專利名稱:產(chǎn)l-甲硫氨酸前體的微生物及利用該微生物生產(chǎn)l-甲硫氨酸前體的方法
產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的微生物及利用該微生物生產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的方法技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)L-甲硫氨酸前體——O-乙酰高絲氨酸的微生物，以及利用該微生物生產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的方法。
背景技術(shù)：
[0002]甲硫氨酸是一種人體必需氨基酸，其已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用作飼料和食品添加劑，也被用作藥劑和藥物的合成原材料。甲硫氨酸作為膽堿(蛋黃素)和肌酸這些化合物的前體， 同時也用作半胱氨酸和?；撬岬暮铣稍牧?。甲硫氨酸還可以提供硫。S-腺苷-甲硫氨酸 (S-adenosyl-methionine)源自L-甲硫氨酸并在人體中起提供甲基的特定作用，同時還與腦部中各種神經(jīng)遞質(zhì)的合成有關(guān)。甲硫氨酸和/或S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)可以抑制肝臟和動脈中的脂肪累積，還能減輕抑郁、炎癥、肝臟疾病和肌肉疼痛等。[0003]甲硫氨酸和/或S-腺苷-L-甲硫氨酸在體內(nèi)的已知功能如下[0004]I)抑制肝臟和動脈中的脂肪累積，促進脂類代謝，并改善腦部、心臟和腎臟的血液循環(huán)(J Hepatol. Jeon BR 等，2001 Mar ；34(3) :395-401)。[0005]2)促進毒素物質(zhì)的消化、解毒和排泄，以及重金屬的排泄，如鉛。[0006]3)以 800_1600mg/天的劑量用作抗抑郁藥物服用(Am J Clin Nutr. MischoulonD. 等，2002 vNov ；76(5) :1158S_61S)。[0007]4)增強肝臟功能(FASEB J. Mato JM.，2002 Jan ; 16 (I) : 15-26)，并且尤其對由于酒精引起的肝臟疾病有效(Cochrane Database Syst Rev.，Rambal diA. , 2001 ； (4) CD002235)。[0008]5)對骨與關(guān)節(jié)疾病有抗炎作用，并促進關(guān)節(jié)恢復(fù)(ACP J Club. Sander 0.， 2003Jan-Feb ；138(1) :21，J Fam Pract.，Soeken KL 等，2002May ；51 (5) :425-30)。[0009]6)是頭發(fā)的必需營養(yǎng)物質(zhì)。它可以為頭發(fā)提供營養(yǎng)，從而防止脫發(fā) (AudiolNeurootol. , Lockwood DS 等，2000 Sep-Oct ；5 (5) :263-266)。[0010]甲硫氨酸可以通過化學或生物合成，從而用于飼料、食品和藥品。[0011]在化學合成中，甲硫氨酸主要通過5-(β -甲硫乙基)-乙內(nèi)酰脲(5_( β-methylm ercaptoethyl) -hydantoin)水解來生產(chǎn)?；瘜W合成的甲硫氨酸有個缺點，所生產(chǎn)的甲硫氨酸只能以L型和D型的混合形式被生產(chǎn)出來。[0012]在生物合成中，甲硫氨酸通過利用參與甲硫氨酸合成的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。L-甲硫氨酸在如metA、metB、metC、metE、metH的這些基因所表達的酶的作用下,在大腸桿菌中由高絲氨酸生物合成。特別是metA是編碼高絲氨酸琥拍酰轉(zhuǎn)移酶(homoserineO-succinyltrans ferase)的基因，該基因是甲硫氨酸生物合成所必需的第一個酶，并且它將高絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)?O-琥珀酰-L-高絲氨酸。O-琥珀酰高絲氨酸裂解酶或metB基因編碼的Y -胱硫醚合成酶將O-琥珀酰-L-高絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡琢蛎选etC基因編碼的β -胱硫醚裂解酶將胱硫醚轉(zhuǎn)變?yōu)長-高半胱氨酸。metE基因編碼鈷胺素不依賴型甲硫氨酸合成酶，metH編碼鈷胺素依賴型甲硫氨酸合成酶，這兩個酶可以將L-高半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)長-甲硫氨酸。同時，metF基因編碼的5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶和glyA基因編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶共同合成 N(5)-甲基四氫葉酸，以提供L-甲硫氨酸合成中必需的甲基。[0013]L-甲硫氨酸通過上述酶一系列的有機反應(yīng)合成。上述蛋白質(zhì)和影響上述蛋白質(zhì)的其它蛋白質(zhì)的基因修飾可能導(dǎo)致L-甲硫氨酸合成的增加。例如，日本早期公開的公開號 2000/139471的專利描述了用基因組中缺失thrBC和met J基因，過表達metBL基因且metK 基因被滲漏突變替代的埃希氏菌屬(Escherichia sp.)生產(chǎn)L-甲硫氨酸的方法。此外，公開號為US2003/0092026A1的美國專利也描述了利用敲除metD基因(L-甲硫氨酸合成抑制物)的屬于棒狀桿菌屬(Corynerbacterium sp.)的微生物生產(chǎn)L-甲硫氨酸的方法。公開號為”2002/0049305的美國專利描述了通過提高5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(metF)的表達提高L-甲硫氨酸產(chǎn)量的方法。[0014]用生物學方法生產(chǎn)的甲硫氨酸是L型的，其具有優(yōu)點但是產(chǎn)量太低。這是因為甲硫氨酸生物合成途徑具有非常嚴謹?shù)姆答佌{(diào)節(jié)系統(tǒng)。一旦甲硫氨酸的合成達到一定水平， 終產(chǎn)物甲硫氨酸將抑制編碼起動甲硫氨酸生物合成主要蛋白質(zhì)的metA基因的轉(zhuǎn)錄。由于metA基因在轉(zhuǎn)錄階段被甲硫氨酸抑制，且在接下來的翻譯階段被胞內(nèi)蛋白酶降解，因此 metA基因本身的過表達不能提高甲硫氨酸的產(chǎn)量(Dvora Biran, Eyal Gur, LeoraGollan 和 Eliora Z. Ron Control of methionine biosynthesis in Escherichia coliby proteolysis Molecular Microbiology (2000) 37 (6)，1436-1443)。因此,許多先前的專利專注于如何將metA基因從反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)中分離出來(W02005/108561，W01403813)。[0015]公開號為US2005/0054060A1的美國專利描述了一種通過修飾的胱硫醚合成酶 (O-琥珀酰高絲氨酸裂解酶)合成高半胱氨酸或甲硫氨酸的方法，該胱硫醚合成酶可以直接以甲硫醇(CH3SH)或硫化氫(H2S),而不是以半胱氨酸作為硫源。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員非常熟悉胱硫醚合成酶在細胞中可以與多種甲硫氨酸前體結(jié)合，從而產(chǎn)生高水平的副產(chǎn)物。例如，據(jù)報道，胱硫醚合成酶通過O-琥珀酰高絲氨酸和高半胱氨酸的副反應(yīng)積累高水平的高羊毛氨酸(J. Bacteriol (2006) vol 188 :p609_618)。因此，胱硫醚合成酶的過表達增加了其副反應(yīng)，降低了細胞內(nèi)反應(yīng)的效率。而且這種方法還有許多缺點。這個過程利用了具有副反應(yīng)和反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)的細胞內(nèi)代謝途徑。此外，該過程所用的硫化氫和甲硫醇是對細胞具有嚴重毒性的。因此，甲硫氨酸的產(chǎn)量相對較小。[0016]為解決這些問題，本發(fā)明人開發(fā)了兩步法，包括第一步，通過大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-甲硫氨酸前體；第二步，通過酶反應(yīng)將L-甲硫氨酸前體轉(zhuǎn)變?yōu)長-甲硫氨酸(PCT/ KR2007/003650)。此兩步法能夠解決上述問題，如硫化物的細胞毒性，甲硫氨酸和SAMe的反饋調(diào)節(jié)和胞內(nèi)酶對中間產(chǎn)物降解(如Y-胱硫醚合成酶、O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶和O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶)。而且，與產(chǎn)生D-甲硫氨酸和L-甲硫氨酸混合形式的甲硫氨酸的化學合成法相比，兩步法在只選擇性地產(chǎn)生L-甲硫氨酸上非常有效。[0017]在兩步法中，甲硫氨酸前體的產(chǎn)量對提高甲硫氨酸的產(chǎn)量是一個關(guān)鍵因素。為提高甲硫氨酸前體O-乙酰高絲氨酸的合成產(chǎn)量，強天冬氨酸激酶、高絲氨酸轉(zhuǎn)移酶和O-乙酰高絲氨酸轉(zhuǎn)移酶的良好組合是非常重要的。在前述的背景技術(shù)基礎(chǔ)上，本發(fā)明人構(gòu)建了產(chǎn) L-甲硫氨酸前體的菌株，該菌株的特征為a)通過基因整合導(dǎo)入，強化了高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性(EC2. 3. I. 31),整合的基因選自棒狀桿菌屬(corynebacteriumsp.)、鉤端螺旋菌屬(Leptosp ira sp.)、奇異球菌屬(Deinococcus sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.) 或分枝桿菌屬(Mycobacterium sp.)；[0018]或b)強化了天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性(EC2. 7. 2. 4或I. I. I. 3)；[0019]或c) a)和b)的結(jié)合。[0020]
發(fā)明內(nèi)容
[0021]本發(fā)明提供了一種產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的微生物和一種利用該微生物生產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的方法。[0022]特別是，本發(fā)明提供了一個產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的產(chǎn)生菌株，該菌株的特征為a) 通過基因整合導(dǎo)入并強化了高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性(EC2. 3. I. 31)，整合的基因選自棒狀桿菌屬(corynebacterium sp·)、鉤端螺旋菌屬(Leptosp ira sp·)、奇異球菌屬 (Deinococcus sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)或分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)；[0023]或b)強化了天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性(EC2. 7. 2. 4或I. I. I. 3)；[0024]或c) a)和b)的結(jié)合，[0025]以及一種用此菌株生產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的方法。


[0026]參考附圖，可以更好的理解本發(fā)明優(yōu)選實施例的應(yīng)用，其中[0027]圖I是甲硫氨酸前體產(chǎn)生菌株的基因操作的圖解。[0028]圖2是甲硫氨酸生產(chǎn)的2步法化學結(jié)構(gòu)的圖解。[0029]圖3是metX基因表達pCJ_MetX_CL的不意圖。
發(fā)明內(nèi)容
[0030]就本發(fā)明的一個方面而言，本發(fā)明涉及L-甲硫氨酸前體的產(chǎn)生菌株，該菌株特征為-M)通過基因整合導(dǎo)入并強化了高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性(EC2. 3. I. 31)，整合的基因選自棒狀桿菌屬(corynebacterium sp.)、鉤端螺旋菌(Leptosp ira sp·)、奇異球菌屬 (Deinococcus sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)或分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)；[0031]或b)強化了天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性(EC2. 7. 2. 4或I. I. I. 3)；[0032]或c) a)和b)的結(jié)合，[0033]以及一種用此菌株生產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的方法。[0034]術(shù)語“L-甲硫氨酸前體”被定義為甲硫氨酸特定代謝途徑中一部分的代謝產(chǎn)物，或可以衍生這些代謝產(chǎn)物。特別是，此處所用的L-甲硫氨酸前體指的是O-乙酰高絲氨酸。[0035]術(shù)語“L-甲硫氨酸前體產(chǎn)生菌株”指的是通過本發(fā)明的操作能累積L-甲硫氨酸前體的原核或真核微生物菌株。例如，該菌株可以選自由埃希氏菌屬(Escherichia sp.)、歐文氏菌屬(Erwinia sp.)、沙雷氏菌屬(Serratia sp.)、普羅威登斯菌屬 (Providenciasp.)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、鉤端螺旋菌屬(Leptospira sp.)、沙門氏菌屬(Salmonellar sp.)、短桿菌屬 (Brevibacteriasp.)、亞單胞菌屬(Hypomononas sp.)、色素桿菌屬(Chromobacterium sp.)和諾卡氏菌屬(Norcardia sp.)微生物組成的組,或真菌,或酵母。優(yōu)選可以利用埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、鉤端螺旋菌屬和酵母屬的微生物產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸。更優(yōu)選的可以利用埃希氏菌屬，且最優(yōu)選地可以利用大腸桿菌(在下文中稱為“E. coli”)。[0036]在不同的實施例中，本發(fā)明提供了一種L-甲硫氨酸前體產(chǎn)生菌株，其中參與真正 O-琥珀酰高絲氨酸或O-乙酰高絲氨酸降解的基因缺失或削弱，且通過引入或強化了參與 O-乙酰高絲氨酸合成的基因。本發(fā)明也選擇性提供了一個菌株，該菌株的蘇氨酸生物合成途徑被阻斷或削弱，以增強O-乙酰高絲氨酸產(chǎn)量。本發(fā)明進一步提供了一個菌株，該菌株中導(dǎo)入、過表達或活性增強了不受反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)控制的高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明還提供了一個菌株，該菌株過表達或活性增強了天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶。本發(fā)明還提供了一個菌株，該菌株中導(dǎo)入、過表達或活性增強了不受反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)控制的高絲氨酸 O-乙酰轉(zhuǎn)移酶，和過表達或活性增強了天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶。[0037]尤其是，本發(fā)明提供了一個L-甲硫氨酸前體產(chǎn)生菌株，該菌株敲除了參與L-甲硫氨酸前體降解的metB基因、參與蘇氨酸生物合成途徑的thrB基因和調(diào)節(jié)L-甲硫氨酸前體產(chǎn)物基因轉(zhuǎn)錄的met J基因。本發(fā)明還通過敲除參與甲硫氨酸前體合成的真實metA或metX 基因，導(dǎo)入外源metX基因，提供了一個L-甲硫氨酸前體的產(chǎn)生菌株。本發(fā)明還通過增強 thrA基因編碼的活性，提供了一個L-甲硫氨酸前體的產(chǎn)生菌株。[0038]更優(yōu)選地，本發(fā)明還通過敲除參與甲硫氨酸前體合成的真實metA或metX基因，導(dǎo)入不受反饋系統(tǒng)控制的外源metX基因，以及增強thrA基因編碼的活性，提供了一個L-甲硫氨酸前體的產(chǎn)生菌株。[0039]本發(fā)明中所使用的“失活”指的是基因的缺失或衰減(attenuation)?；虻娜笔ㄟ^切除該基因的區(qū)域或在染色體中引入特定基因的序列來修飾蛋白質(zhì)序列來實現(xiàn)。術(shù)語 “衰減”或“削弱(weakening)”在此指的是減弱或消除微生物中一個或多個相應(yīng)DNA編碼的酶(蛋白質(zhì))的胞內(nèi)活性，例如，通過修飾基因的啟動子區(qū)域和5’-UTR的核苷酸序列，或者通過在靶基因的ORF區(qū)域引入突變來減弱蛋白的活性。通過衰減的方法，通常相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度會降低到野生型蛋白質(zhì)的活性或濃度的，或起始微生物中該蛋白質(zhì)活性或濃度的 0-75%、0-50%、0-25%、0-10%或 0-5%。[0040]例如，為了實現(xiàn)衰減，可以通過降低或消除基因的表達或酶蛋白質(zhì)的催化性質(zhì)。這兩種方法可以選擇地結(jié)合。[0041]通過合適的培養(yǎng)，基因表達信號結(jié)構(gòu)的修飾(突變)，以及反義RNA技術(shù)都可以實現(xiàn)基因表達的降低。例如，基因表達的信號結(jié)構(gòu)可以是限制基因、激活基因、操縱子、 啟動子、弱化子、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子和終止子。專家們都可以找到這方面的信息，尤其是下面的文獻中Jensen 和 Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191195 (1998)), Carrier 和 Keasling(Biotechnology Progress 15:58 64(1999)), Franch 和 Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3:159 164(2000))以及一些熟知的遺傳學和分子生物學教科書如Knippers的《分子遺傳學》第六版 ("MolecularGenetics " , 6th edition, 1995)或 Winnacker 的《基因與克隆》("Genes and Clones" ,1990)。[0042]從現(xiàn)有的技術(shù)中，可以獲得引起酶蛋白質(zhì)催化性質(zhì)改變或降低的突變。例如可以參考下面這些人的工作，Qiu 和 Goodman (Journal of Biological Chemistry 272 86118617(1997)) ,Yano 等(Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95: 5511 5515 (1998)),以及 Wente 和 Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266 2083320839(1991))。遺傳學和分子生物學的教科書中有這方面的概述，例如Hagemann的普通遺傳學("General Genetics" ,1986)。[0043]可能的突變是轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失?！板e義突變”或無義突變指的是酶活性的變化取決于氨基酸交換的效果?；蛑兄辽僖粚A基對的插入或缺失導(dǎo)致的“移碼突變”， 其將導(dǎo)致氨基酸的不正確組合或翻譯的過早終止。突變的結(jié)果如果是在編碼區(qū)域形成一個終止密碼子，這還將導(dǎo)致翻譯的提前終止。特別是幾個密碼子的缺失會導(dǎo)致酶活性的完全喪失。這些突變的說明都是現(xiàn)有技術(shù)，可以在公知的遺傳學和分子生物學的教科書中找到， 例如，Knippers 的《分子遺傳學》第六版("Molecular Genetics"，6thedition, 1995)， Winnacker的《基因與克隆》("Genes and Clones " , 1990),或Hagemann的普通遺傳學 ("General Genetics" ,1986)。[0044]基因的合適突變，例如缺失突變，可以通過基因或等位基因的替代整合入合適的菌株。[0045]本發(fā)明中，術(shù)語“強化(enhancement) ”指的是相應(yīng)DNA編碼的酶的胞內(nèi)活性的升高。酶的胞內(nèi)活性的強化可以通過基因的過表達來實現(xiàn)。靶基因的過表達可以通過修飾基因的啟動子區(qū)域或核苷酸序列的5’ -UTR區(qū)域來實現(xiàn)。靶基因的過表達也可以通過在染色體中引入靶基因的額外拷貝來實現(xiàn)，通過將包含具有啟動子的該靶基因的載體轉(zhuǎn)化到宿主菌株，或在靶基因中引入增加表達的突變。酶的胞內(nèi)活性的強化也可以通過在靶基因的ORF 區(qū)域引入突變來實現(xiàn)?？偟恼f來，基于野生型蛋白質(zhì)或起始微生物中蛋白質(zhì)的活性或濃度， 通過強化的辦法，相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度可以提高至少10%、25%、50%、75%、100%、 150%,200%,300%,400%^； 500%，最高到 1000%或 2000%。[0046]在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，制備L-甲硫氨酸前體的產(chǎn)生菌株的辦法如下[0047]第一步，敲除或弱化菌株中的編碼Y-胱硫醚合成酶、O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶或O-乙酰高絲氨酸硫解酶的基因，以累積L-甲硫氨酸前體如O-琥珀酰高絲氨酸或 O-乙酰高絲氨酸。[0048]編碼Y -胱硫醚合成酶的基因為metB，編碼O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶的基因為metZ，編碼O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶的基因為metY。編碼具有上述活性的蛋白質(zhì)的基因用大腸桿菌中的metB舉例說明。該基因的基因組序列可以從已經(jīng)報道(Blattner等， Science 277 :1453-1462(1997))的大腸桿菌基因組序列(登記號為AAC75876)中獲得。上述基因組序列也可以從NCBI (國家生物技術(shù)信息中心)和DDBJ(日本DNA數(shù)據(jù)庫)獲得。 具有相同活性的其它基因通過來自棒狀桿菌屬的metB和metY和來自假單胞菌屬的metZ 舉例說明。[0049]如下列反應(yīng)方程式所示，Y-胱硫醚合成酶、O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶或 O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶具有將O-琥珀酰高絲氨酸或O-乙酰高絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡琢蛎鸦蚋甙腚装彼岬幕钚浴Ｒ虼?，一旦具有該活性的基因被敲除或弱化，O-琥珀酰高絲氨酸或 O-乙酰高絲氨酸會在培養(yǎng)液中過量累積。[0050]L-半胱氨酸+0-琥珀酰-L-高絲氨酸〈= > 琥珀酸鹽+胱硫醚 L-半胱氨酸+0-乙酰-L-高絲氨酸〈= > 乙酸鹽+胱硫醚[0052]HS_+0-琥珀酰-L-高絲氨酸〈= > 琥珀酸鹽+高半胱氨酸[0053]HS_+0-乙酰-L-高絲氨酸〈= > 乙酸鹽+高半胱氨酸[0054]第二步，第一步中制備的菌株中編碼高絲氨酸激酶的thrB基因被敲除或弱化。 thrB基因參與從高絲氨酸合成O-磷酸高絲氨酸的反應(yīng)，O-磷酸高絲氨酸在thrC基因作用下被轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸。thrB基因的敲除或弱化是為了將所有產(chǎn)生的高絲氨酸合成甲硫氨酸前體。[0055]第三步，甲硫氨酸合成途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子被敲除或弱化。參與甲硫氨酸合成的 metA、metB、metC、metE和metF基因被反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)所抑制。merj基因是大腸桿菌中的一個典型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子基因。為了讓合成甲硫氨酸前體的metA或metX基因過表達，met J基因需要去除。因此，去除大腸桿囷中的metJ基因，metA或metX基因的表達通常會提聞，從而導(dǎo)致L-甲硫氨酸前體的大量產(chǎn)生。[0056]上述步驟2和3可以根據(jù)前體產(chǎn)生菌株進行修飾或去除。但是，更優(yōu)選進行該步驟來強化埃希氏菌屬微生物的前體產(chǎn)生途徑。[0057]第四步，為了增加O-乙酰高絲氨酸、L-甲硫氨酸前體的合成，引入了 metX基因編碼的參與甲硫氨酸生物合成途徑第一步反應(yīng)的高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶。metX基因是一個常用的標識基因，編碼的蛋白質(zhì)具有高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，而且新的外源高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶可以從不同的微生物菌種中得到。例如，編碼高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶肽的基因可以選自棒狀桿菌屬、鉤端螺旋菌屬、奇異球菌屬、假單胞菌屬或分枝桿菌屬。優(yōu)選編碼高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶肽的基因選自谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium glutamicum)、麥氏鉤端螺旋菌(Leptospira meyeri)、耐福射奇異球菌(Deinococcus radiodurans)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)。更優(yōu)選的編碼高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶肽的基因選自Unipro數(shù)據(jù)庫中編號 Q9RVZ8 (Deinococcus radiodurans) > NP_249081 (Pseudomonas aeruginosa)或 YP_886028 (Mycobacterium smegma tis)。已知來自麥氏鉤端螺旋菌(leptospira meyeri) 的 metX 基因具有反饋抑制(J Bacteriol. 1998Jan ；180(2) :250-5. Belfaiza J 等)，以及先前在我們實驗室確認的具有反饋抑制的幾個高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶。[0058]metX基因的引入和強化，可以通過引入基因或修飾基因的啟動子區(qū)域和核苷酸序列的5’ -UTR進行，也可以通過在靶基因的ORF區(qū)域引入突變實現(xiàn)。metX基因表達的強化會導(dǎo)致甲硫氨酸前體合成的提高。[0059]第五步，增強天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶的活性，以增加高絲氨酸的合成，高絲氨酸是O-琥珀酰高絲氨酸或O-乙酰高絲氨酸的前體。thrA基因常見的定義是該基因編碼的肽具有天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性。優(yōu)選，Unipix)數(shù)據(jù)庫編號為AP_000666 編碼的天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶。更優(yōu)選的是，選序列號為27的thrA基因所編碼的氨基酸序列，該序列的345位點的氨基酸發(fā)生了突變。通過在thrA基因中引入突變或?qū)谢蛘系饺旧w中，以及進一步引入處理過的質(zhì)粒來增強thrA基因的活性。[0060]利用前述步驟I到5的部分或完整方法，就可以在菌株內(nèi)累積L-甲硫氨酸的前體 O-乙酰高絲氨酸。[0061]可以從產(chǎn)L-賴氨酸、L-蘇氨酸或L-異亮氨酸的菌株起始制備L-甲硫氨酸前體的產(chǎn)生菌株。優(yōu)選用產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株制備產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的菌株。采用該菌株，高絲氨酸合成容易進行，而且甲硫氨酸前體的產(chǎn)量會增加。因此，用產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株通過敲除或弱化蘇氨酸生物合成途徑中的一個基因，然后敲除或弱化metA或metY或metZ基因，就可以累積甲硫氨酸前體。更優(yōu)選的是，先敲除或弱化thrB基因，再敲除或弱化metB或metY 或metZ基因，來合成甲硫氨酸前體。同時，metX基因表達的強化會導(dǎo)致甲硫氨酸前體合成的增加。[0062]本發(fā)明術(shù)語“L-蘇氨酸產(chǎn)生菌株”指的是在體內(nèi)能夠生產(chǎn)L-蘇氨酸的原核或真核微生物菌株。例如，該菌株可以包括屬于埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、沙雷氏菌屬、普羅威登斯菌屬、棒狀桿菌屬和短桿菌屬的L-蘇氨酸產(chǎn)生微生物菌種。其中，優(yōu)選的是埃希氏菌屬，更優(yōu)選大腸桿菌。[0063]本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所用的菌株是產(chǎn)L-蘇氨酸且不依賴L-甲硫氨酸的菌株CJM002，該菌株轉(zhuǎn)化自產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌突變菌株TF4076(KFCC 10718，韓國專利號92-8365)。TF4076需要甲硫氨酸，抗甲硫氨酸類似物(如α-氨基-β-羥基戊酸， AHV)，賴氨酸類似物(如S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸，AEC)和異亮氨酸類似物(如α-氨基丁酸)。由于TF4076是一個需要甲硫氨酸的菌株，該菌株不能在體內(nèi)合成甲硫氨酸。通過去掉該菌株對甲硫氨酸的依賴，該菌株被用作本發(fā)明中的產(chǎn)甲硫氨酸前體的菌株，本發(fā)明人還通過用NTG人工突變使產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌CJM002去除了對甲硫氨酸的依賴。 大腸桿菌CJM002被命名為大腸桿菌MF001，2004年4月9日保存在KCCM(韓國微生物保藏中心，Eulim Buld.，Hongje-l-Dong, Seodaemun-Ku,首爾，361-221,韓國)(登記號為 KCCM-10568)。本發(fā)明中，大腸桿菌CJM002中的metB，thrB, met J和metA基因均被敲除了， 然后在metA基因的基因位點引入metX基因。所產(chǎn)生的由大腸桿菌CJM002構(gòu)建的產(chǎn)L-甲硫氨酸前體菌株被命名為CJM-X。CJM-X菌株中的metX基因來自耐輻射奇異球菌。將帶有 thrA基因的表達載體轉(zhuǎn)化到CJM-X菌株后，所得菌株被命名為CJM-X (pthrA (M) -CL)。[0064]通過上述方法制得產(chǎn)O-乙酰高絲氨酸的大腸桿菌CJM-X(Escherichia coli CJM-X) (pthrA(M)-CL)于 2008 年 I 月 23 日保藏，登記號為 KCCM10921P。[0065]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例中，采用的是PCT/KR2005/00344中公開的產(chǎn)L-蘇氨酸菌株FTR2533。菌株FTR2533源自大腸桿菌TFR7624，大腸桿菌TFR7624源自大腸桿菌登記號KCCM 10236。而大腸桿菌登記號KCCM 10236源自大腸桿菌TF4076。大腸桿菌登記號KCCM 10236能表達高水平的催化從PEP形成草酰乙酸鹽的ppc基因，且需要從天冬氨酸合成蘇氨酸必須的酶，如thrA基因天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶、thrB :高絲氨酸激酶、thrC:蘇氨酸合成酶，從而能夠增加L-蘇氨酸的產(chǎn)量。大腸桿菌FTR7624(KCCM 10538) 有一個失活的tyrR基因，該基因抑制L-蘇氨酸生物合成所必需的基因tyrB的表達。大腸桿菌FTR2533 (KCCM10541)是具有一個失活的galR基因的產(chǎn)L-蘇氨酸菌株，是一個產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌突變菌株。[0066]在本發(fā)明中，大腸桿菌FTR2533中的metB、thrB、metJ和metA基因均被敲除了，然后在metA基因的基因位點引入metX基因。所產(chǎn)生的由大腸桿菌FTR2533構(gòu)建的產(chǎn)L-甲硫氨酸前體菌株被命名為CJM2-X。CJM2-X菌株中的metX基因來自耐輻射奇異球菌。將帶有thrA基因的表達載體轉(zhuǎn)化到CJM2-X菌株后，所得菌株被命名為CJM2-X (pthrA (M) -CL)。[0067]大腸桿菌CJM2-X(Escherichia coli CJM2-X) (pthrA(M) -CL)于 2008 年 2 月 12 日保藏，登記號為KCCM 10925P。[0068]另一方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的方法，該方法包括a)上述微生物的發(fā)酵山)在培養(yǎng)基中或微生物體中富集L-甲硫氨酸前體；和c)分離L-甲硫氨酸前體。[0069]上述制備的產(chǎn)L-甲硫氨酸前體菌株的培養(yǎng)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的合適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件來進行。根據(jù)所選擇的菌株，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以簡單調(diào)節(jié)所用的培養(yǎng)方法。例如，培養(yǎng)方法包括但不限于批次培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和補料批次培養(yǎng)。不同的培養(yǎng)方法見參考文獻 James Μ· Lee 的生物化學工程(Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)。[0070]培養(yǎng)基必需滿足特定菌株的培養(yǎng)條件。不同的微生物培養(yǎng)基見參考文獻美國細菌學會的普通細菌學方法手冊(“Manual of Methods for General Bacteriology, WashingtonD.C.，USA，1981)。這些培養(yǎng)基含有不同的碳源、氮源和微量元素。碳源可以是碳水化合物如葡萄糖、蔗醣、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉、纖維素；也可以是脂肪如大豆油、葵花子油、篦麻油和椰子油；還可以是脂肪酸如棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸；還可以是醇類如丙三醇和乙醇，以及有機酸如乙酸。也可以用這些化合物的一種或其混合物作為碳源。氮源可以是有機氮源如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米漿(CSL)和豆粉，以及無機氮源如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。也可以用這些化合物的一種或其混合物作為氮源。培養(yǎng)基中還可以添加包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀以及相應(yīng)的鈉鹽作為磷源。培養(yǎng)基中也可以含有金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。此外，也可以加入氨基酸、維生素及其適當?shù)那绑w。培養(yǎng)基或前體物可以通過批次或連續(xù)的方式加入培養(yǎng)基中。[0071]培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的pH可以通過以適當?shù)耐緩郊尤肴鐨溲趸@、氫氧化鉀、氨、 磷酸和硫酸的化合物來調(diào)節(jié)。培養(yǎng)過程中，氣泡的產(chǎn)生可以通過消泡劑進行抑制，如脂肪酸聚乙酯。可以向培養(yǎng)基中通入氧氣或含氧氣體(如空氣)來維持好氣性條件。培養(yǎng)溫度通常是20-45°C，優(yōu)選25-40°C。培養(yǎng)期間可以持續(xù)進行直到L-甲硫氨酸前體達到所需的水平，培養(yǎng)時間最好為10-160小時。
具體實施方式
[0072]本發(fā)明實際且目前優(yōu)選的實施例如下面的實施例所示，這些實施例是為了證明本發(fā)明，而不是為了構(gòu)建本發(fā)明的界限。需要理解本領(lǐng)域的技術(shù)人員考慮在本發(fā)明公開的基礎(chǔ)上可在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進行改良和改進。[0073]實施例I :構(gòu)津產(chǎn)甲硫氨酸前體菌株[0074]〈l-l>metB基因的敲除[0075]為了敲除大腸桿菌中編碼胱硫醚合成酶的metB基因，采用了一步FRT-PCR敲除技術(shù)(PNAS (2000) vol 97 P6640-6645)。以 pKD3 載體為模版(PNAS (2000) vol 97 P6640-6645)，用序列I和2引物進行PCR，構(gòu)建缺失盒。用以下程序進行PCR，94°C變性30 秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸I分鐘，進行30個循環(huán)。[0076]PCR產(chǎn)物在I. 0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，隨后純化I. 2kbp條帶獲得DNA。 回收的DNA片段使用pKD46載體電轉(zhuǎn)至大腸桿菌(K12) W3110 (PNAS (2000) vol 97 P6640-6645)。電轉(zhuǎn)前，轉(zhuǎn)化有pKD46載體的大腸桿菌W3110在含有100 μ g/L氨芐青霉素和5mM L-阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)到OD6tltl達到0. 6。然后用無菌蒸餾水洗滌菌體兩次，再用10%的甘油洗滌一次。2500伏進行電轉(zhuǎn)。復(fù)蘇的菌株在含有25 μ g/L氯霉素的LB平板上劃線，37°C培養(yǎng)過夜。然后，挑選具有氯霉素抗性的菌株。[0077]用引物I和2以所選的菌株為模版在相同條件下進行PCR。通過I. 0%瓊脂糖凝膠上是否出現(xiàn)I. 2kb大小的基因來確認metB基因的缺失。然后用pCP20載體轉(zhuǎn)化該菌株 (PNAS (2000) vol 97 :P6640_6645)，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)來去除氯霉素標記基因。metB基因敲除的菌株構(gòu)建完成，在相同條件下進行PCR，I. O %瓊脂糖凝膠上metB基因減小到150bp。 構(gòu)建的菌株命名為W3-B。[0078]<l-2>thrB某閔的敲除[0079]發(fā)明人通過敲除編碼高絲氨酸激酶的thrB基因，來盡量增加從高絲氨酸合成 O-乙酰高絲氨酸。特別是，當產(chǎn)蘇氨酸菌株被用作O-乙酰高絲氨酸的產(chǎn)物宿主時，thrB基因的敲除是必需的，因為在這個基因作用下，高絲氨酸向O-磷酰高絲氨酸的轉(zhuǎn)變是非常強的。為了敲除上述構(gòu)建的W3-B菌株中的thrB基因，用上述敲除metB基因相同的辦法進行一步 FRT-PCR。[0080]用引物3 和 4，以 pKD4 載體為模版(PNAS (2000) vol 97 :P6640_6645)，進行 PCR 來構(gòu)建thrB基因缺失盒，程序如下94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，進行30 個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在I. O %的瓊脂糖凝膠上進行電泳，隨后純化I. 6kbp條帶的DNA?；厥盏?DNA片段電轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)化有pKD46載體的大腸桿菌W3-B。復(fù)蘇的菌株在含有50 μ g/L卡那霉素的LB平板上劃線，37°C培養(yǎng)過夜。然后，挑選具有抗性的菌株。[0081]用引物3和4以所選的菌株為模版在相同條件下進行PCR。通過I. 0%瓊脂糖凝膠是否出現(xiàn)I. 6kb大小條帶的菌株，來確認thrB基因的缺失。然后用pCP20載體轉(zhuǎn)化該菌株，并在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。thrB基因敲除的菌株構(gòu)建完成，在相同條件下進行PCR，I. 0% 瓊脂糖凝膠上thrB基因減小到150kb。構(gòu)建的菌株命名為W3-BT。[0082]<l-3>met.T 基因的敲除[0083]為了敲除參與甲硫氨酸前體合成的metA基因的調(diào)節(jié)子基因metB基因，采用了與敲除metB基因方法相同的一步FRT-PCR敲除技術(shù)。[0084]用引物5和6，進行PCR來構(gòu)建metJ基因缺失盒，程序如下94°C變性30秒，55°C 退火30秒，72 °C延伸I分鐘，進行30個循環(huán)。[0085]PCR產(chǎn)物在I. 0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，隨后純化I. 2kbp條帶的DNA?；厥盏?DNA片段電轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)化有pKD46載體的大腸桿菌W3-BT。復(fù)蘇的菌株在含有氯霉素的LB平板上劃線，37 0C培養(yǎng)過夜，然后挑選具有抗性的菌株。[0086]用引物7和8以所選的菌株為模版在上述相同條件下進行PCR。通過I. 0%瓊脂糖凝膠電泳是否出現(xiàn)I. 6kb大小的基因來確認metj基因的缺失。然后用PCP20載體轉(zhuǎn)化該菌株，并在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。最后構(gòu)建完成的metj基因敲除菌株，在相同條件下進行PCR，I.0%瓊脂糖凝膠上metj基因減小到600kb，同時確認菌株氯霉素標記被消除。構(gòu)建的菌株命名為W3-BTJ。[0087]<l-4>metA基因的高除[0088]為增加O-乙酰高絲氨酸的產(chǎn)量，編碼高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶的基因metA基因從W3-BTJ菌株中敲除?；趍etX基因的整合，導(dǎo)致O-琥珀酰高絲氨酸和O-乙酰高絲氨酸累積的發(fā)現(xiàn)，期望通過敲除metA基因促進O-乙酰高絲氨酸的累積(表3)。為了敲除metA 基因，采用了一步法FRT-PCR缺失技術(shù)。[0089]用引物9和10，進行PCR來構(gòu)建metA基因缺失盒，程序如下94°C變性30秒，55°C退火30秒，72 °C延伸I分鐘，進行30個循環(huán)。[0090]PCR產(chǎn)物在I. 0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，隨后純化I. 2kbp條帶的DNA?；厥盏?DNA片段電轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)化有pKD46載體的大腸桿菌W3-BTJ。復(fù)蘇的菌株在含有氯霉素的LB平板上劃線，37 0C培養(yǎng)過夜。然后，挑選具有抗性的菌株。[0091]用引物9和10以所選的菌株為模版在上述相同條件下進行PCR。通過I. 0%瓊脂糖凝膠是否出現(xiàn)I. Ikb大小的基因來確認metA基因的缺失。然后用pCP20載體轉(zhuǎn)化該菌株，并在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。最后構(gòu)建完成的metA基因敲除菌株，在相同條件下進行PCR， 1.0%瓊脂糖凝膠上metA基因減小到lOOkb，確認氯霉素標記被消除。構(gòu)建的菌株命名為 W3-BTJA。[0092]〈1_5>過表汰metX基因[0093]為提高O-乙酰高絲氨酸的產(chǎn)量，過表達了編碼高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶的metX基因。[0094]用引物28和29，以麥氏鉤端螺旋菌染色體作為模版進行PCR，程序如下94°C變性 30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸2分鐘，進行25個循環(huán)。[0095]PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，隨后純化I. Ikbp條帶的DNA。分離 DNA片段后，用限制性內(nèi)切酶EcoRV切割含有CJl啟動子的載體pCL1920，并與分離的DNA 片段連接。大腸桿菌用載體轉(zhuǎn)化，且在含有50 μ g/L壯觀霉素的LB瓊脂上挑選攜帶質(zhì)粒的細胞。所構(gòu)建的載體命名為PCJl-Met Xlme-CL0將該載體電轉(zhuǎn)入W3-BTJ菌株，該構(gòu)建的菌株命名為 W3-BTJ/pCJ-Met Xlme-CL0[0096]另一個過表達metX基因的方法是，用引物30和31，以谷氨酸棒狀桿菌染色體為模版進行PCR，程序如下94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，進行25個循環(huán)。[0097]PCR產(chǎn)物在I. 0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，隨后純化I. Ikbp條帶的DNA。隨后， 分離DNA片段后，用限制性內(nèi)切酶EcoRV切割含有CJl啟動子的載體pCL1920，并與分離的 DNA片段連接。用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在含有50 μ g/L壯觀霉素的LB瓊脂上挑選攜帶質(zhì)粒的細胞。所構(gòu)建的載體命名為PCJl-Met Xlme-CL0將該載體電轉(zhuǎn)入W3-BTJ菌株，該構(gòu)建的菌株命名為 W3-BTJ/pCJ-Met Xcgl-CL0[0098]另一個過表達metX基因的方法是,用引物11和12,以耐福射奇異球菌染色體為模版進行PCR，程序如下94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，進行25個循環(huán)。[0099]PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，隨后純化I. Ikbp條帶的DNA。分離 DNA片段后，用限制性內(nèi)切酶EcoRV切割含有CJl啟動子的載體pCL1920，并與分離的DNA 片段連接。用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在含有50 μ g/L壯觀霉素的LB瓊脂上挑選攜帶質(zhì)粒的細胞。所構(gòu)建的載體命名為PCJl-Met Xdr-CL0將該載體電轉(zhuǎn)入W3-BTJ菌株，該構(gòu)建的菌株命名為 W3-BTJ/pCJ-Met Xdr-CL0[0100]另一個過表達metX基因的方法是，用引物13和14，以恥垢分枝桿菌染色體為模版進行PCR，程序如下94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，進行25個循環(huán)。[0101]PCR產(chǎn)物在I. 0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，隨后純化DNA片段。分離DNA片段后， 用限制性內(nèi)切酶EcoRV切割含有CJl啟動子的載體pCL1920，并與分離的DNA片段連接。用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在含有50 μ g/L壯觀霉素的LB瓊脂上挑選攜帶質(zhì)粒的細胞。所構(gòu)建的載體命名為pCJ-Met Xmsm-CL。所構(gòu)建的載體電轉(zhuǎn)入W3-BTJ菌株，該構(gòu)建菌株命名為W3-BTJ/pCJ-Met Xmsm-CL。[0102]另一個過表達metX基因的方法是，用引物15和16，以銅綠假單胞菌PAOl (pae)染色體為模版進行PCR，程序如下94°C變性30秒，55°C退火30秒，720C延伸2分鐘，進行25 個循環(huán)。[0103]PCR產(chǎn)物在I. 0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，隨后純化DNA片段。分離DNA片段后， 用限制性內(nèi)切酶EcoRV切割含有CJl啟動子的載體pCL1920，并與分離的DNA片段連接。用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在含有50 μ g/L壯觀霉素的LB瓊脂上挑選攜帶質(zhì)粒的細胞。所構(gòu)建的載體命名為pCJ-Met Xpae-CL0[0104]上述構(gòu)建的載體分別電轉(zhuǎn)入W3-BTJA菌株，用實施例2-1中的方法，采用搖瓶培養(yǎng)來檢測該菌株的生產(chǎn)能力。[0105]以引入來自谷氨酸棒狀桿菌metX基因載體菌株(PCT/KR2007/003650)的O-乙酰高絲氨酸產(chǎn)量為100%，測定每個菌株的O-乙酰高絲氨酸的產(chǎn)量。[0106]結(jié)果，轉(zhuǎn)入pCJ-Met Xdra_CL、pCJ-Met Xmsm-CL 和 pCJ-Met Xlme-CL 載體的菌株， O-乙酰高絲氨酸的生產(chǎn)能力顯著提高。[0107]
權(quán)利要求
1.ー種能夠生產(chǎn)O-こ酰高絲氨酸的源自埃希氏菌屬的微生物，其特征在于 a)通過整合選自奇異球菌屬或分枝桿菌屬的編碼高絲氨酸O-こ酰轉(zhuǎn)移酶的肽的基因，高絲氨酸O-こ酰轉(zhuǎn)移酶活性被引入并強化； b)天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性被強化； c)Y-胱硫醚合成酶、O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶或O-こ酰高絲氨酸硫化氫解酶被弱化或失活； d)高絲氨酸激酶被弱化或失活；和 e)甲硫氨酸合成途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子被弱化或失活。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其特征在于，編碼所述高絲氨酸O-こ酰轉(zhuǎn)移酶的肽的基因選自耐輻射奇異球菌或恥垢分枝桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其特征在于，編碼所述高絲氨酸O-こ酰轉(zhuǎn)移酶的肽的基因選自Unipro數(shù)據(jù)庫編號為Q9RVZ8或YP_886028的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其特征在于，所述天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶的肽序列為SEQ ID NO 27ο
5.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其特征在于，所述微生物源自產(chǎn)L-蘇氨酸、L-異亮氨酸或L-賴氨酸的菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其特征在于，所述微生物為大腸桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其特征在于，所述微生物源自不依賴甲硫氨酸的產(chǎn)蘇氨酸菌株的大腸桿菌MF001，登記號為KCCM 10568。
8.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其特征在于，所述微生物源自產(chǎn)蘇氨酸菌株的大腸桿菌FTR2533，登記號為KCCM 10541。
9.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其特征在于，所述微生物為產(chǎn)O-こ酰高絲氨酸的大腸桿菌 CJM-X(PthrA(M)-CL)，登記號為 KCCM 10921Ρ。
10.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其特征在于，所述微生物為產(chǎn)O-こ酰高絲氨酸的大腸桿菌 CJM2-X (pthrA (M) -CL)，登記號為 KCCM 10925P。
11.ー種產(chǎn)O-こ酰高絲氨酸的方法，包括a)發(fā)酵根據(jù)權(quán)利要求
I到10中任一權(quán)利要求
所述的微生物山)在培養(yǎng)基中或微生物體內(nèi)富集O-こ酰高絲氨酸；和c)分離O-こ酰高絲氨酸。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)L-甲硫氨酸前體——O-乙酰高絲氨酸的微生物，以及利用該微生物生產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的方法。
文檔編號C12N1/21GKCN101629160 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200910131575
公開日2013年3月20日 申請日期2009年4月7日
發(fā)明者金喆河, 金素影, 申容旭, 嚴惠媛, 張真淑, 趙英郁, 李漢珍, 許仁庚, 徐昌一, 羅光鎬 申請人:Cj第一制糖株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (4),