專(zhuān)利名稱(chēng):制備l-甲硫氨酸前體的微生物和使用該微生物制備l-甲硫氨酸前體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備L-甲硫氨酸前體O-琥珀酰高絲氨酸的微生物，以及使用該微生物制備L-甲硫氨酸前體的方法。發(fā)明背景
甲硫氨酸是人體必需氨基酸之一，廣泛用作飼料和食品添加劑，還用作醫(yī)療解決方案和醫(yī)療用具的合成原料。甲硫氨酸是如膽堿(卵磷脂)和肌酸這類(lèi)化合物的前體，同時(shí)用作半胱氨酸和?；撬岬暮铣稍?。甲硫氨酸還能提供硫。S-腺甲硫氨酸來(lái)源于L-甲硫氨酸且在在人體中提供甲基基團(tuán)方面起一定作用，并且還參與大腦中多種神經(jīng)遞質(zhì)的合成。甲硫氨酸和/或S-腺-L-甲硫氨酸(SAM)抑制肝和動(dòng)脈中的脂肪積聚并且能減輕抑郁、炎癥、肝病和肌肉疼痛等等。
到目前為止已知甲硫氨酸和/或S-腺-L-甲硫氨酸在體內(nèi)的功能如下。
I)它抑制肝和動(dòng)脈中的脂肪積聚促進(jìn)脂類(lèi)代謝，且改善大腦、心臟和腎臟中的血液循環(huán)(J Hepatol. Jeon BR 等人，2001 Mar ；34(3) :395-401)。
2)它促進(jìn)消化、解毒和毒性物質(zhì)的排出和重金屬例如Pb的排出。
3)它可以以800-1，600mg/天的劑量被服用用作抗抑郁藥物(Am J Clin Nutr.Mischoulon D 等人，2002 Nov ；76(5) :1158S_61S)。
4)它增強(qiáng)肝功能(FASEB J. Mato JM.，2002 Jan ；16(1) :15-26)并特別對(duì)酒精引起的肝臟疾病有效(Cochrane Database Syst Rev. , Rambaldi A. ,2001 ； (4) :CD002235)。
5)它對(duì)骨與關(guān)節(jié)疾病具有抗炎作用且促進(jìn)關(guān)節(jié)恢復(fù)(ACP J Club. Sander O.,2003Jan-Feb ；138(1) :21，J Fam Pract.，Soeken KL 等人，2002 May ；51 (5) :425-30)。
6)它是頭發(fā)的必需營(yíng)養(yǎng)成分。它給頭發(fā)提供營(yíng)養(yǎng)從而阻止脫發(fā)(AudiolNeurootol. , Lockwood DS 等人，2000Sep_0ct，5(5) :263-266)。
甲硫氨酸可以通過(guò)化學(xué)或生物學(xué)方法合成以應(yīng)用于飼料、食品和藥物中。
在化學(xué)合成中，甲硫氨酸主要通過(guò)5-(β_甲基巰基乙基)_乙內(nèi)酰脲的水解來(lái)制備?；瘜W(xué)合成的甲硫氨酸具有只能制備得到L-型和D-型混合形式的缺點(diǎn)。
在生物學(xué)合成中，甲硫氨酸通過(guò)使用甲硫氨酸合成中涉及的蛋白質(zhì)的方法來(lái)制備。L-甲硫氨酸是通過(guò)在埃希桿菌屬中由基因例如metA、metB、metC、metE和metH表達(dá)的酶的作用從高絲氨酸中生物合成的。特別是，metA是編碼高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶的基因，而高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶是甲硫氨酸生物合成中所需要的第一個(gè)酶，而且它將高絲氨酸轉(zhuǎn)化為O-琥珀酰L-高絲氨酸。O-琥珀酰高絲氨酸裂解酶或metB基因編碼的胱硫醚Y合酶將O-琥珀酰L-高絲氨酸轉(zhuǎn)化為胱硫醚。metC基因編碼的胱硫醚β裂解酶將胱硫醚轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-高半胱氨酸。MetE編碼不依賴(lài)鈷胺素的甲硫氨酸合酶，且metH編碼依賴(lài)鈷胺素的甲硫氨酸合酶，它們兩者都將L-高半胱氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-甲硫氨酸。這時(shí)，metF編碼的5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶和glyA編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶共同作用以合成N (5)-甲基四氫葉酸，提供L-甲硫氨酸合成必需的甲基基團(tuán)。[0014]L-甲硫氨酸通過(guò)上述酶的一連串有機(jī)反應(yīng)來(lái)合成。以上蛋白質(zhì)或影響以上蛋白質(zhì)的其它蛋白質(zhì)的遺傳修飾可能導(dǎo)致L-甲硫氨酸合成的增加。例如，日本專(zhuān)利特許公開(kāi)號(hào)2000/139471描述了一種使用基因組上缺失thrBC和metj基因，而metBL過(guò)表達(dá)以及metK被泄漏突變體取代的埃希桿菌屬制備L-甲硫氨酸的方法。此外，美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)US2003/0092026A1描述了一種使用metD(L-甲硫氨酸合成抑制劑)敲除的屬于棒狀桿菌屬的微生物的方法。美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)US2002/0049305描述了一種通過(guò)增加5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(metF)的表達(dá)來(lái)增加L-甲硫氨酸產(chǎn)生的方法。
生物學(xué)方法制備的甲硫氨酸是L-類(lèi)型的，這是它的優(yōu)點(diǎn)但是產(chǎn)量非常小。這是因?yàn)榧琢虬彼嵘锖铣赏緩骄哂蟹浅＞o密的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)。一旦甲硫氨酸合成至一定水平，最終產(chǎn)物甲硫氨酸就會(huì)抑制metA基因的轉(zhuǎn)錄，metA基因編碼甲硫氨酸生物合成起始的主要蛋白質(zhì)。metA基因本身的過(guò)表達(dá)不能增加甲硫氨酸的產(chǎn)生，這是因?yàn)閙etA基因被轉(zhuǎn)錄期的甲硫氨酸所抑制然后在翻譯期被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解(Dvora Biran, Eyal Gur, LeoraGollan 和 Eliora Z. Ron ControI of methionine biosynthesis in Escherichia colibyproteolysis Molecular Microbiology (2000) 37 (6)，1436-1443)。因此，許多以前的專(zhuān)利集中在如何使metA基因從其反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)中解放出來(lái)(W0 2005/108561、W01403813)。·
美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)US2005/0054060A1描述了一種通過(guò)改良的胱硫醚合酶(0_琥珀酰高絲氨酸裂解酶)合成高半胱氨酸或甲硫氨酸的方法，這種胱硫醚合酶直接使用甲硫醇(CH3SH)或硫化氫(H2S)而不是半胱氨酸作為硫源。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知胱硫醚合酶在細(xì)胞中可以結(jié)合多種甲硫氨酸前體，因此產(chǎn)生很高水平的副產(chǎn)物。例如，有報(bào)道胱硫醚合酶通過(guò)O-琥珀酰高絲氨酸和高半胱氨酸的副反應(yīng)積聚了高水平的高羊毛硫氨酸(homolanthionin) (J. Bacteriol (2006) vol 188 :p609_618)。所以，胱硫醚合酶的過(guò)表達(dá)由于其副反應(yīng)的增加可以降低細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的效率。此外，此方法具有許多缺點(diǎn)。此方法使用具有副反應(yīng)和反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)代謝途徑。此方法還使用對(duì)細(xì)胞具有劇烈細(xì)胞毒性的H2S或CH3SH。因此甲硫氨酸產(chǎn)量比較小。
為了解決這些問(wèn)題，本發(fā)明者開(kāi)發(fā)了兩步法，包含通過(guò)大腸桿菌發(fā)酵制備L-甲硫氨酸前體的第一步；和通過(guò)酶反應(yīng)(PCT/KR2007/003650)轉(zhuǎn)化L-甲硫氨酸前體為L(zhǎng)-甲硫氨酸的第二步。這個(gè)兩步法可以解決以上問(wèn)題，例如硫化物的細(xì)胞毒性、甲硫氨酸和SAMe的反饋調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)酶(例如胱硫醚Y合酶、O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶和O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶)的分解中間產(chǎn)物。此外，與產(chǎn)生D-甲硫氨酸和L-甲硫氨酸混合形式的化學(xué)甲硫氨酸合成方法不同的是，此兩步法在僅選擇性生產(chǎn)L-甲硫氨酸上非常有效。
在此兩步法中，甲硫氨酸前體的產(chǎn)量是甲硫氨酸產(chǎn)量增加的關(guān)鍵因素之一。為了增加甲硫氨酸前體O-琥珀酰高絲氨酸的合成產(chǎn)量，強(qiáng)天冬氨酸激酶、高絲氨酸轉(zhuǎn)移酶和抗反饋的O-琥珀酰高絲氨酸轉(zhuǎn)移酶的良好組合是十分重要的。在上述背景中，本發(fā)明者制備了一種具有以下特征的生產(chǎn)O-琥珀酰高絲氨酸的微生物1)高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性是引入和增強(qiáng)的，其中高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性是抗甲硫氨酸反饋的；和2)天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性(EC2. 7. 2. 4或I. I. I. 3)是增強(qiáng)的。這個(gè)菌株能夠生產(chǎn)高濃度L-甲硫氨酸前體而與培養(yǎng)基中的甲硫氨酸濃度無(wú)關(guān)，且L-甲硫氨酸前體的生產(chǎn)可以顯著增加。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種制備L-甲硫氨酸前體的微生物和一種使用此微生物制備L-甲硫氨酸前體的方法。
更特別的是，本發(fā)明提供了一種能夠生產(chǎn)O-琥珀酰高絲氨酸具有以下特征的微生物和使用此菌株生產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的方法，所述的特征為1)高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性是引入和增強(qiáng)的，其中高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性是抗甲硫氨酸反饋的；和2)天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性(EC2. 7. 2. 4或I. I. I. 3)是增強(qiáng)的。


參考附圖可以更好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的應(yīng)用，其中
圖I是甲硫氨酸前體生產(chǎn)菌株的基因操作說(shuō)明圖。
圖2是生產(chǎn)甲硫氨酸的2步法的化學(xué)結(jié)構(gòu)說(shuō)明圖。
圖3是抗反饋metA基因表達(dá)的pMetA_C的示意圖。
具體實(shí)施方案
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種能夠生產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的具有下列特征的微生物1)高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性是引入和增強(qiáng)的，其中高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性是抗甲硫氨酸反饋的；和2)天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性(EC2. 7. 2. 4 或 I. I. I. 3)是增強(qiáng)的。
術(shù)語(yǔ)“L-甲硫氨酸前體”定義為甲硫氨酸特異性代謝途徑中一部分的代謝產(chǎn)物或可以衍生出這些代謝產(chǎn)物。特別是，如本文所用的L-甲硫氨酸前體是指O-琥珀酰高絲氨酸。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“L-甲硫氨酸前體生產(chǎn)菌株”是指能夠通過(guò)本發(fā)明的操作積聚L-甲硫氨酸前體的原核或真核微生物菌株。例如，此菌株可選自由埃希桿菌屬、歐文氏菌屬、沙雷氏菌屬、普羅威登斯菌屬、棒狀桿菌屬、假單胞桿菌屬、鉤端螺旋體屬、沙門(mén)氏菌屬、短桿菌屬、Hypomononas sp.、色素桿菌屬和諾卡氏菌屬微生物組成的組或真菌或酵母。優(yōu)選地，微生物埃希桿菌屬、棒狀桿菌屬、鉤端螺旋體屬和酵母可以用來(lái)生產(chǎn)O-琥珀酰高絲氨酸。更優(yōu)選地，可以使用埃希桿菌屬微生物，且最優(yōu)選地使用大腸桿菌(在下文中指“E. coli”)。
在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種L-甲硫氨酸前體生產(chǎn)菌株，其中參與天然O-琥珀酰高絲氨酸或O-乙酰高絲氨酸分解的基因被刪除或弱化而替代地引入和增強(qiáng)O-琥珀酰高絲氨酸合成中涉及的抗反饋的基因。本發(fā)明還選擇性提供了一種蘇氨酸生物合成途徑被阻斷或弱化以增強(qiáng)O-琥珀酰高絲氨酸生產(chǎn)的菌株。本發(fā)明還提供了一種天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶過(guò)表達(dá)或活性增強(qiáng)的菌株。本發(fā)明還提供了一種菌株，所述菌株中引入了能過(guò)表達(dá)且活性增強(qiáng)的與反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)無(wú)關(guān)的高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶并且天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶能過(guò)表達(dá)或活性增強(qiáng)。
更特別的是，本發(fā)明通過(guò)刪除參與L-甲硫氨酸前體分解的metB基因、參與蘇氨酸生物合成途徑中的thrB基因和調(diào)節(jié)L-甲硫氨酸前體生產(chǎn)基因轉(zhuǎn)錄的metj基因提供了一種L-甲硫氨酸前體生產(chǎn)菌株。本發(fā)明還通過(guò)敲除參與甲硫氨酸前體合成的天然metA或metX基因和引入抗反饋的metA提供了一種L-甲硫氨酸前體生產(chǎn)菌株。本發(fā)明還通過(guò)增強(qiáng)thrA基因編碼的蛋白質(zhì)的活性提供了一種L-甲硫氨酸前體生產(chǎn)菌株。
更優(yōu)選地，本發(fā)明還通過(guò)敲除天然的metA或metX基因、引入抗反饋metA基因和通過(guò)thrA基因的增強(qiáng)提供了一種L-甲硫氨酸前體生產(chǎn)菌株。在以前的專(zhuān)利(PCT/KR2007/003650)中引入和證實(shí)了 metA基因是抗反饋的。
在本發(fā)明中，如本文所用的“失活”涉及該基因的缺失或弱化。該基因的缺失是通過(guò)切掉該基因的區(qū)域或在染色體上引入一個(gè)特異性基因序列來(lái)修飾蛋白質(zhì)序列來(lái)完成的。在這方面術(shù)語(yǔ)“弱化”或“衰減”描述了微生物中相應(yīng)DNA編碼的一個(gè)或多個(gè)酶(蛋白質(zhì))細(xì)胞內(nèi)活性的降低或消失，例如通過(guò)修飾該基因的啟動(dòng)子區(qū)和5’ -UTR核苷酸序列或通過(guò)在該靶基因的ORF區(qū)上引入突變來(lái)降低該蛋白質(zhì)活性。通過(guò)弱化措施，該相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度一般降低至野生型蛋白質(zhì)的活性或濃度或在起始微生物中該蛋白質(zhì)活性或濃度 的 0-75%,0-50%,0-25%,0-10%^； 0-5%。
為了達(dá)到弱化，例如該基因的表達(dá)或該酶蛋白質(zhì)的催化性質(zhì)可以被降低或消除。這兩個(gè)措施可以任選組合。
基因表達(dá)的降低可以通過(guò)合適的培養(yǎng)、基因表達(dá)的信號(hào)結(jié)構(gòu)的遺傳修飾(突變)或還可通過(guò)反義RNA技術(shù)來(lái)進(jìn)行?；虮磉_(dá)的信號(hào)結(jié)構(gòu)是，例如阻遏物基因、激活劑基因、操縱子、啟動(dòng)子、弱化子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子和終止子。專(zhuān)家可以尋找到這方面的信息，特別是例如在 Jensen 和 Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58:191195(1998))、在 Carrier 和 Keasling(Biotechnology Progress 15:5864(1999))、Franch 和 Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3 :159164 (2000))中和在已知遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書(shū)中，例如Knippers的教科書(shū)(“Molecular Genetics”,第6版，1995)或 Winnacker 的教科書(shū)(“Genes and Clones”，1990)。
導(dǎo)致酶蛋白質(zhì)的催化性質(zhì)變化或降低的突變從現(xiàn)有技術(shù)中可以知道?？梢蕴岬降膶?shí)例是 Qiu 和 Goodman (Journal of Biological Chemistry 272 :86118617 (1997))、Yano等人(Proceedings ofthe National Academy ofSciences, USA 95 :55115515 (1998))、和Wente 和 Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266:20833 20839 (1991))的著作。綜述可以在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的公知教科書(shū)，例如Hagemann的教科書(shū)(“GeneralGenetics”，1986)中找到。
可能的突變是指轉(zhuǎn)變、易位、插入和缺失。根據(jù)氨基酸交換對(duì)酶活性的作用，涉及“錯(cuò)義突變”或無(wú)義突變?；蛑兄辽僖粋€(gè)堿基對(duì)的插入或缺失導(dǎo)致“移碼突變”，“移碼突變”導(dǎo)致加入錯(cuò)誤的氨基酸或過(guò)早中止翻譯。如果作為突變的結(jié)果在編碼區(qū)形成一個(gè)終止密碼子，這還導(dǎo)致翻譯的過(guò)早終止。多個(gè)密碼子的缺失通常導(dǎo)致該酶活性的完全喪失。關(guān)于這些突變產(chǎn)生的指導(dǎo)是現(xiàn)有技術(shù)并且可以在公知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書(shū)例如Knippers 的教科書(shū)(“Molecular Genetics”，第 6 版，1995) >ffinnacker 的教科書(shū)(“Genesand Clones”，1990)或 Hagemann 的教科書(shū)(“General Genetics”，1986)中找到。
基因中適合的突變，例如缺失突變，可以通過(guò)基因或等位基因置換整合至適合的菌株中。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)”描述了相應(yīng)DNA編碼的酶的細(xì)胞內(nèi)活性的增加。酶的細(xì)胞內(nèi)活性的增強(qiáng)可以通過(guò)該基因的過(guò)表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。靶基因的過(guò)表達(dá)可以通過(guò)修飾該基因的啟動(dòng)子區(qū)或5’ -UTR區(qū)的核苷酸序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。靶基因的過(guò)表達(dá)還可通過(guò)在染色體上引入該靶基因的額外拷貝、通過(guò)用含有帶有啟動(dòng)子的該靶基因的載體轉(zhuǎn)化宿主菌株、或通過(guò)引入可以增加該靶基因表達(dá)的突變來(lái)實(shí)現(xiàn)。酶的細(xì)胞內(nèi)活性的增強(qiáng)還可通過(guò)引入該靶基因ORF區(qū)的突變來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)增強(qiáng)措施，相應(yīng)蛋白質(zhì)活性或濃度一般增加了至少75%、100%、150%、200%、300%、400%或 500%，最多至 1000%或 2000%，以野生型蛋白質(zhì)或起始微生物中該蛋白質(zhì)的活性或濃度為基準(zhǔn)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，制備L-甲硫氨酸前體生產(chǎn)菌株的方法如下
在步驟I中，編碼例如胱硫 醚Y合酶、O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶或O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶的蛋白質(zhì)的基因在菌株中被刪除或弱化以累積L-甲硫氨酸前體例如O-琥珀酰高絲氨酸或O-乙酰高絲氨酸。
編碼胱硫醚Y合酶的基因表示為metB，編碼O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶的基因表示為metZ，和編碼O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶的基因表示為metY。編碼具有上述活性蛋白質(zhì)的基因通過(guò)大腸桿菌中的metB舉例說(shuō)明。該基因的基因組序列可以從以前報(bào)告(Blattner等人，Science 277:1453-1462(1997))中報(bào)導(dǎo)的大腸桿菌基因組序列(登記號(hào)AAC75876)中獲得。以上基因組序列還可從NCBI (國(guó)家生物技術(shù)信息中心)和DDBJ(日本DNA數(shù)據(jù)銀行)獲得。具有相同活性的其它基因通過(guò)來(lái)源于棒狀桿菌的metB和metY和來(lái)源于假單胞桿菌的metZ舉例說(shuō)明。
胱硫醚Y合酶或O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶或O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶具有如下反應(yīng)式所示的將O-琥珀酰高絲氨酸或O-乙酰高絲氨酸轉(zhuǎn)化為胱硫醚或高半胱氨酸的活性。因此，當(dāng)具有該活性的基因被刪除或弱化時(shí)，O-琥珀酰高絲氨酸或O-乙酰高絲氨酸在培養(yǎng)溶液中大量累積。
L-半胱氨酸+0-琥珀酰-L-高絲氨酸〈= > 琥珀酸+胱硫醚
L-半胱氨酸+0-乙酰-L-高絲氨酸〈= > 乙酸+胱硫醚
HS_+0-琥珀酰-L-高絲氨酸〈= > 琥珀酸+高半胱氨酸
HS_+0-乙酰-L-高絲氨酸〈= > 乙酸+高半胱氨酸
在步驟2中，步驟I中制備的菌株中編碼高絲氨酸激酶的thrB基因被刪除或弱化。thrB基因參與由高絲氨酸合成O-磷酸高絲氨酸，O-磷酸高絲氨酸隨后被thrC基因轉(zhuǎn)化為蘇氨酸。thrB基因缺失或弱化以使用細(xì)胞內(nèi)所有高絲氨酸來(lái)合成甲硫氨酸前體。
在步驟3中，刪除甲硫氨酸合成途徑中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子或使其弱化。參與甲硫氨酸合成的metA、metB、metC、metE和metF基因被反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)抑制。metj基因是大腸桿菌中的典型轉(zhuǎn)錄子調(diào)節(jié)子基因。為了使metA或metX基因過(guò)表達(dá)以合成甲硫氨酸前體，metj需要被消除。因此，如果metj基因在大腸桿菌中被消除，metA或metX基因表達(dá)通常是增加的，從而導(dǎo)致L-甲硫氨酸前體的大量產(chǎn)生。
以上步驟2和3可根據(jù)前體生產(chǎn)菌株被改進(jìn)或刪除。但是，為了增強(qiáng)埃希桿菌屬微生物中的前體生產(chǎn)途徑更優(yōu)選進(jìn)行這些步驟。
在步驟4中，引入抗反饋高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶，它介導(dǎo)甲硫氨酸生物合成途徑第一個(gè)步。metA是編碼具有高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的基因的通用名稱(chēng)?？狗答伕呓z氨酸O-琥珀酰活性是突變抗反饋metA基因的結(jié)果。PCT/US2007/009146公開(kāi)了制備抗反饋metA基因的方法。上述國(guó)際專(zhuān)利中含有的一般信息可以通過(guò)權(quán)利要求
包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明中，抗反饋metA 10基因編碼的氨基酸序列表示為SEQ ID NO14、metA 11基因編碼的蛋白質(zhì)表示為SEQ ID NO :16、metA 32基因編碼的表示為SEQ IDNO 18,metA 37基因編碼的表示為SEQ ID NO :20、metA 41基因編碼的表示為SEQ ID NO 22(PCT/US2007/009146)。此外，本發(fā)明包含GenBank登記號(hào)AP 004514的高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶肽，其在氨基酸位點(diǎn) 24、29、79、114、140、163、222、275、290、291、295、297、304、305或它們的組合上具有突變。
metA基因的引入或增強(qiáng)通過(guò)引入該基因或通過(guò)修飾該基因的啟動(dòng)子區(qū)和5’ -UTR的核苷酸序列或通過(guò)在該靶基因的ORF區(qū)引入突變來(lái)進(jìn)行。與反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)無(wú)關(guān)的突變metA基因的引入導(dǎo)致L-甲硫氨酸前體合成的增加而與培養(yǎng)基中甲硫氨酸的濃度無(wú)關(guān)。
此外，O-琥珀酰高絲氨酸生產(chǎn)可以通過(guò)在染色體上刪除天然metA基因然后在其上引入突變metA基因來(lái)進(jìn)一步增加。通過(guò)刪除met J基因而增強(qiáng)metA啟動(dòng)子使抗反饋metA 基因可以產(chǎn)生更多O-琥珀酰高絲氨酸。
在步驟5中，天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶是活性增強(qiáng)的以增加O-琥珀酰高絲氨酸前體，高絲氨酸的合成。thrA是編碼具有天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶活性的肽的通用名稱(chēng)。thrA活性的增強(qiáng)通過(guò)引入thrA基因上的突變或通過(guò)染色體上thrA基因的多種整合或通過(guò)引入含有thrA基因的質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行。
優(yōu)選地，天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶由來(lái)自于Unipix)數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)AP000666 (大腸桿菌thrA)的基因編碼。更優(yōu)選地，thrA基因編碼的氨基酸序列表示為具有氨基酸位點(diǎn)345突變的SEQ ID NO :29。thrA的修飾和增強(qiáng)通過(guò)引入thrA基因上的突變或還通過(guò)弓I入染色體上的靶基因或還通過(guò)弓I入處理的質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行。
L-甲硫氨酸前體O-琥珀酰高絲氨酸可以通過(guò)使用以上步驟I至步驟5的部分或全部方法在菌株中積聚。
產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的菌株可以從產(chǎn)L-賴(lài)氨酸、L-蘇氨酸或L-異亮氨酸的菌株中制備。優(yōu)選地，可以通過(guò)使用產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株制備。使用此菌株，高絲氨酸的合成更為容易并且使得甲硫氨酸前體的產(chǎn)量增加。所以，甲硫氨酸前體可以通過(guò)刪除或弱化參與蘇氨酸生物合成途徑的基因然后metA或metY或metZ基因使用產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株來(lái)積聚。更優(yōu)選首先刪除或弱化thrB基因然后metB、metY或metZ來(lái)合成甲硫氨酸前體。
本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株”是指能夠在體內(nèi)生產(chǎn)L-蘇氨酸的原核或真核的微生物菌株。例如，該菌株可以包括屬于埃希桿菌屬、歐文氏菌屬、沙雷氏菌屬、普羅威登斯菌屬、棒狀桿菌屬和短桿菌屬的產(chǎn)L-蘇氨酸的微生物菌株。其中，優(yōu)選埃希桿菌屬微生物，更優(yōu)選大腸桿菌。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用CJM002，它是從TF4076(KFCC 10718，韓國(guó)專(zhuān)利號(hào)92-8365)即產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌突變菌株轉(zhuǎn)化的產(chǎn)L-蘇氨酸和不依賴(lài)L-甲硫氨酸的菌株。TF4076具有甲硫氨酸需求，且對(duì)甲硫氨酸類(lèi)似物(例如α-氨基羥基戊酸，AHV)、賴(lài)氨酸類(lèi)似物(例如S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸，AEC)和異亮氨酸類(lèi)似物(例如α-氨基丁酸)有抗性。TF4076不能在體內(nèi)合成甲硫氨酸因?yàn)槠涫蔷哂屑琢虬彼嵝枨蟮木?。為了使用這種菌株作為本發(fā)明的無(wú)甲硫氨酸需求的甲硫氨酸前體生產(chǎn)菌株，本發(fā)明者通過(guò)使用NTG人工突變制備了無(wú)甲硫氨酸需求的產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株大腸桿菌CJM002。大腸桿菌CJM002命名為大腸桿菌MF001且于2004年4月9日保存于KCCM(韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心，Eulim Buld. Hongje-l-Dong, Seodaemun-ku, Seoul, 361-221, Korea)(登記號(hào)KCCM-10568)。在本發(fā)明中，刪除了大腸桿菌CJM002中的metB、thrB、metJ和metA基因，然后引入抗反饋metA基因。使用大腸桿菌CJM002構(gòu)建獲得的產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的菌株命名為CJM-AlI。CJM-AlI菌株用thrA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，命名為CJM-AlI (pthrA (M) -CL)。通過(guò)以上方法制備的大腸桿菌CJM-All即產(chǎn)O-琥珀酰高絲氨酸的菌株于2008年I月23日保存，登記號(hào)為KCCM10922P。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用公開(kāi)于PCT/KR2005/00344的產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株FTR2533。FTR2533來(lái)源于大腸桿菌TFR7624，大腸桿菌TFR7624來(lái)源于大腸桿菌登記號(hào)KCCM10236。大腸桿菌登記號(hào)KCCM 10236來(lái)源于大腸桿菌TF4076。大腸桿菌登記號(hào)KCCM 10236能夠表達(dá)較高水平的催化從PEP形成草酰乙酸鹽的ppc基因和從天冬氨酸生物合成蘇氨酸必需的酶例如thrA :天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶、thrB :高絲氨酸激酶、thrC :蘇氨酸合酶，從而促使L-蘇氨酸產(chǎn)量的增加。大腸桿菌FTR7624(KCCM10538)具有失活的tyrR基因，它能阻遏L-蘇氨酸生物合成必需的tyrB基因的表達(dá)。大腸桿菌FTR2538 (KCCM10541)是具有失活的galR基因的產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株，它是產(chǎn)L-蘇氨酸大腸桿菌突變菌株。
在本發(fā)明中，大腸桿菌FTR2533的metB、thrB、metj和metA基因被刪除，然后引入抗反饋metA基因。使用大腸桿菌FTR2533構(gòu)建獲得的產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的菌株命名為CJM2-A11。CJM2-A11 菌株用 thrA 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，命名為 CJM2-A11 (pthrA (M) -CL)。
大腸桿菌CJM2-All(pthrA(M)-CL)于 2008 年 2 月 12 日保存，登記號(hào) KCCM10924P。
另一方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的方法，此方法包含a)發(fā)酵以上所述的微生物山)富集培養(yǎng)基中或微生物中L-甲硫氨酸前體；和c)分離L-甲硫氨酸前體。
以上制備的產(chǎn)L-甲硫氨酸前體的菌株的培養(yǎng)可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的適合的培養(yǎng)基和條件來(lái)進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知培養(yǎng)方法可以根據(jù)所選擇的菌株容易地調(diào)整使用。例如，培養(yǎng)方法包括但是不限于分批、連續(xù)培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)。大量培養(yǎng)方法描述于以下參考文獻(xiàn)J_es Μ· Lee的“Biochemical Engineering”，Prentice-HallInternational Editions, pp 138-176。
對(duì)于具體的菌株培養(yǎng)基必須滿(mǎn)足培養(yǎng)條件。大量微生物培養(yǎng)基描述于以下參考文獻(xiàn)American Society for Bacteriology 的“Manual of Methods for GeneralBacteriology, Washington D. C. ,USA, 1981。這些培養(yǎng)基包括多種碳源、氮源和微量元素。碳源的實(shí)例為碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉、纖維素；脂肪例如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸例如軟脂酸、硬脂酸和亞油酸；醇類(lèi)例如丙三醇和乙醇；和有機(jī)酸例如乙酸。這些化合物之一或它們的混合物可以用作碳源。氮源的實(shí)例為有機(jī)氮源例如蛋白胨、酵母提取物、肉湯、麥芽提取物、玉米漿(CSL)和大豆粉以及無(wú)機(jī)氮源例如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。這些化合物之一或它們的混合物可以用作氮源。本文的培養(yǎng)基可以額外包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和相應(yīng)含鈉鹽作為磷酸鹽源。培養(yǎng)基還可包括金屬鹽例如硫酸鎂或硫酸亞鐵。此外，氨基酸、維生素和適合的前體也可加入。培養(yǎng)基或前體可分批或連續(xù)加入至培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)基的pH可在培養(yǎng)期間以適當(dāng)方式加入化合物例如氫氧化胺、氫氧化鉀、氨、磷酸和硫酸來(lái)調(diào)節(jié)。在培養(yǎng)期間使用防泡劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可抑制氣泡的產(chǎn)生。為了維持培養(yǎng)液的好氣條件，可注入氧氣或含氧氣體(例如空氣)至培養(yǎng)液中。培養(yǎng)液的溫度通常為20-45°C，優(yōu)選25-40°C。培養(yǎng)周期可持續(xù)至L-甲硫氨酸前體的生產(chǎn)達(dá)到預(yù)想水平，優(yōu)選培養(yǎng)時(shí)間為10-160小時(shí)。
實(shí)施例
本發(fā)明的實(shí)踐和目前優(yōu)選實(shí)施方案如以下實(shí)施例所示，它們用于說(shuō)明但是不解釋為本發(fā)明的限制。需要理解本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮本 說(shuō)明書(shū)時(shí)可在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進(jìn)行改良和提聞。
實(shí)施例I :甲硫氨酸前體生產(chǎn)菌株的構(gòu)建
<l~l>metB某閔的缺失
為了在大腸桿菌中刪除編碼胱硫醚合酶的metB基因，進(jìn)行FRT- —步PCR刪除(PNAS (2000) vol 97 p6640-6645)。SEQ ID NO 1 和 NO 2 的引物用于 PCR 使用 pKD3 載體(PNAS(2000) vol 97 p6640-6645)作為模板，獲得缺失基因盒的構(gòu)建。PCR如下進(jìn)行30圈的94°C變性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸I分鐘。
PCR產(chǎn)物進(jìn)行I. 0%瓊脂糖凝膠電泳，隨后純化I. 2kbp條帶獲得的DNA。將回收的DNA片段電穿孔至用pKD46載體(PNAS (2000) vol 97 p6640-6645)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(K12)W3110中。在電穿孔前，用pKD46轉(zhuǎn)化的W3110在30°C含有100μ g/L氨芐西林和5mM L-阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_達(dá)到O. 6。然后培養(yǎng)的菌株用無(wú)菌蒸餾水洗兩遍并用10%甘油再洗一遍。電穿孔法在2500V進(jìn)行?；厥盏木坑诤?5 μ g/L氯霉素的LB平板培養(yǎng)基上，隨后37°C培養(yǎng)過(guò)夜。然后，選擇顯示氯霉素抗性的菌株。
使用所選擇的菌株作為模板用引物No I和2在同樣條件下進(jìn)行PCR。metB基因的缺失通過(guò)在I. O %瓊脂糖凝膠上確認(rèn)I. 2kb大小基因來(lái)證實(shí)。然后用PCP20載體(PNAS(2000) vol 97 p6640-6645)轉(zhuǎn)化菌株，并在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)以除去氯霉素標(biāo)記基因。最終構(gòu)建metB敲除菌株，其中通過(guò)相同條件下PCR metB基因大小在I. 0%瓊脂糖凝膠上降至150bp。構(gòu)建的菌株命名為W3-B。
<l-2>thrB基因的缺失
本發(fā)明者試圖通過(guò)刪除編碼高絲氨酸激酶的thrB基因從高絲氨酸中增加O-琥珀酰高絲氨酸合成。尤其是，當(dāng)蘇氨酸生產(chǎn)菌株用作生產(chǎn)O-琥珀酰高絲氨酸的宿主時(shí)，thrB基因的刪除是必需的，這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)此基因?qū)⒏呓z氨酸至O-磷酰高絲氨酸的轉(zhuǎn)化十分強(qiáng)烈。為了在以上構(gòu)建的W3-B菌株中刪除thrB基因，以如上所述刪除metB基因的同樣方法進(jìn)行FRT —步PCR刪除。
為了構(gòu)建 thrB 缺失基因盒，使用 pKD4 載體(PNAS (2000) vol 97 p6640-6645)作為模板使用引物SEQ ID NO 3和NO 4如下進(jìn)行PCR 30圈的94°C變性30秒、55°C退火30秒、72°C延伸I分鐘。PCR產(chǎn)物在I. 0%瓊脂糖凝膠上電泳，隨后純化從I. 6kbp條帶獲得的DNA?；厥盏腄NA片段電穿孔轉(zhuǎn)至使用pKD46載體轉(zhuǎn)化的W3-B菌株中?；厥盏木晖坑诤?0 μ g/L卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基上，隨后37 °C培養(yǎng)過(guò)夜。然后，選擇顯示抗性的菌株。
使用所選擇的菌株作為模板用引物SEQ ID NO 3和NO 4在與上面相同的條件下進(jìn)行PCR。ThrB基因的缺失通過(guò)在I. 0%瓊脂糖凝膠上選擇大小為I. 6kb的菌株來(lái)確認(rèn)。然后用pCP20載體轉(zhuǎn)化菌株且在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。最終構(gòu)建thrB敲除菌株，其中通過(guò)相同條件下PCR thB基因大小在1.0%瓊脂糖凝膠上降至150kb。確認(rèn)除去了卡那霉素標(biāo)記。構(gòu)建的菌株命名為W3-BT。
<l-3>metT某閔的缺失
為了刪除與甲硫氨酸前體合成相關(guān)的metA基因的調(diào)節(jié)子基因metj基因，以用來(lái)刪除metB基因的相同方法進(jìn)行FRT —步PCR刪除。
為了構(gòu)建metj缺失基因盒，使用引物SEQ ID NO :5和NO :6如下進(jìn)行PCR :30圈的94°C變性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸I分鐘。
PCR產(chǎn)物在I. 0%瓊脂糖凝膠上電泳，隨后純化從I. 2kbp條帶獲得的DNA?；厥盏腄NA片段電穿孔至使用pKD46載體轉(zhuǎn)化的W3-BT菌株中?；厥盏木晖坑诤新让顾氐腖B平板培養(yǎng)基上，隨后37°C培養(yǎng)過(guò)夜。然后，選擇顯示抗性的菌株。
使用所選擇的菌株作為模板用引物SEQ ID NO 7和NO 8在與上面相同的條件下·進(jìn)行PCR。metj基因的缺失通過(guò)在I. O %瓊脂糖凝膠上確認(rèn)I. 6kb大小的基因來(lái)證實(shí)。然后用pCP20載體轉(zhuǎn)化菌株且在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。最終構(gòu)建metj敲除菌株，其中通過(guò)相同條件下PCR metj基因大小在1.0%瓊脂糖凝膠上降至600kb并且確認(rèn)除去了菌株的氯霉素標(biāo)記。構(gòu)建的菌株命名為W3-BTJ。
<l-4>metA某閔的缺失
為了在染色體上引入抗反饋metA基因，刪除W3-BTJ菌株中的真實(shí)染色體metA基因。為了刪除metA基因，進(jìn)行FRT—步PCR刪除。
為了構(gòu)建metA缺失基因盒，使用引物SEQ ID NO :9和NO : 10如下進(jìn)行PCR :30圈的94°C變性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸I分鐘。
PCR產(chǎn)物在I. 0%瓊脂糖凝膠上電泳，隨后純化從I. 2kbp條帶獲得的DNA。回收的DNA片段電穿孔至使用pKD46載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3-BTJ菌株中?；厥盏木晖坑诤新让顾氐腖B平板培養(yǎng)基上，隨后37 °C培養(yǎng)過(guò)夜。然后，選擇顯示抗性的菌株。
使用所選擇的菌株作為模板用引物SEQ ID NO :9和NO :10在與上面相同的條件下進(jìn)行PCR。metA基因的缺失通過(guò)在I. O %瓊脂糖凝膠上確認(rèn)I. Ikb大小的基因來(lái)證實(shí)。然后用pCP20載體轉(zhuǎn)化菌株且在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。最終構(gòu)建metA敲除菌株，其中通過(guò)相同條件下PCRmetA基因大小在I. 0%瓊脂糖凝膠上降至lOOkb。確認(rèn)除去了氯霉素標(biāo)記。構(gòu)建的菌株命名為W3-BTJA。
<1~5>引入抗反饋metA基因
為了增加L-甲硫氨酸前體O-琥珀酰高絲氨酸的生產(chǎn)，進(jìn)行編碼高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶的抗反饋metA基因的過(guò)表達(dá)。PCT/US2007/009146公開(kāi)了制備抗反饋metA基因的方法和其活性。
抗反饋metA 10基因的序列表示為SEQ ID NO 13和該基因編碼的氨基酸序列表不為SEQ ID NO 14o metA 11基因的序列表不為SEQ ID NO : 15和該基因編碼的氣基酸序列表不為SEQ ID NO 16o metA 32基因的序列表不為SEQ ID NO 17和該基因編碼的氣基酸序列表不為SEQ ID NO 18o metA 37基因的序列表不為SEQ ID NO :19和該基因編碼的氣基Ife序列表不為SEQ ID NO :20。metA41基因的序列表不為SEQ ID N0:21和該基因編碼的氨基酸序列表示為 SEQ ID NO :22(PCT/US2007/009146)。
使用以上基因作為模板使用引物SEQ ID N0:11和N0:12如下進(jìn)行PCR:25圈的94°C變性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸2分鐘。[0091]PCR產(chǎn)物在I. 0%瓊脂糖凝膠上電泳，隨后純化從I. 2kbp條帶獲得的DNA。分離DNA片段后，用限制性?xún)?nèi)切酶SmaI斷裂載體pCL1920且連接至被分離的DNA片段上。大腸桿菌用載體轉(zhuǎn)化且在含有50 μ g/L壯觀霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。構(gòu)建的載體如圖3中所示。
載體電穿孔至W3-BTJA菌株中并且該菌株的生產(chǎn)能力使用錐形瓶培養(yǎng)按照實(shí)施例2-1所描述的進(jìn)行檢測(cè)，基于野生型菌株的O-琥珀酰高絲氨酸的生產(chǎn)率為100 %，檢測(cè)改良菌株的O-琥珀酰高絲氨酸的生產(chǎn)率。作為結(jié)果，所有改良菌株的O-琥珀酰高絲氨酸的生產(chǎn)率比野生型菌株顯著增加了，特別是metA ll、metA 10和metA 32顯示最高效的生產(chǎn)率。
表I. IOOmM甲硫氨酸存在下突變metA的反饋抗性
權(quán)利要求
1.一種能制備O-琥珀酰高絲氨酸的由埃希桿菌屬產(chǎn)生的微生物，所述微生物的特征為1)高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶EC2. 3. I. 46活性被引入并增強(qiáng)，其中所述高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性對(duì)甲硫氨酸具有抗反饋抑制性，并且所述高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶的肽是SEQ ID NO 14、16、18、20或22;2)天冬氨酸激酶EC2.7.2.4或高絲氨酸脫氫酶ECl. I. I. 3活性被增強(qiáng)；以及3)胱硫醚Y合酶或O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶被弱化或失活。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其中所述天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶是SEQIDNO 29。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其中該微生物由產(chǎn)L-蘇氨酸、L-異亮氨酸或L-賴(lài)氨酸的菌株產(chǎn)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其中該微生物是大腸桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其中高絲氨酸激酶被弱化或失活。
6.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其中甲硫氨酸合成途徑中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子被弱化或失活。
7.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其中天然高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性或天然高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性被弱化或失活。
8.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其中編碼胱硫醚Y合酶的metB基因、編碼高絲氨酸激酶的thrB基因、和metA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子metj基因被弱化或失活。
9.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其中所述微生物由產(chǎn)蘇氨酸的菌株大腸桿菌MFOOl產(chǎn)生，所述大腸桿菌MF001的登記號(hào)為KCCM 10568，所述的大腸桿菌MF001不依賴(lài)甲硫氨酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其中所述微生物由產(chǎn)蘇氨酸的菌株大腸桿菌FTR2533產(chǎn)生，所述大腸桿菌FTR2533的登記號(hào)為KCCM 10541。
11.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其中所述微生物是產(chǎn)O-琥珀酰高絲氨酸的菌株大腸桿菌CJM-AlI，所述大腸桿菌CJM-AlI的登記號(hào)為KCCM 10922P。
12.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的微生物，其中所述微生物是產(chǎn)O-琥珀酰高絲氨酸的菌株大腸桿菌CJM2-A11，所述大腸桿菌CJM2-A11的登記號(hào)為KCCM 10924P。
13.一種制備O-琥珀酰高絲氨酸的方法，該方法包括a)發(fā)酵根據(jù)權(quán)利要求
I至12中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求
所述的微生物；b)在培養(yǎng)基中或微生物體內(nèi)富集O-琥珀酰高絲氨酸；和c)分離O-琥珀酰高絲氨酸。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及制備L-甲硫氨酸前體O-琥珀酰高絲氨酸的微生物，所述微生物的特征為1)高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性(EC2.3.1.46)被引入并增強(qiáng)，其中所述高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性對(duì)甲硫氨酸具有抗反饋抑制性；和2)天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性(EC2.7.2.4或1.1.1.3)被增強(qiáng)，以及使用該微生物制備L-甲硫氨酸前體的方法。
文檔編號(hào)C12N1/21GKCN101555464 B發(fā)布類(lèi)型授權(quán) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N 200910131576
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2009年4月7日
發(fā)明者嚴(yán)惠媛, 張真淑, 徐昌一, 李漢珍, 申容旭, 羅光鎬, 許仁庚, 趙英郁, 金喆河, 金素影 申請(qǐng)人:Cj第一制糖株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專(zhuān)利引用 (4),