，在吸附前后定量溶液的濃度。使用橢圓率測(cè) 量術(shù)通過(guò)測(cè)定吸附至表面的蛋白質(zhì)層的相對(duì)厚度證實(shí)該發(fā)現(xiàn)。
實(shí)施例5——His-HK和His-GPI活性的分光光度分析
利用導(dǎo)致NADP+到NADPH的還原的偶聯(lián)酶反應(yīng)途徑測(cè)定HK和GPI活性。該還原的 速率使用分光光度計(jì)(SAFIRE microplate reader, Tecan,Medford,ΜΑ)測(cè)量為 340nm處的 吸光度變化。對(duì)于HK的偶聯(lián)反應(yīng)如下葡萄糖+ATP —葡萄糖-6-磷酸+ADP和葡萄糖-6-磷 酸+NADP+ — NADPH+6-磷酸-葡萄糖酸-δ -內(nèi)酯，其中第一個(gè)反應(yīng)由His-HK催化，而第二 個(gè)由外源葡萄糖6-磷酸脫氫酶(G6PDH)催化。對(duì)于GPI的偶聯(lián)反應(yīng)如下果糖_6_磷酸 —葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸+NADP+ — NADPH+6-磷酸-葡萄糖酸-δ -內(nèi)酯，其中 第一個(gè)反應(yīng)由His-GPI催化，而第二個(gè)由外源G6PDH催化。在緊接著各試驗(yàn)前制備新鮮的 NADP+和ATP的儲(chǔ)存液?；A(chǔ)反應(yīng)混合物包含50mMM0PS緩沖液(pH 7.4)中的ImM NADP+、 IOmM MgCl2、和3U/mlG6PDH。為了定量HK活性，添加了 ImM ATP和5mM葡萄糖。為了定量 GPI活性，添加了 5mM果糖6-磷酸。從線性范圍內(nèi)獲取的斜率確定活性測(cè)量結(jié)果。各種酶 的K1^nvmax通過(guò)在它們的各自底物的多種濃度定量酶活性并擬合該數(shù)據(jù)為雙曲線函數(shù)來(lái)計(jì) 算。一個(gè)酶活性單位定義為每分鐘催化lymol NADPH形成的酶的量。
實(shí)施例6——把酶拴至無(wú)機(jī)支持物以及結(jié)合時(shí)活性的定量
通過(guò)室溫下在黑暗中把60 μ 1包含已知的量蛋白質(zhì)的50mMM0PS(pH 7. 4)置于單 個(gè)金Ni-NTA表面(IX Icm正方形)吸附蛋白質(zhì)。15min后，通過(guò)移液移去50 μ 1溶液，然后 把90μ1 MOPS緩沖液溫和地加到該表面。然后收集該體積并與已經(jīng)移去的50 μ 1組合以 便定量不結(jié)合的蛋白質(zhì)的量。再進(jìn)行使用90 μ 1體積MOPS緩沖液的兩次洗滌，并且這些也 分別收集以定量移去的蛋白質(zhì)。使用Micro-BCA蛋白質(zhì)試驗(yàn)確定這三個(gè)體積中的蛋白質(zhì)的 濃度并且通過(guò)減去計(jì)算保留在芯片上的蛋白質(zhì)的量。應(yīng)當(dāng)注意到通過(guò)第二次和第三次洗滌 移去的蛋白質(zhì)的量一致在檢測(cè)水平以下。為了保證去除所有未結(jié)合或松弛結(jié)合的蛋白質(zhì)， 然后使用5ml MOPS緩沖液溫和地洗滌該表面3次。因此，應(yīng)當(dāng)注意到為了定量比活性的目 的，結(jié)合的蛋白質(zhì)的量等于或少于定量的量，產(chǎn)生保守的誤差。
在帶有Iml體積反應(yīng)混合物中的芯片的孔中酶反應(yīng)自己進(jìn)行。通過(guò)移去300 μ 1反 應(yīng)混合物并轉(zhuǎn)移至該平板內(nèi)的另一個(gè)孔在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定340nm處吸光度的變化。如上使 用分光光度計(jì)獲得讀數(shù)。一個(gè)酶活性單位定義為每分鐘催化lymol NADPH形成的酶的量。 所有試驗(yàn)進(jìn)行至少3次，每次使用至少三次重復(fù)的芯片組。陰性對(duì)照包括單獨(dú)的Ni-NTA表 面以及帶有吸附的蛋白質(zhì)，但是失去外源底物的表面。使用吸附His標(biāo)記的重組體對(duì)比不 帶His標(biāo)簽產(chǎn)生的重組體，或者對(duì)比通過(guò)腸激酶裂解去除His標(biāo)簽的重組體的芯片獲得比 較測(cè)量。
為了確定Hi s-HK和Hi s-GPI是否可以順序地起作用，通過(guò)室溫下在黑暗中把 60 μ 1 混合蛋白質(zhì)溶液(50mM MOPS 緩沖液，pH 7. 4 中的 0. 5nM Hi s-HK, 0. 5nM Hi s-GP I)置 于單個(gè)金Ni-NTA表面(IXlcm正方形)上固定蛋白質(zhì)。Ih后，使用5ml MOPS緩沖液溫和地洗滌表面3次。通過(guò)在340nm測(cè)定由于外源甘油3-磷酸脫氫酶的NADH的氧化在室溫下 進(jìn)行HK-GPI順序反應(yīng)測(cè)定。以與HK和GPI分別相似的方式進(jìn)行反應(yīng)，使用在pH 7. 4包含 50mM M0PS、5mM 葡萄糖、ImM ATP、0. 5mM NADH、2mM MgCl2、0. 5U/ml 磷酸果糖激酶、0. 5U/ml 醛縮酶、7U/ml丙糖磷酸異構(gòu)酶、和2U/ml甘油3-磷酸脫氫酶的反應(yīng)混合物。在緊接著各試 驗(yàn)前制備新鮮的NADH和ATP的儲(chǔ)存液。一個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)活性單位定義為每分鐘催化1 μ mol NAD+形成的酶的量。所有試驗(yàn)進(jìn)行至少3次，每次使用至少三次重復(fù)的芯片組。陰性對(duì)照 包括單獨(dú)的Ni-NTA表面、帶有兩種吸附的蛋白質(zhì)但是失去外源底物、或者His-HK和途徑試 劑、或者His-GPI和途徑試劑的表面。使用吸附His標(biāo)記的重組體對(duì)比通過(guò)腸激酶裂解去 除His標(biāo)簽的重組體的芯片獲得比較測(cè)量。
實(shí)施例7——在單一裝置中His-HK和His-GPI的順序反應(yīng)
接下來(lái)以若干不同的摩爾比混合重組體His-HK和His-GPI并把它們附著到單個(gè) M-NTA涂布的表面。這兩種酶是糖酵解的最初兩個(gè)步驟。徹底漂洗后，測(cè)試了拴住的重組 體蛋白質(zhì)的連續(xù)的酶活性，而且人們發(fā)現(xiàn)這兩種酶實(shí)際上順序地起作用，把葡萄糖代謝成 為果糖6-磷酸(圖10)。對(duì)照包括利用偶聯(lián)反應(yīng)途徑的全部試劑吸附單獨(dú)的His-HK，以及 利用偶聯(lián)反應(yīng)途徑的全部試劑，和利用單獨(dú)的緩沖液吸附單獨(dú)的His-GPI。所有的對(duì)照產(chǎn)生 相等的基準(zhǔn)讀數(shù)(圖10)，證實(shí)吸光度的變化由拴住的酶的活性產(chǎn)生。在使用的偶聯(lián)反應(yīng)途 徑下只有這兩種酶一起才顯示活性。這證明反應(yīng)緩沖液和其單個(gè)組分沒(méi)有被任何一種酶污 染，也沒(méi)有被在有任何一種酶的情況下可以引起吸光度變化的其它化學(xué)制品污染。
雖然在此已經(jīng)描述和詳細(xì)描寫了優(yōu)選實(shí)施方案，對(duì)于相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員明 顯地，可以產(chǎn)生多種改變、添加、替換等而不背離本發(fā)明的精神并且這些因此被認(rèn)為是在如 隨后的權(quán)利要求
中限定的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種用于產(chǎn)生三磷酸腺苷的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括支持物和能夠共同從葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生三磷酸腺苷的一種或更多種酶，其中所述一種或更多種酶偶聯(lián)到所述支持物。
2.權(quán)利要求
1的系統(tǒng)，其中所述支持物包括復(fù)數(shù)的分離的表面，不同組的復(fù)數(shù)的酶附 著到該分離的表面。
3.權(quán)利要求
2的系統(tǒng)，其中附著到單個(gè)表面的不同酶各自通過(guò)不同的偶聯(lián)化學(xué)作用附
4.權(quán)利要求
1的系統(tǒng)，其中所述一種或更多種酶是己糖激酶、葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶、 6-磷酸果糖激酶、醛縮酶、丙糖_磷酸_異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶、磷酸甘油酸激 酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶和丙酮酸激酶。
5.權(quán)利要求
4的系統(tǒng)，其中復(fù)數(shù)的酶以選擇的位置連續(xù)地偶聯(lián)到支持物上以連續(xù)地進(jìn) 行從葡萄糖或果糖代謝生產(chǎn)三磷酸腺苷的步驟。
6.權(quán)利要求
1的系統(tǒng)，進(jìn)一步包括在適合轉(zhuǎn)變丙酮酸鹽為乳酸鹽的位置偶聯(lián)到該支持物的乳酸脫氫酶。
7.權(quán)利要求
1的系統(tǒng)，其中所述一種或更多種酶通過(guò)用能夠使所述一種或更多種酶靶 向該支持物的結(jié)構(gòu)域替代所述一種或更多種酶的靶向/支架結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)到該支持物。
8.權(quán)利要求
7的系統(tǒng)，其中用組氨酸標(biāo)簽替代所述一種或更多種酶的靶向/支架結(jié)構(gòu) 域并且該支持物具有與組氨酸標(biāo)簽結(jié)合的連接劑和/或用GST融合標(biāo)簽替代所述一種或更 多種酶的所述靶向/支架結(jié)構(gòu)域并且該支持物具有與GST融合標(biāo)簽結(jié)合的連接劑。
9.權(quán)利要求
8的系統(tǒng)，其中該連接劑是次氮基三乙酸鎳或谷胱甘肽。
10.權(quán)利要求
1的系統(tǒng)，其中該支持物被聚乙二醇或金涂布。
11.一種用于進(jìn)行包括三磷酸腺苷到二磷酸腺苷的轉(zhuǎn)變的反應(yīng)的裝置，所述裝置包括用于產(chǎn)生三磷酸腺苷的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括 支持物和能夠共同從葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生三磷酸腺苷的一種或更多種酶，其中所述一種或更 多種酶偶聯(lián)到所述支持物和與所述系統(tǒng)相關(guān)并且能夠把三磷酸腺苷轉(zhuǎn)變?yōu)槎姿嵯佘蘸瓦M(jìn)行該反應(yīng)的部件。
12.權(quán)利要求
11的裝置，進(jìn)一步包括 圍繞所述系統(tǒng)和所述部件的包封試劑。
13.權(quán)利要求
12的裝置，其中該包封試劑選自脂質(zhì)體、硅橡膠植入物和特氟隆植入物。
14.權(quán)利要求
12的裝置，進(jìn)一步包括以下之一或兩者定位于包封試劑中把葡萄糖或果糖運(yùn)送至偶聯(lián)到該支持物的酶的溶質(zhì)載體家族2轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白或葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；和/或定位于包封試劑中從所述裝置轉(zhuǎn)運(yùn)丙酮酸鹽和/或乳酸鹽的單羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
15.權(quán)利要求
12的裝置，進(jìn)一步包括 包封試劑中底物的進(jìn)口和包封試劑中作為與該裝置相關(guān)的酶活性的結(jié)果從底物生產(chǎn)的反應(yīng)產(chǎn)物的出口，其中該活性需要三磷酸腺苷到二磷酸腺苷的轉(zhuǎn)變。
16.權(quán)利要求
15的裝置，其中該進(jìn)口和出口獨(dú)立地選自通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和孔。
17.權(quán)利要求
15的裝置，進(jìn)一步包括 定位在支持物上使底物磷酸化的酶。
18.權(quán)利要求
12的裝置，進(jìn)一步包括包封試劑中的三磷酸腺苷結(jié)合盒家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的成員，其中該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與三磷酸腺苷 相互作用以從該裝置釋放試劑。
19.權(quán)利要求
11的裝置，其中所述一種或更多種酶是己糖激酶、葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶、 6-磷酸果糖激酶、醛縮酶、丙糖_磷酸_異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶、磷酸甘油酸激 酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶和丙酮酸激酶。
20.權(quán)利要求
19的裝置，其中復(fù)數(shù)的酶以選擇的位置連續(xù)地偶聯(lián)到支持物上以連續(xù)地 進(jìn)行從葡萄糖或果糖代謝生產(chǎn)三磷酸腺苷的步驟。
21.權(quán)利要求
11的裝置，進(jìn)一步包括在適合轉(zhuǎn)變丙酮酸鹽為乳酸鹽的位置偶聯(lián)到該支持物的乳酸脫氫酶。
22.權(quán)利要求
11的裝置，其中所述與所述系統(tǒng)相關(guān)的部件進(jìn)行生物化學(xué)或生物學(xué)反應(yīng)。
23.一種用于進(jìn)行包括三磷酸腺苷到二磷酸腺苷的轉(zhuǎn)變的反應(yīng)的方法，所述方法包括提供用于從葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生三磷酸腺苷的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括 支持物和能夠共同從葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生三磷酸腺苷的一種或更多種酶，其中所述一種或更 多種酶偶聯(lián)到所述支持物；在從葡萄糖或果糖代謝有效產(chǎn)生三磷酸腺苷的條件下使該系統(tǒng)與葡萄糖或果糖接觸；和把三磷酸腺苷轉(zhuǎn)變?yōu)槎姿嵯佘詹⑶疫M(jìn)行該反應(yīng)。
24.權(quán)利要求
23的方法，進(jìn)一步包括 把葡萄糖或果糖運(yùn)送至該系統(tǒng)。
25.權(quán)利要求
23的方法，進(jìn)一步包括 從該系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)丙酮酸鹽和/或乳酸鹽。
26.權(quán)利要求
23的方法，進(jìn)一步包括 運(yùn)送底物至該支持物和從該支持物移去作為三磷酸腺苷到二磷酸腺苷轉(zhuǎn)變的結(jié)果從該底物生產(chǎn)的反應(yīng)產(chǎn)物。
27.權(quán)利要求
26的方法，其中該反應(yīng)產(chǎn)物是由定位到該支持物上以使底物磷酸化的酶 產(chǎn)生的磷酸化形式的底物。
28.權(quán)利要求
23的方法，進(jìn)一步包括作為三磷酸腺苷與三磷酸腺苷結(jié)合盒家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的成員相互作用的結(jié)果從該裝置 釋放試劑。
29.權(quán)利要求
23的方法，其中所述一種或更多種酶是己糖激酶、葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶、 6-磷酸果糖激酶、醛縮酶、丙糖_磷酸_異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶和丙酮酸激酶。
30.權(quán)利要求
29的方法，其中復(fù)數(shù)的酶以選擇的位置連續(xù)地偶聯(lián)到支持物上以連續(xù)地 進(jìn)行從葡萄糖或果糖代謝生產(chǎn)三磷酸腺苷的步驟。
31.權(quán)利要求
23的方法，進(jìn)一步包括用偶聯(lián)到該支持物的乳酸脫氫酶把丙酮酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗猁}。
32.權(quán)利要求
23的方法，其中所述一種或更多種酶通過(guò)用能夠使所述一種或更多種酶 靶向該支持物的結(jié)構(gòu)域替代所述一種或更多種酶的靶向/支架結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)到該支持物。
33.權(quán)利要求
32的方法，其中用組氨酸標(biāo)簽替代所述一種或更多種酶的靶向/支架結(jié) 構(gòu)域并且該支持物具有與組氨酸標(biāo)簽結(jié)合的連接劑和/或用GST融合標(biāo)簽替代所述一種或 更多種酶并且該支持物具有與GST融合標(biāo)簽結(jié)合的連接劑。
34.權(quán)利要求
33的方法，其中該連接劑是次氮基三乙酸鎳或谷胱甘肽。
35.權(quán)利要求
23的方法，其中該支持物被聚乙二醇或金涂布。
36.權(quán)利要求
23的方法，其中該系統(tǒng)最初由NAD+、ADP和/或ATP啟動(dòng)。
37.權(quán)利要求
23的方法，其中所述反應(yīng)跨膜移動(dòng)氫以產(chǎn)生電。
38.權(quán)利要求
37的方法，進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)換三磷酸腺苷中的能量來(lái)為外部電路提供動(dòng)力。
39.權(quán)利要求
23的方法，其中所述反應(yīng)產(chǎn)生氫，所述方法進(jìn)一步包括 使用該氫來(lái)促進(jìn)跨膜運(yùn)輸。
40.一種用于產(chǎn)生三磷酸腺苷的方法，所述方法包括提供用于從葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生三磷酸腺苷的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括 支持物和能夠共同從葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生三磷酸腺苷的一種或更多種酶，其中所述一種或更 多種酶偶聯(lián)到所述支持物；和在從葡萄糖或果糖代謝有效產(chǎn)生三磷酸腺苷的條件下使該系統(tǒng)與葡萄糖或果糖接觸。
專利摘要
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生ATP的系統(tǒng)。該系統(tǒng)由支持物和偶聯(lián)到支持物的能夠共同從葡萄糖或果糖代謝產(chǎn)生ATP的一種或更多種酶組成。本發(fā)明另外涉及一種裝置，其包括該系統(tǒng)，以及一種使用該系統(tǒng)進(jìn)行包含ATP到ADP的轉(zhuǎn)變的反應(yīng)的方法。
文檔編號(hào)C12P19/30GKCN101889094SQ200880119760
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2008年10月16日
發(fā)明者A·特拉維斯 申請(qǐng)人:康乃爾研究基金會(huì)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan