專利名稱:一種基于分區(qū)的血管化脂肪組織及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別是涉及一種基于分區(qū)的血管化脂肪組織及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
每年全世界有數(shù)百萬例患者，因為創(chuàng)傷、腫瘤切除術(shù)和先天性缺陷導致的軟組織和乳房缺損，需要通過手術(shù)進行修復重建，其中由于乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高達10% 15%，并且還呈逐年上升和年輕化的趨勢，腫瘤切除造成的軟組織和乳房缺損數(shù)量最多。據(jù)美國矯形外科醫(yī)師協(xié)會報道，2004年全世界有超過500萬人實行了乳房重建手術(shù)，其中有400萬是由于腫瘤切除。。
一般認為，理想的乳房填充材料應該與乳腺組織有相似的柔軟性、相同的滲透壓、穩(wěn)定的理化性能、良好的生物相容性、不致癌、不致敏、不致畸、不鈣化等。目前較普遍使用的乳房填充及再造材料包括醫(yī)用材料和自體移植物兩大類。醫(yī)用材料又包括硅膠、聚丙烯酰胺凝膠、三酰甘油(甘油三酯)、透明質(zhì)酸等植入型假體和液體石蠟、凡士林等注射用混合物。目前的研究表明使用這些材料易出現(xiàn)假體破裂或滲漏、炎癥反應、肉芽腫、包膜攣縮、假體移位、感染、蒙道爾病等并發(fā)癥，安全性受到很大的質(zhì)疑。以硅膠假體為例，1992年美國 食品與藥物管理局禁止了所有硅膠假體的使用。
自體移植物包括注射型自體脂肪顆粒、真皮-脂肪游離組織和帶蒂真皮-脂肪瓣等。針對小范圍及小體積的缺損，自體脂肪游離移植是目前臨床經(jīng)常使用的一種方案，其中注射型自體脂肪顆粒多來源于自體脂肪組織的抽提。此方法的優(yōu)點是生物相容性好，組織來源豐富、易于塑形、不會引起免疫排異等反應；缺點是由于注入到乳房內(nèi)的脂肪顆粒不能很好地建立起血液供應系統(tǒng)，當大量脂肪堆集在一起，會因供血不足導致脂肪細胞壞死、溶解、吸收，極易引發(fā)感染、血腫、變形、疼痛、硬結(jié)、囊腫、壞死等后遺癥。研究發(fā)現(xiàn)約有50% 60%的脂肪顆粒被吸收，存活下來的組織也逐漸被纖維化或鈣化，效果不持久，常需要多次注射維持形狀。
針對大體積的軟組織缺損，尤其是乳房腫瘤切除術(shù)后的修復，目前多采用轉(zhuǎn)移下腹部皮瓣的手術(shù)治療方案，通過顯微外科血管吻合技術(shù)移植游離的肌皮瓣以達到隆乳目的，其外形逼真、質(zhì)地好、易于塑形，血運系統(tǒng)良好，但給供區(qū)不可避免地造成創(chuàng)傷和瘢痕，引起功能障礙，如局部肌肉神經(jīng)萎縮、腹部軟弱和形成腹壁疝等，而且移植后吸收明顯，效果不能持久，尤其是當帶蒂組織移植體的蒂部扭轉(zhuǎn)或受壓時可出現(xiàn)移植組織壞死等不良反應。患者常常難以接受此辦法，移植物供體受到相應的限制。
目前，應用組織工程學原理來構(gòu)建脂肪組織已成為組織工程研究領(lǐng)域的熱點之
O
在種子細胞研究方面，由于成體脂肪細胞(個大、壁薄、內(nèi)有脂肪顆粒)的不增殖性和易受損傷性，人們將興趣越來越多的轉(zhuǎn)向具有特定分化潛能，良好自我更新和擴增能力的干細胞。脂肪干細胞(adipose derived adult stem cells)已被證實能向脂肪細胞、軟骨細胞、心肌細胞，神經(jīng)細胞及成骨細胞等多個方向定向轉(zhuǎn)化。而自體脂肪干細胞具有可供取材的脂肪組織來源豐富，抽取方便，可反復獲得，操作損傷小，無免疫排異反應，細胞容易培養(yǎng)，增殖速度很快等優(yōu)點，已被越來越多的人所接受。前脂肪細胞是一種類成纖維細胞，能夠增殖并特異性向脂肪細胞分化，可從經(jīng)酶消化的脂肪組織或皮下脂肪抽吸物中分離而來，對外界機械損傷的抵抗力較強。用普通的細胞培養(yǎng)方法就可以生長，并能夠在體外擴增及分化，目前脂肪組織工程的研究也主要集中在脂肪干細胞和前脂肪細胞。
在支架材料方面，脂肪族聚酯類生物降解高分子中的聚乙醇酸(polyglyclicaicd)、聚乳酸(polylactic acid)及兩者的共聚物(polylacticacid/polyglyclic aicdcopolymers)、膠原等已用于動物實驗。Patrick等將前脂肪細胞接種到PLGA支架后證明可生成脂肪組織。但存在的問題是一方面常用的合成高分子材料相對于乳房組織顯得太硬，另一方面復合細胞的可降解高分子材料同樣會被機體吸收，難以長期保持穩(wěn)定。Patrick等報道的復合前脂肪細胞的PLGA結(jié)構(gòu)體在體內(nèi)5個月被徹底吸收。膠原水凝膠/細胞復合體則在3周內(nèi)體積降解到原來的30%。也有人對藻酸鹽及透明質(zhì)酸凝膠進行過研究,Mooney和其同事用RGD(arginine-glycine-aspartic acid,三種氨基酸組成的細胞識別肽段)制 成藻酸鹽，并將其注入大鼠模型體內(nèi)，觀察脂肪組織的增長、生物相容性等，效果仍不容樂觀。同注射型脂肪顆粒一樣，材料/細胞被降解、吸收，三維結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的主要因素仍然是血液供應不足。
綜上所述，用自體組織或細胞移植治療軟組織缺損的方法有其先天不可克服的問題，主要是吸收和供給區(qū)創(chuàng)傷等；而用組織工程的方法修復脂肪或乳房缺損雖然是目前的研究熱點，但還未取得突破性的進展，主要問題是由于供血不足引起的基質(zhì)材料的降解和吸收。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于分區(qū)的血管化脂肪組織及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明的另一目的是提供構(gòu)建血管化脂肪組織的過程中的設(shè)備。
本發(fā)明所述的基于分區(qū)的血管化脂肪組織是模仿天然脂肪組織的結(jié)構(gòu)，將脂肪組織包裹在微囊中，與血管組織實現(xiàn)分區(qū)。
本發(fā)明所述的基于分區(qū)的血管化脂肪組織的構(gòu)建方法為
I)脂肪區(qū)的構(gòu)建提取脂肪干細胞，將脂肪干細胞先制成干細胞微膠囊，然后將脂肪干細胞誘導培養(yǎng)成脂肪細胞，得到材料包裹的高濃度脂肪細胞團簇；
2)血管成分的制備i)將脂肪干細胞分別誘導成平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞；ii)將血管化生長因子制成生長因子緩釋微球；
3)血管化脂肪組織的構(gòu)建i)將生長因子緩釋微球、脂肪細胞囊與基質(zhì)材料混合，作為主體材料，將平滑肌細胞作為通道材料，構(gòu)建有貫通通道的三維結(jié)構(gòu)體；ii)將三維結(jié)構(gòu)體進行脈動體外培養(yǎng)，并以內(nèi)皮細胞的懸液灌流，使內(nèi)皮細胞附著在通道的內(nèi)壁，形成外壁為平滑肌細胞、內(nèi)壁為內(nèi)皮細胞的血管組織；iii)將三維結(jié)構(gòu)體繼續(xù)進行脈動體外培養(yǎng)，生長因子緩釋微球逐漸釋放出血管化生長因子以促進毛細血管的生長，得到產(chǎn)生毛細血管的血管化脂肪組織。
其中，步驟I)所述提取脂肪細胞可采用手術(shù)或脂肪抽吸術(shù)等本領(lǐng)域公知技術(shù)進行；所述將脂肪干細胞制成干細胞微膠囊如下進行將脂肪干細胞與海藻酸鈉基水凝膠材料混合后滴入固化液中，制成干細胞微膠囊；同樣，步驟2)中所述的將血管化生長因子制成生長因子緩釋微球也可以類似進行將血管化生長因子與海藻酸鈉混合后滴入固化液中制成。
其中海藻酸鈉基水凝膠材料可以是海藻酸鈉、海藻酸鈉/膠原、海藻酸鈉/明膠中的一種；所述固化液為含二價陽離子的鹽溶液，如氯化鈣、氯化鋇等，優(yōu)選氯化鈣溶液。
所述海藻酸鈉基水凝膠材料的使用濃度為O. 1_10%，其中明膠或膠原的濃度為O. 01-5%，氯化鈣溶液優(yōu)選為lOOmM。
所述干細胞微膠囊的粒徑為100 μ m 500 μ m ;所述生長因子緩釋微球的粒徑為20 μ m 50 μ m0
所述血管化生長因子為血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF,Epidermal GrowthFactor)、血小板衍生生長因子(F1DGF)、轉(zhuǎn)化·生長因子(TGF-β I)和血管生成素(angiopoietin-1)等血管相關(guān)生長因子。
特別的，可采用非接觸式高壓靜電發(fā)生法來制備干細胞微膠囊和生長因子緩釋微球，所述非接觸式高壓靜電發(fā)生法制備微膠囊或微球的原理圖見圖I。其實質(zhì)是以靜電力作用于微滴，抵抗液體的表面張力作用，將液體離散成球形液滴，可以通過改變電壓、推進速度及反應時間來調(diào)節(jié)微囊的直徑和通透性。
基于以上原理，本發(fā)明還提供一種非接觸式高壓靜電收集器，包括
高壓靜電發(fā)生裝置提供高壓電場，施加電場力于正極的成囊液，使其呈球狀滴入負極的固化液中；
液體推進裝置將成囊液推入所述高壓電場的正極；以及
收集裝置置于負極的固化液將球狀液滴固化，收集固化的液滴。
其中收集裝置(見圖2)可由前面板可拆卸、上方板開通孔的盒體4，在通孔上設(shè)置的位于盒體外部的可拆卸套筒I和同軸套筒2，所述同軸套筒2上設(shè)置有電源正極接口，設(shè)置在盒體4內(nèi)部的與同軸套筒2相對的負極基座3 (連接電源負極)，以及置于負極基座3的固化液構(gòu)成。同軸套筒2可放置針頭，可拆卸套筒I固定成囊液輸送管，并輔助調(diào)整針頭高度并確保針頭與固化液的液面垂直。使用時，高壓靜電發(fā)生裝置的正極和負極分別連接在可拆卸套筒I和負極基座3上，負極基座3上放置盛有固化液的培養(yǎng)皿；將成囊液體置于推進裝置中，通過管道推到針頭，在電場力和重力的雙重作用下，克服液體的黏滯力和表面張力，形成極小的圓球狀液滴，球狀液滴落入固化液中固化成微膠珠。
該非接觸式高壓靜電收集器可廣泛用于各種細胞、生長因子的微膠囊化以制備微膠囊，載體材料主要是海藻酸鈉基的生物材料，也可用于制備海藻酸鈉基的生物材料微球，不限于本發(fā)明提出的用途。
本發(fā)明所述的高壓靜電發(fā)生裝置可采用SA167-Y(天津)高壓電場發(fā)生器，輸出電壓O 40kV ;成囊液推進裝置可采用LongerPump公司TS2-60型注射泵,推進速度O 90ml/min,可米用I 60mL注射器。
本發(fā)明所述的將脂肪干細胞誘導成脂肪細胞，平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞是本領(lǐng)域公知的方法，將脂肪干細胞在相應的誘導劑的作用下進行培養(yǎng)，成脂誘導劑有多種組成，如高糖 DMEM, 10%胎牛血清,O. Smmol /I, IBMX, I μ mol/L 地塞米松，10 μ mol/L 膜島素，I %青鏈霉素原液等；將脂肪干細胞誘導成內(nèi)皮細胞的內(nèi)皮誘導劑也有多種組成，如低糖DMHM，2% 胎牛血清，2% 馬血清，10ng/mL VEGF, 2ng/mLbFGF (R&D 系統(tǒng))，I X ITS (Sigma)，O. 61g/L尼克酰胺，0. I μ mol/L地塞米松，2g/L BSA, O. lg/L鳥氨酸，O. 03g/L脯氨酸，O. 73g/L谷氨酰胺，lg/L葡萄糖，2g/L半乳糖及適量微量元素(氯化鋅、硫酸鋅和氯化錳)等；將脂肪干細胞誘導成內(nèi)皮細胞的平滑肌誘導劑也有多種組成，例如含5ng/mL TGF-β I和50ng/mLPDGF-BB 的 M-199 誘導液。
本發(fā)明所述的基質(zhì)材料是明膠，海藻酸鈉，膠原，纖維蛋白原中的一種或多種。
所述步驟3)的步驟i)的構(gòu)建可采用鑄模法或擠出法進行，所述擠出法優(yōu)選采用三維受控組裝設(shè)備進行，具體的說，可采用下述一種方式進行
a)鑄模法采用溶芯技術(shù)(專利公開號CN1654028)制備內(nèi)部貫通的二級血管支架,第一級模擬小血管的生物學結(jié)構(gòu)，內(nèi)徑為ΙΟΟΟμ 300μπι，第二級結(jié)構(gòu)模擬微血管，內(nèi)徑為300μπ ΙΟΟμπ ，進行體外脈動培養(yǎng)，循環(huán)液為平滑肌細胞懸液，使平滑肌細胞均 勻附著在血管支架通道內(nèi)形成多層平滑肌細胞；將脂肪細胞微膠囊、生長因子微球與基質(zhì)均勻混合，采用鑄模后凝膠化的方法成型三維結(jié)構(gòu)體；然后將已形成平滑肌細胞層的分級血管支架定位組裝在三維結(jié)構(gòu)體中，構(gòu)建出具有貫通通道的三維結(jié)構(gòu)體；
b)將生長因子緩釋微球、脂肪細胞微膠囊和離散的平滑肌細胞與基質(zhì)材料均勻混合，降溫凝膠化；通過計算機對體外再造的脂肪組織進行材料建模和結(jié)構(gòu)建模，用單噴頭三維成型機(專利公開號CN1257762)在計算機的控制下將生長因子緩釋微球、脂肪細胞微膠囊、離散平滑肌細胞與基質(zhì)材料混合體以層層疊加的方式擠出堆積成形，小血管和微血管的通道在成形時自然形成；
c)將生長因子緩釋微球和脂肪細胞微膠囊與基質(zhì)材料均勻混合，并降溫凝膠化；將離散平滑肌細胞與基質(zhì)材料混合并降溫凝膠化。通過計算機對體外再造的脂肪組織進行材料建模和結(jié)構(gòu)建模，用第二代雙噴頭細胞組裝機(專利公開號CN1820791)在計算機的控制下分別將生長因子緩釋微球/脂肪細胞微膠囊/基質(zhì)材料混合體和平滑肌細胞/基質(zhì)材料混合體以層層疊加的方式擠出堆積成形；平滑肌細胞/基質(zhì)材料混合體構(gòu)成分級血管結(jié)構(gòu)通道管壁，生長因子緩釋微球/脂肪細胞微膠囊/基質(zhì)材料混合體構(gòu)成結(jié)構(gòu)體的主體部分，形成具有多層平滑肌細胞管道結(jié)構(gòu)的類脂肪組織，小血管和微血管的通道在成形時自然形成。
在構(gòu)建過程中，生長因子緩釋微球、脂肪細胞囊和基質(zhì)材料的加入量是本領(lǐng)域人員的公知常識，如對基質(zhì)材料來說，由于不是天然脂肪組織的成分，移植后需要由機體降解，所以在構(gòu)建時，只要加入量能夠滿足成型要求即可；脂肪細胞囊的加入量根據(jù)特定組織的要求而定，如構(gòu)建乳房組織時，脂肪細胞囊和基質(zhì)材料的體積比優(yōu)選2 : I I : 2，平滑肌細胞的加入量為以基質(zhì)材料計IO5個/ml IO7個/ml。
上述構(gòu)建方式中，a)，b)，c)可根據(jù)需要構(gòu)建兩個半球，如圖3所示，然后可將兩個半球按圖3所示的方式組合成整體后進行脈動培養(yǎng)；當然也可以根據(jù)需要構(gòu)建成特定的形狀，然后進行體外脈動培養(yǎng)。
本發(fā)明所述的脈動體外培養(yǎng)采用脈動生物反應器進行，所述脈動反應器主要包括培養(yǎng)液循環(huán)部分和壓力檢測部分；培養(yǎng)液循環(huán)部分為脂肪組織提供循環(huán)培養(yǎng)液；由培養(yǎng)液供應裝置、液體連續(xù)推進裝置和脂肪組織培養(yǎng)裝置相互連接組成，液體連續(xù)推進裝置將源于培養(yǎng)液供應裝置的培養(yǎng)液推入脂肪組織，脂肪組織流出的培養(yǎng)液流回培養(yǎng)液供應裝置，形成循環(huán)；壓力檢測部分是檢測脂肪組織培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)液的壓力的壓力表。
為保證與機體環(huán)境一致，還包括脈動部分液體間歇推進裝置的進液口連接培養(yǎng)液供應裝置，出液口連接脂肪組織培養(yǎng)裝置，推出的液體與循環(huán)培養(yǎng)液一起循環(huán)，為脂肪組織提供培養(yǎng)液的脈動流；間歇式液體推進裝置是上述液體推進裝置的有效補充，提供具有明顯脈動的培養(yǎng)液。如需要，只采用連續(xù)式推進裝置也可以進行培養(yǎng)。
該脈動生物反應器可廣泛用于各種人造組織的體外培養(yǎng)，不限于本發(fā)明提出的用途。簡單的脈動反應器如圖4所示，培養(yǎng)液循環(huán)部分由培養(yǎng)液瓶、蠕動泵和培養(yǎng)盒構(gòu)成，各部分由硅膠管連接，培養(yǎng)液經(jīng)硅膠管由蠕動泵從培養(yǎng)液瓶泵入培養(yǎng)盒(內(nèi)置人造脂肪組織)，然后經(jīng)硅膠管流回培養(yǎng)液瓶；導軌滑塊、注射器和直流電機構(gòu)成脈動部分，直流電機與導軌滑塊連接推動注射器活塞往復運動，注射器與蠕動泵的出液端連接后和培養(yǎng)盒連接，由此形成脈動流；壓力表設(shè)置在培養(yǎng)盒上，檢測置于培養(yǎng)盒內(nèi)的脂肪組織內(nèi)的培養(yǎng)液壓力。本發(fā)明所述的脈動生物反應器可選用工作電壓0-24V，流速0-120ml/min的蠕動泵；選用工作電壓0-12V、轉(zhuǎn)速l-100r/min的直流電機；選用硅膠管作為管路；各部件，如直流電機、導桿、滑塊導軌、注射器采用相應的支架固定在底板上，其電源可選擇能滿足脈動生物反應器蠕動泵和直流電機的需要的0-24V直流電壓的可調(diào)節(jié)電源。
根據(jù)脈動培養(yǎng)要求可在0-24V調(diào)節(jié)蠕動泵工作電壓，線性控制脈動培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的流速在0-120ml/min范圍內(nèi)變化；
在0-12V范圍內(nèi)調(diào)節(jié)直流電機，線性控制脈動培養(yǎng)過程中脈動頻率在0-100次/min的范圍內(nèi)變化。
如上所述，本發(fā)明的具體實施方法有以下三種
實施方法I :其操作流程見圖5。采用抽脂手術(shù)獲得病人自體脂肪干細胞，常規(guī)培養(yǎng)增殖至足夠數(shù)量。取出一部分脂肪干細胞采用非接觸式高壓靜電發(fā)生器(見圖2)制成固態(tài)脂肪干細胞微膠囊，囊芯材料為海藻酸鈉基水凝膠材料，如海藻酸鈉、海藻酸鈉/膠原、海藻酸鈉/明膠等，固化液為氯化鈣溶液。對脂肪干細胞微膠囊進行成脂培養(yǎng)，形成脂肪細胞團簇。
對部分脂肪干細胞進行成內(nèi)皮誘導以形成內(nèi)皮細胞，而部分脂肪干細胞進行成平滑肌細胞誘導，然后分別制備成懸液備用。采用非接觸式高壓靜電發(fā)生器(見圖2)制備血管化生長因子(如bFGF，VEGF等)緩釋微球。
采用溶芯技術(shù)(專利公開號CN1654028)制備兩套內(nèi)部貫通的二級血管支架，如圖3所示。第一級模擬小血管的生物學結(jié)構(gòu)，內(nèi)徑為1000 μ m 300 μ m，第二級結(jié)構(gòu)模擬微血管，內(nèi)徑為300 μ m 100 μ m，用脈動生物反應器進行培養(yǎng)和訓練，循環(huán)液為平滑肌細胞懸液，使平滑肌細胞均勻附著在血管支架通道內(nèi)形成多層平滑肌細胞。
將脂肪細胞微膠囊、生長因子微球與基質(zhì)材料(如明膠、海藻酸鈉、膠原、纖維蛋白原等)均勻混合，采用鑄模后凝膠化的方法成型特定形狀的水凝膠結(jié)構(gòu)體。將已形成平滑肌細胞層的兩套分級血管支架按圖3所示的方式定位組裝在結(jié)構(gòu)體中，并對整體結(jié)構(gòu)脈動培養(yǎng)訓練，循環(huán)液為內(nèi)皮細胞懸液，即在結(jié)構(gòu)體的血管支架最內(nèi)層形成內(nèi)皮細胞層，高度仿生天然脂肪組織和血管的生理結(jié)構(gòu)；繼續(xù)脈動培養(yǎng)，隨著血管化生長因子的緩釋，內(nèi)皮細胞向基質(zhì)材料中的滲入，調(diào)控毛細血管網(wǎng)的發(fā)生，形成具有小血管/微血管/毛細血管網(wǎng)的自體脂肪組織。該方法中，毛細血管網(wǎng)的發(fā)生也可移植到體內(nèi)后進行。
實施方法2 :其操作流程見圖6。采用抽脂手術(shù)獲得病人自體脂肪干細胞，常規(guī)培養(yǎng)增殖至足夠數(shù)量。取出一部分脂肪干細胞采用非接觸式高壓靜電發(fā)生器(見圖2)制成固態(tài)細胞微膠囊，囊芯材料為海藻酸鈉基水凝膠材料，如海藻酸鈉、海藻酸鈉/膠原、海藻酸鈉/明膠等，固化液為氯化鈣溶液。對脂肪干細胞微膠囊進行成脂培養(yǎng)，形成脂肪細胞團簇。
對部分脂肪干細胞進行成內(nèi)皮誘導以形成內(nèi)皮細胞，而部分脂肪干細胞進行成平滑肌細胞誘導。采用非接觸式高壓靜電發(fā)生器(見圖2)制備血管化生長因子(如bFGF，VEGF等)緩釋微球。
將生長因子緩釋微球、脂肪細胞微膠囊和離散的平滑肌細胞與基質(zhì)材料均勻混合后裝入一次性針管并降溫凝膠化。通過計算機對體外再造的脂肪組織進行材料建模和結(jié)構(gòu)建模，將結(jié)構(gòu)體的三維造型模型用STL文件輸出，用單噴頭三維成型機(專利公開號 CN1257762)的計算機對該文件分層解析，在計算機的控制下將生長因子緩釋微球、脂肪細胞微膠囊、離散平滑肌細胞與基質(zhì)材料混合體以層層疊加的方式擠出堆積成形，分別構(gòu)建兩個半球，小血管和微血管的通道在成形時自然形成。
將兩個半球按圖3所示管道方式組合成整體后用脈動反應器培養(yǎng)和訓練，循環(huán)液為內(nèi)皮細胞懸液，即在結(jié)構(gòu)體的血管通道最內(nèi)層形成內(nèi)皮細胞層，高度仿生天然脂肪組織和血管的生理結(jié)構(gòu)。繼續(xù)脈動培養(yǎng)，隨著血管化生長因子的緩釋，內(nèi)皮細胞向基質(zhì)材料中的滲入，可調(diào)控毛細血管網(wǎng)的發(fā)生，即形成具有小血管/微血管/毛細血管網(wǎng)的自體脂肪組織。進行自體移植可進行乳房腫瘤切除術(shù)后的脂肪組織重建。毛細血管網(wǎng)發(fā)生也可在體內(nèi)進行。
實施方法3 :其操作流程見圖7。采用抽脂手術(shù)獲得病人自體脂肪干細胞，常規(guī)培養(yǎng)增殖至足夠數(shù)量。取出一部分脂肪干細胞采用自制非接觸式高壓靜電發(fā)生器(見圖6)制成固態(tài)細胞微膠囊，囊芯材料為海藻酸鈉基水凝膠材料，如海藻酸鈉、海藻酸鈉/膠原、海藻酸鈉/明膠等，固化液為氯化鈣溶液。對脂肪干細胞微膠囊進行成脂培養(yǎng)，形成脂肪細胞團簇。
對部分脂肪干細胞進行成內(nèi)皮誘導以形成內(nèi)皮細胞，而部分脂肪干細胞進行成平滑肌細胞誘導。采用非接觸式高壓靜電發(fā)生器(見圖3)制備血管化生長因子(如bFGF，VEGF等)緩釋微球。
將生長因子緩釋微球和脂肪細胞微膠囊與基質(zhì)材料均勻混合后裝入一次性針管并降溫凝膠化；將離散平滑肌細胞與基質(zhì)材料混合后裝入另一支一次性針管并降溫凝膠化。通過計算機對體外再造的脂肪組織進行材料建模和結(jié)構(gòu)建模，將結(jié)構(gòu)體的三維造型模型用STL文件輸出，用第二代雙噴頭細胞組裝機(專利公開號CN1820791)的計算機對該文件分層解析，在計算機的控制下分別將生長因子緩釋微球/脂肪細胞微膠囊/基質(zhì)材料混合體和平滑肌細胞/基質(zhì)材料混合體從針管中以層層疊加的方式擠出堆積成形。平滑肌細胞/基質(zhì)材料混合體構(gòu)成分級血管結(jié)構(gòu)通道管壁，生長因子緩釋微球/脂肪細胞微膠囊/基質(zhì)材料混合體構(gòu)成結(jié)構(gòu)體的主體部分，形成具有多層平滑肌細胞管道結(jié)構(gòu)的類脂肪組織。小血管和微血管的通道在成形時自然形成，可分別構(gòu)建兩個半球，將兩個半球按圖3所示管道方式組合成整體后用脈動反應器培養(yǎng)和訓練，循環(huán)液為內(nèi)皮細胞懸液，即在結(jié)構(gòu)體的血管通道最內(nèi)層形成內(nèi)皮細胞層，高度仿生天然脂肪組織和血管的生理結(jié)構(gòu)。繼續(xù)脈動培養(yǎng)，隨著血管化生長因子的緩釋，內(nèi)皮細胞向基質(zhì)材料中的滲入，可調(diào)控毛細血管網(wǎng)的發(fā)生，即形成具有小血管/微血管/毛細血管網(wǎng)的自體脂肪組織。進行自體移植可進行乳房腫瘤切除術(shù)后的脂肪組織重建。毛細血管網(wǎng)發(fā)生也可在體內(nèi)進行。
上述方法構(gòu)建的基于分區(qū)的血管化的脂肪組織，能實現(xiàn)尺寸分明的三級結(jié)構(gòu)，每級結(jié)構(gòu)都有其特定的組成、結(jié)構(gòu)和功能。具體如下
I.三級結(jié)構(gòu)，即三維結(jié)構(gòu)體。它由基質(zhì)材料形成的互相交錯的絲狀水凝膠構(gòu)成，具有宏觀通道以便營養(yǎng)和新陳代謝物的交換，并為血管化預留空間。這是最宏觀的一級結(jié) 構(gòu)。
2. 二級結(jié)構(gòu)，即細胞團簇結(jié)構(gòu)。它主要由固態(tài)脂肪干細胞微囊和水凝膠絲狀支撐網(wǎng)架組成，細胞微囊的粒徑和囊內(nèi)細胞濃度可調(diào)，微囊粒徑為IOOym 500μπι之間。支撐網(wǎng)架尺寸為300 μ m 1000 μ m,支撐網(wǎng)架將多個高濃度細胞團組合成三維結(jié)構(gòu)體。
3. 一級結(jié)構(gòu)，即單元結(jié)構(gòu)。它是由基質(zhì)材料微單元、生長因子緩釋系統(tǒng)、離散的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞組成的，尺寸為10 μ m 50 μ m。生長因子緩釋系統(tǒng)用于誘導毛細血管生成，并調(diào)控內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞發(fā)育成為成熟血管組織，基質(zhì)材料微單元在體內(nèi)/外培養(yǎng)時能維持細胞正常的生理功能，并為細胞提供遷移和相互傳遞信息的空間，利于細胞自組裝特性的發(fā)揮。
本發(fā)明是在模擬天然脂肪組織功能和結(jié)構(gòu)特點的基礎(chǔ)上，通過計算機采用相應軟件對體外再造的脂肪組織進行材料建模和結(jié)構(gòu)建模，并在計算機的控制下將脂肪干細胞微膠囊和血管化細胞空間定位組裝成形，構(gòu)建高濃度脂肪細胞簇和管道狀血管和微血管，同時結(jié)合細胞因子時序控制緩釋技術(shù)，誘導毛細血管發(fā)生，以實現(xiàn)體外再造脂肪組織的血管化，構(gòu)建出具有分級血管結(jié)構(gòu)的、特定形狀的、可在體內(nèi)長期穩(wěn)定存在的脂肪組織。
本發(fā)明涉及的構(gòu)建方法通過快速成形技術(shù)能構(gòu)建特殊尺寸的體外組織，滿足治療時病人的個體需求，實現(xiàn)個性化制造；通過血管/微血管分級結(jié)構(gòu)的直接構(gòu)建和毛細血管的誘導生成，能夠解決組織移植后被吸收的問題，為脂肪等軟組織缺損的修復提供了很好的解決方法?；诜謪^(qū)的血管化脂肪組織的構(gòu)建方法結(jié)合了細胞微囊制備技術(shù)、生長因子緩釋技術(shù)、細胞三維組裝技術(shù)以及脈動生物反應器體外培養(yǎng)技術(shù)。細胞微膠囊具有半透膜結(jié)構(gòu)，能在維持細胞正常生命活動的同時為細胞提供免疫隔離保護；具有很高的機械強度，能保護脂肪細胞在基礎(chǔ)和成形的過程中不受損傷；能構(gòu)建局部高濃度細胞簇，形成仿生囊狀結(jié)構(gòu)，對細胞的空間定位進行調(diào)控，同時能實現(xiàn)多種細胞的混合和復合體系，是體外再造組織的基礎(chǔ)。生長因子緩釋系統(tǒng)是調(diào)控細胞生長分化和組織發(fā)育的重要手段。細胞三維受控組裝技術(shù)構(gòu)建的水凝膠結(jié)構(gòu)體將多個高濃度細胞團簇、血管化細胞和生長因子緩釋體系結(jié)合成有機整體，為其提供物理保護和生長、代謝環(huán)境，并能夠根據(jù)實際需求完成個性化制造。血管脈動生物反應器對結(jié)構(gòu)體的體外培養(yǎng)能提供循環(huán)的、脈動培養(yǎng)系統(tǒng)，促進血管化過程。
本發(fā)明的細胞分區(qū)組裝技術(shù)、分級血管構(gòu)建技術(shù)、生長因子緩釋技術(shù)和脈動培養(yǎng)技術(shù)能為體外各種干細胞的生長分化和構(gòu)建其他組織(如肝組織、乳腺組織等)等研究提供模型和平臺。[0063]本發(fā)明提供的非接觸式靜電微膠囊發(fā)生器可成形粒徑可調(diào)、形狀圓潤完整的細胞微膠囊，該裝置創(chuàng)造了很好的無菌環(huán)境，成形過程操作簡便，對細胞損傷小，所成形的微囊強度高、截斷分子量合適，在體外常規(guī)培養(yǎng)條件下可穩(wěn)定維持細胞生長、增殖、分化等功能，能很好避免傳統(tǒng)液態(tài)微膠囊的細胞沉降和中心壞死區(qū)現(xiàn)象。形成固態(tài)脂肪干細胞微囊的生物活性很好，機械強度較高。在細胞受控組裝技術(shù)中引入了固態(tài)細胞微囊結(jié)構(gòu)，能形成濃度可調(diào)的局部細胞團簇，加強細胞之間的信號交流，并可仿生具有囊狀結(jié)構(gòu)的生物體組織。
本發(fā)明提供的脈動生物反應器可模擬生物體內(nèi)血管的生長環(huán)境，通過調(diào)節(jié)參數(shù)模擬生物體內(nèi)對組織生長有影響的力學因素，培養(yǎng)構(gòu)建完成的水凝膠結(jié)構(gòu)體，涂覆形成內(nèi)皮細胞層，促進毛細血管的產(chǎn)生；而且脈動生物反應器能夠在生物力學、循環(huán)系統(tǒng)等各方面滿足體外組織培養(yǎng)的基本要求，起到靜態(tài)培養(yǎng)所不能達到的作用。


圖I非接觸式高壓靜電發(fā)生法原理圖。
·[0066]圖2高壓靜電發(fā)生器收集裝置示意圖；其中I.可拆卸套筒；2.同軸套筒；3.負極銅片基座；4.有機玻璃盒。
圖3血管化脂肪組織結(jié)構(gòu)體構(gòu)建示意圖。
圖4脈動生物反應器結(jié)構(gòu)示意圖；其中a.主視圖；b.俯視圖；1.電壓表；2.底板；3.支柱；4.培養(yǎng)液瓶；5.硅膠導管；6.單向閥；7.培養(yǎng)盒；8.蠕動泵；9.導軌滑塊；10.注射器；11、直流電機。
圖5實施方法I流程圖。
圖6實施方法2流程圖。
圖7實施方法3流程圖。
圖8三維結(jié)構(gòu)體的三級結(jié)構(gòu)的照片。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。如無特別指明，實施例中所用的生長因子和試劑均購自Sigma公司。
實施例I脂肪干細胞的提取和誘導培養(yǎng)
采用抽脂手術(shù)獲得患者的自體脂肪，以磷酸緩沖液沖洗脂肪組織后，然后加入O. 75g/LI型膠原酶，37°C震蕩、消化60min，胎牛血清終止消化。1200r/min離心IOmin,去上清液及懸浮的殘存組織，重懸細胞，加入2倍體積的紅細胞裂解液(NH4Cl 154mmol/L+KHCOgIOmmoI/L+EDTA O. lmmol/L)靜置IOmin,離心、棄上清液。用適量的PBS液清洗3次，200目篩網(wǎng)過濾，得到脂肪組織干細胞。
將所得脂肪組織干細胞接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，加5mL含體積分數(shù)為O. 10胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，混合均勻，置于37°C、體積分數(shù)為O. 05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)特征及增殖情況，36 48h后首次換液，以后每72h換液I次。待細胞融合至超過培養(yǎng)瓶底80%時，常規(guī)胰酶消化傳代。常規(guī)培養(yǎng)增殖至足夠數(shù)量。
取生長至融合期的脂肪干細胞，采用海藻酸鈉/膠原體系作為成囊材料，用非接觸式高壓靜電發(fā)生器(見圖2)制成固態(tài)細胞微膠囊[0078]I.用磷酸緩沖液溶解海藻酸鈉，用2%的乙酸溶解膠原制成溶液。將兩者混合為海藻酸鈉和膠原最終濃度分別為2% (w/w)和O. 35% (w/w)的溶液并ImM的NaOH溶液調(diào)整PH值至7. 2左右。
2.將脂肪干細胞以IO5個/ml的密度與成囊溶液均勻混合后裝入容積為IOml的
一次性針管。
3.連接非接觸式高壓靜電微囊發(fā)生器，本設(shè)備的高壓靜電發(fā)生裝置采用SA167-Y(天津)高壓電場發(fā)生器，輸出電壓IOkV ;成囊液推進裝置采用LongerPump公司TS2-60型注射泵，推進速度10ml/h，采用IOmL注射器，針尖與銅片間距離為30mm，推進速度為10ml/h，采用內(nèi)徑為191 μ m的針頭，收集器為直徑60mm的玻璃培養(yǎng)皿，固化液為100mmol/L氯化|丐溶液。4.在5分鐘內(nèi)收集細胞膠囊，用生理鹽水洗滌兩次后觀察記錄，細胞膠囊形狀圓整光滑，粒徑為150 μ m。
用成脂培養(yǎng)液(高糖DMEM，10%胎牛血清，0. 5mmol/L IBMX, I μ mol/L地塞米松，10 μ mol/L胰島素，I %青鏈霉素原液)在37°C體積分數(shù)為0. 05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)脂肪組織干細胞膠囊約10天，得到脂肪細胞囊。
采用非接觸式高壓靜電發(fā)生器(見圖2)制備血管化生長因子(bFGF和VEGF)緩釋微球。
I.將海藻酸鈉用PBS緩沖溶液配置成I. 5% (w/w)的溶液。
2.將bFGF和VEGF以IO5個/ml的濃度與成囊溶液均勻混合后裝入容積為IOml的一次性針管。
3.連接非接觸式高壓靜電微囊發(fā)生器，工作電壓7kV，針尖與銅片間距離為20mm，推進速度為30ml/h，采用內(nèi)徑為191 μ m的針頭，收集器為直徑60mm的玻璃培養(yǎng)皿，固化液為100mmol/L氯化鋇溶液。
4.在5分鐘內(nèi)收集細胞膠囊，用生理鹽水洗滌兩次后觀察記錄，生長因子緩釋微球的形狀圓整光滑，粒徑為250 μ m。
取常規(guī)培養(yǎng)的脂肪干細胞進行成內(nèi)皮誘導以形成內(nèi)皮細胞(用含2%胎牛血清，2%馬血清，10ng/mL VEGF, 2ng/mL bFGF，I X ITS，0. 61g/L尼克酰胺，0. I μ mol/L地塞米松，2g/L BSA, 0. lg/L鳥氨酸，0. 03g/L脯氨酸，0. 73g/L谷氨酰胺，lg/L葡萄糖，2g/L半乳糖及適量微量元素(氯化鋅、硫酸鋅和氯化錳等)的低糖DMEM置于37°C、體積分數(shù)為0. 05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10天，然后用培養(yǎng)所用的低糖DMEM培養(yǎng)液配置成濃度為IO6個/ml的懸液備用。
取常規(guī)培養(yǎng)的脂肪干細胞進行成平滑肌細胞誘導(含5ng/mLTGF_i3 I和50ng/mLPDGF-BB的M-199誘導液置于37°C、體積分數(shù)為0. 05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10天。然后用所用的M-199誘導液配置成濃度為IO6個/ml的懸液備用。
實施例2
采用溶芯技術(shù)(專利公開號1654028)制備兩套內(nèi)部貫通的二級血管支架，如圖3所示。第一級模擬小血管的生物學結(jié)構(gòu)，內(nèi)徑為1000 μ m，第二級結(jié)構(gòu)模擬微血管，內(nèi)徑為300 μ m，用脈動生物反應器進行培養(yǎng)和訓練，每天2小時，持續(xù)一周，循環(huán)液為IO6個/ml平滑肌細胞懸液(溶劑為對應的細胞培養(yǎng)液)，使平滑肌細胞均勻附著在血管支架通道內(nèi)形成多層平滑肌細胞。
將實施例I制備的脂肪干細胞微膠囊和生長因子緩釋微球與明膠在常溫下，以體積比10 I 5均勻混合，鑄模成直徑為2cm的半球，然后降溫凝膠化；將已形成平滑肌細胞層的兩套分級血管支架按圖3所示的方式定位組裝在結(jié)構(gòu)體中，并對整體結(jié)構(gòu)脈動培養(yǎng)訓練，每天2小時，持續(xù)一周，循環(huán)液為濃度為IO6個/ml的內(nèi)皮細胞懸液(溶劑為對應細胞的培養(yǎng)液)，在結(jié)構(gòu)體的血管支架最內(nèi)層形成內(nèi)皮細胞層；繼續(xù)脈動培養(yǎng)一個月，隨著血管化生長因子的緩釋，內(nèi)皮細胞向基質(zhì)材料中的滲入，調(diào)控毛細血管網(wǎng)的發(fā)生，形成具有小血管/微血管/毛細血管網(wǎng)的自體脂肪組織。
實施例3
取常規(guī)培養(yǎng)的脂肪干細胞采用海藻酸鈉/明膠體系作為成囊材料，用非接觸式高壓靜電發(fā)生器(見圖2)制成固態(tài)細胞微膠囊I.將海藻酸鈉的溶液和明膠溶液(溶劑PBS緩沖溶液)混合為最終濃度分別為1.8% (w/w)和 3% (w/w)的溶液。
2.將脂肪干細胞以IO6個/ml的密度與成囊溶液均勻混合后裝入容積為IOml的
一次性針管。
3.連接非接觸式高壓靜電微囊發(fā)生器，本設(shè)備的高壓靜電發(fā)生裝置可采用SA167-Y (天津)高壓電場發(fā)生器，輸出電壓IOkV ;成囊液推進裝置可采用LongerPump公司TS2-60型注射泵，采用5mL注射器，針尖與銅片間距離為10mm，推進速度為10ml/h，采用內(nèi)徑為191 μ m的針頭，收集器為直徑60mm的玻璃培養(yǎng)皿，固化液為lOOmmol/L氯化鈣溶液。
4.在5分鐘內(nèi)收集細胞膠囊，用生理鹽水洗滌兩次后觀察記錄，細胞膠囊形狀圓整光滑，粒徑為300 μ m。
采用成脂培養(yǎng)液(高糖DMEM，10%胎牛血清，0. 5mmol/L IBMX, I μ mol/L地塞米松，10 μ mol/L胰島素，I %青鏈霉素原液)于37°C、體積分數(shù)為0. 05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)干細胞微膠囊培養(yǎng)約10天，得到脂肪細胞囊。
采用非接觸式高壓靜電發(fā)生器(見圖2)制備血管化生長因子(bFGF、VEGF和VCAM-1)緩釋微球。
I.用PBS緩沖溶液制備濃度為0. 5% (w/w)海藻酸鈉溶液。
2.將bFGF、VEGF和VCAM-1分別以2ng/mL和10ng/mL密度與成囊溶液均勻混合后裝入容積為IOml的一次性針管。
3.連接非接觸式高壓靜電微囊發(fā)生器，工作電壓8kV，針尖與銅片間距離為20mm，推進速度為10ml/h，采用內(nèi)徑為191 μ m的針頭，收集器為直徑60mm的玻璃培養(yǎng)皿，固化液為100mmol/L氯化|丐溶液。
4.在5分鐘內(nèi)收集細胞膠囊，用生理鹽水洗滌兩次后觀察記錄，生長因子緩釋微球的形狀圓整光滑，粒徑為50 μ m。
取常規(guī)培養(yǎng)的脂肪干細胞進行成內(nèi)皮誘導以形成內(nèi)皮細胞，另取部分脂肪干細胞進行成平滑肌細胞誘導(培養(yǎng)條件和過程與實例I相同)。
將制備的生長因子緩釋微球、脂肪細胞微膠囊和海藻酸鈉在常溫下以體積比I 10 5，平滑肌細胞在整體中的濃度為IO6個/ml，均勻混合后裝入500ml—次性針管并降溫凝膠化。通過計算機對體外再造的脂肪組織進行材料建模和結(jié)構(gòu)建模，將結(jié)構(gòu)體的三維造型模型用STL文件輸出，用單噴頭三維成型機(專利公開號1257762)的計算機對該文件分層解析，在計算機的控制下將生長因子緩釋微球、脂肪細胞微膠囊、離散平滑肌細胞與基質(zhì)材料混合體以層層疊加的方式擠出堆積成形，分別構(gòu)建兩個半球，小血管和微血管的通道在成形時自然形成。
實施例4
將實施例3制備的生長因子緩釋微球、脂肪細胞微膠囊和海藻酸鈉、明膠和纖維蛋白原在常溫下以體積比I : 10 : 3 : 3 : 3混合，平滑肌細胞以IO6個/ml的濃度與1:1: I的海藻酸鈉、明膠和纖維蛋白原均勻混合，分別裝入500ml—次性針管并降溫凝膠化。
通過計算機對體外再造的脂肪組織進行材料建模和結(jié)構(gòu)建模，將結(jié)構(gòu)體的三維造 型模型用STL文件輸出，用第二代雙噴頭細胞組裝機(專利公開號1820791)的計算機對該文件分層解析，在計算機的控制下分別將生長因子緩釋微球/脂肪細胞微膠囊/基質(zhì)材料混合體和平滑肌細胞/基質(zhì)材料混合體以層層疊加的方式擠出堆積成形。平滑肌細胞/基質(zhì)材料混合體構(gòu)成分級血管結(jié)構(gòu)通道管壁，生長因子緩釋微球/脂肪細胞微膠囊/基質(zhì)材料混合體構(gòu)成結(jié)構(gòu)體的主體部分，則形成具有多層平滑肌細胞管道結(jié)構(gòu)的類脂肪組織。小血管和微血管的通道在成形時自然形成，
根據(jù)患者軟組織的損傷，構(gòu)建特定形狀的三維結(jié)構(gòu)體，然后用脈動反應器培養(yǎng)和訓練每天2小時，一周，循環(huán)液為內(nèi)皮細胞懸液(IO6個/ml的內(nèi)皮細胞懸液)，即在結(jié)構(gòu)體的血管通道最內(nèi)層形成內(nèi)皮細胞層，高度仿生天然脂肪組織和血管的生理結(jié)構(gòu)。繼續(xù)脈動培養(yǎng)一個月，隨著血管化生長因子的緩釋，內(nèi)皮細胞向基質(zhì)材料中的滲入，調(diào)控毛細血管網(wǎng)的發(fā)生，即形成具有小血管/微血管/毛細血管網(wǎng)的自體脂肪組織。進行自體移植可進行乳房腫瘤切除術(shù)后的脂肪組織重建。
制備出的血管化脂肪組織見圖8所示，可見作為三級結(jié)構(gòu)的水凝膠塊；作為二級結(jié)構(gòu)的細胞團簇結(jié)構(gòu)，其主要由約300 μ m固態(tài)脂肪干細胞微囊和水凝膠支撐網(wǎng)架組成；由基質(zhì)材料微單元、生長因子緩釋系統(tǒng)、離散的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞組成的一級結(jié)構(gòu)。
實施例5脈動體外培養(yǎng)過程
脈動生物反應器采用產(chǎn)自崇州市崇陽眾誠不銹鋼配件服務部的蠕動泵JD-200來提供相應的循環(huán)動力，設(shè)定其工作電壓為12V，流速為60ml/min ;直流電機選用產(chǎn)自北京艾克斯公司的電機ZGB37RH52i，設(shè)定其工作電壓為12V、轉(zhuǎn)速為100r/min ;采用IOOml的注射器；將自制導桿和滑塊導軌，以及各部件，如直流電機、導桿、滑塊導軌、注射器用自制的支架固定在底板上，連接各部件，如圖4所示。
培養(yǎng)液循環(huán)部分由培養(yǎng)液瓶、蠕動泵和培養(yǎng)盒構(gòu)成，各部分由硅膠管連接，培養(yǎng)液經(jīng)硅膠管由蠕動泵從培養(yǎng)液瓶泵入培養(yǎng)盒(內(nèi)置人造脂肪組織)，然后經(jīng)硅膠管流回培養(yǎng)液瓶；導軌滑塊、注射器和直流電機構(gòu)成脈動部分，直流電機與導軌滑塊連接推動注射器活塞往復運動，注射器與蠕動泵的出液端連接后和培養(yǎng)盒連接，由此形成脈動流；壓力表設(shè)置在培養(yǎng)盒上，檢測置于培養(yǎng)盒內(nèi)的脂肪組織內(nèi)的培養(yǎng)液壓力。
在進行體外培養(yǎng)以前，先拆卸脈動生物反應器的連接管、注射器，利用高溫高壓滅菌。然后接通脈動生物反應器，蠕動泵和直流電機接通，首先在培養(yǎng)液瓶中加入少量75 %的酒精，利用酒精在脈動循環(huán)系統(tǒng)中流動滅菌；倒掉酒精然后在培養(yǎng)液瓶中加入一定量已滅菌的PBS溶液，利用該溶液沖洗殘余酒精。
關(guān)掉電源，然后在培養(yǎng)液瓶中加入待培養(yǎng)需使用的培養(yǎng)液，用滅菌好的鑷子夾住實施例4制備的人工脂肪組織接到培養(yǎng)盒的接頭上。為使人工組織牢固地接在接頭上，用已滅菌的細線固定人造組織的兩頭。待脈動生物反應器系統(tǒng)完全連接好后，接通電源，調(diào)整蠕動泵的電壓為12V，調(diào)節(jié)人造組織處所受壓力到O. IMpa，然后就可以持續(xù)運行脈動生物反應器對人造組織進行脈動培養(yǎng)了。
在培養(yǎng)過程中保持上述電壓和脂肪組織的壓力，使線性控制脈動培養(yǎng)過程中脈動頻率在100次/min。
直流電機運行平穩(wěn)后，帶動滑塊在導軌上推動注射器活塞往復運動，活塞拉出的時候從培養(yǎng)液瓶中吸取培養(yǎng)液，擠出時把吸入的培養(yǎng)液注入蠕動泵形成的循環(huán)系統(tǒng)中流經(jīng)培養(yǎng)盒中的人造組織流回培養(yǎng)液瓶。通過調(diào)節(jié)注射器每次吸入、擠出的培養(yǎng)液的量可調(diào)節(jié) 培養(yǎng)人造組織處的壓力。由此，蠕動泵和直流電機持續(xù)運動，脈動生物反應器就提供了一個脈動循環(huán)的培養(yǎng)液流實現(xiàn)了對人造組織的脈動培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種血管化脂肪組織的構(gòu)建方法，包括 1)脂肪區(qū)的構(gòu)建提取脂肪干細胞，將脂肪干細胞先制成干細胞微膠囊，然后脂肪干細胞誘導培養(yǎng)成脂肪細胞，得到材料包裹的高濃度脂肪細胞團簇； 2)血管成分的制備i)將脂肪干細胞分別誘導成平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞；ii)將血管化生長因子制成生長因子緩釋微球； 3)血管化脂肪組織的構(gòu)建i)將生長因子緩釋微球、脂肪細胞囊與基質(zhì)材料混合，作為主體材料，將平滑肌細胞作為通道材料，構(gòu)建有貫通通道的三維結(jié)構(gòu)體；ii)將三維結(jié)構(gòu)體進行脈動體外培養(yǎng)，并以內(nèi)皮細胞的懸液灌流，使內(nèi)皮細胞附著在通道的內(nèi)壁，形成外壁為平滑肌細胞、內(nèi)壁為內(nèi)皮細胞的血管組織；iii)將三維結(jié)構(gòu)體繼續(xù)進行脈動體外培養(yǎng)，生長因子緩釋微球逐漸釋放出血管化生長因子以促進毛細血管的生長，得到產(chǎn)生毛細血管的血管化脂肪組織； 步驟I)所述干細胞微膠囊是將脂肪干細胞與海藻酸鈉基水凝膠生物材料均勻混合后滴入固化液中制成；步驟2)中所述的生長因子緩釋微球是將血管化生長因子與海藻酸鈉混合后滴入固化液中制成；所述干細胞微膠囊的粒徑為100 μ m 500 μ m ;所述生長因子緩釋微球的粒徑為20 μ m 50 μ m ; 所述海藻酸鈉基水凝膠材料是海藻酸鈉、海藻酸鈉/膠原、海藻酸鈉/明膠中的一種；所述固化液為含二價陽離子的鹽溶液；所述海藻酸鈉基水凝膠材料的使用濃度為O.1-10%，其中明膠或膠原的濃度為O. 01-5%，氯化鈣溶液優(yōu)選為IOOmM ； 所述基質(zhì)材料是明膠，海藻酸鈉，膠原，纖維蛋白原中的一種或多種； 步驟3)的步驟i)所述的脂肪細胞囊與基質(zhì)材料的體積比為2:1 1:2，平滑肌細胞的加入量為以基質(zhì)材料計IO5個/ml IOVml ； 步驟3)所述的脈動體外培養(yǎng)采用脈動生物反應器進行，該脈動生物反應器包括培養(yǎng)液供應裝置，液體連續(xù)推進裝置，液體間歇推進裝置，脂肪組織培養(yǎng)裝置和壓力檢測裝置； 培養(yǎng)液供應裝置，液體連續(xù)推進裝置和培養(yǎng)液供應裝置依次相互連接，液體連續(xù)推進裝置將源于培養(yǎng)液供應裝置的培養(yǎng)液推入置于脂肪組織培養(yǎng)裝置的脂肪組織，從脂肪組織流出的培養(yǎng)液流回培養(yǎng)液供應裝置，為脂肪組織提供循環(huán)培養(yǎng)液； 液體間歇推進裝置的進液口連接培養(yǎng)液供應裝置，出液口連接脂肪組織培養(yǎng)裝置，為脂肪組織提供培養(yǎng)液的循環(huán)脈動流； 壓力檢測裝置是檢測脂肪組織培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)液的壓力的壓力表。
2.如權(quán)利要求
I所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述干細胞微膠囊和生長因子緩釋微球采用非接觸式高壓靜電發(fā)生法來制備。
3.如權(quán)利要求
2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述非接觸式高壓靜電發(fā)生法通過一種非接觸式高壓靜電收集器來完成，其包括 高壓靜電發(fā)生裝置提供高壓電場，施加電場力于正極的成囊液，使其呈球狀滴入負極的固化液中； 液體推進裝置將成囊液推入所述高壓電場的正極；以及收集裝置置于負極的固化液將球狀液滴固化，收集固化的液滴。
4.如權(quán)利要求
I所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟3)的步驟i)的構(gòu)建是采用鑄模法或擠出法進行。
5.如權(quán)利要求
4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述擠出法采用三維受控組裝設(shè)備進行。
6.如權(quán)利要求
4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述鑄模法，步驟為采用溶芯技術(shù)制備內(nèi)部貫通的二級血管支架，第一級模擬小血管的生物學結(jié)構(gòu)，內(nèi)徑為ΙΟΟΟμπι 300μπι，第二級結(jié)構(gòu)模擬微血管，內(nèi)徑為300μπι ΙΟΟμπι，進行體外脈動培養(yǎng)，循環(huán)液為平滑肌細胞懸液，使平滑肌細胞均勻附著在血管支架通道內(nèi)形成多層平滑肌細胞；將脂肪細胞微膠囊、生長因子微球與基質(zhì)均勻混合，采用鑄模后凝膠化的方法成型三維結(jié)構(gòu)體；然后將已形成平滑肌細胞層的分級血管支架定位組裝在三維結(jié)構(gòu)體中，構(gòu)建出具有貫通通道的三維結(jié)構(gòu)體。
7.如權(quán)利要求
4或5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述擠出法，使用單噴頭三維成型機的三維受控組裝設(shè)備，具體步驟為將生長因子緩釋微球、脂肪細胞微膠囊和離散的平滑肌細胞與基質(zhì)材料均勻混合，降溫凝膠化；通過計算機對體外再造的脂肪組織進行材料建模和結(jié)構(gòu)建模，用單噴頭三維成型機在計算機的控制下將生長因子緩釋微球、脂肪細胞微膠囊、離散平滑肌細胞與基質(zhì)材料混合體以層層疊加的方式擠出堆積成形，小血管和微血管的通道在成形時自然形成；或， 所述擠出法，使用雙噴頭細胞組裝機的三維受控組裝設(shè)備，具體步驟為將生長因子緩釋微球和脂肪細胞微膠囊與基質(zhì)材料均勻混合，并降溫凝膠化；將離散平滑肌細胞與基質(zhì)材料混合并降溫凝膠化；通過計算機對體外再造的脂肪組織進行材料建模和結(jié)構(gòu)建模，用雙噴頭細胞組裝機在計算機的控制下分別將生長因子緩釋微球/脂肪細胞微膠囊/基質(zhì)材料混合體和平滑肌細胞/基質(zhì)材料混合體以層層疊加的方式擠出堆積成形；平滑肌細胞/基質(zhì)材料混合體構(gòu)成分級血管結(jié)構(gòu)通道管壁，生長因子緩釋微球/脂肪細胞微膠囊/基質(zhì)材料混合體構(gòu)成結(jié)構(gòu)體的主體部分，形成具有多層平滑肌細胞管道結(jié)構(gòu)的類脂肪組織，小血管和微血管的通道在成形時自然形成。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種基于分區(qū)的血管化脂肪組織及其構(gòu)建方法。本發(fā)明所述的血管化脂肪組織是模仿天然脂肪組織的結(jié)構(gòu)，將脂肪細胞包裹在微囊中，與血管組織實現(xiàn)分區(qū)，其構(gòu)建方法包括1)脂肪區(qū)的構(gòu)建；2)血管成分的制備；3)血管化脂肪組織的構(gòu)建i)將生長因子緩釋微球、脂肪細胞囊與基質(zhì)材料混合，作為主體材料，將平滑肌細胞作為通道材料，構(gòu)建有貫通通道的三維結(jié)構(gòu)體；ii)將三維結(jié)構(gòu)體進行脈動體外培養(yǎng)，并以內(nèi)皮細胞的懸液灌流，使內(nèi)皮細胞附著在通道的內(nèi)壁，形成外壁為平滑肌細胞、內(nèi)壁為內(nèi)皮細胞的血管組織。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建方法，可得到具有脂肪和血管分區(qū)分布、分級血管結(jié)構(gòu)、可在體內(nèi)長期穩(wěn)定存在的脂肪組織。
文檔編號C12N5/071GKCN101492655 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200910079726
公開日2013年1月30日 申請日期2009年3月9日
發(fā)明者姚睿, 顏永年, 張人佶, 王小紅, 林峰, 欒杰, 熊卓, 隋少春, 張磊, 盧清萍 申請人:清華大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (1),