專利名稱:生物催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和微生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其涉及一種生物催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法。
背景技術(shù)：
生物催化是利用酶或微生物細(xì)胞催化進(jìn)行某種化學(xué)反應(yīng)的過程，具有專一性強(qiáng)、 催化效率高、環(huán)境友好、操作條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。與水相中的生物催化反應(yīng)相比，非水相生物催化有其獨(dú)特的優(yōu)越性。但傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑通常會(huì)限制酶的活性和選擇性，且會(huì)造成大量工業(yè)污染。
離子液體(Ionic liquids, ILs)作為新型綠色溶劑，是由有機(jī)陽離子與無機(jī)陰離子或有機(jī)陰離子構(gòu)成的鹽類，在室溫或較低溫(< 100°c )下呈液態(tài)，具有可忽略的蒸汽壓、 高熱穩(wěn)定性、高化學(xué)穩(wěn)定性及對(duì)許多化合物具有良好的溶解性等特點(diǎn)，作為生物催化反應(yīng)介質(zhì)表現(xiàn)出許多優(yōu)越性能，近年來引起廣泛重視。
2000年，Cull等首次報(bào)道了離子液體1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([bmim] [PF6])/水雙相體系中Iihodococcus R312細(xì)胞催化1，3_ 二氰基苯水解生成3-氰基苯酰胺反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)[bmim] [Pig對(duì)細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于甲苯等有機(jī)溶劑(Cull SG, et al. Biotechnol Bioeng 2000,69(2) :227-233)。隨后，有關(guān)離子液體中生物催化反應(yīng)的報(bào)道日漸增多，大部分研究表明，酶或微生物整細(xì)胞在離子液體中具有較高的活性、選擇性及穩(wěn)定性(Manpreet S, et al. J Mol Catal B =Enzym 2009,56 :294-299 ；He JY, et al.Process Biochem2009,44 :316-321)。
公開號(hào)為CN101319236A的中國(guó)專利申請(qǐng)中公開了一種以選擇性羰基還原酶產(chǎn)生菌為出發(fā)菌株，在水/離子液體兩相體系中，以潛手性酮為底物還原制備相應(yīng)手性醇，提高了反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率、濃度和對(duì)映體過量值，加快了反應(yīng)的進(jìn)程。
白樺脂酸(betulinic acid)是非常有價(jià)值的天然化合物，它具有抗瘧性、抗炎性和抗腫瘤活性，尤其在抗艾滋病活性及抗各種腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞毒性方面可與一些臨床用藥相比擬，被視為最有潛力的新型藥物制劑。目前，白樺脂酸的獲得多以自然界中豐富的白樺脂醇為前體，經(jīng)過化學(xué)方法合成，雖然產(chǎn)率較高，但普遍存在操作復(fù)雜、污染大、成本高、安全性低等問題，限制了其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。微生物轉(zhuǎn)化通過微生物整體細(xì)胞中復(fù)雜的特異性催化酶系對(duì)天然活性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，廣泛應(yīng)用于藥物前體化合物的轉(zhuǎn)化、生物催化的不對(duì)稱合成、新藥開發(fā)、藥物代謝體外模型預(yù)測(cè)等領(lǐng)域。探索以白樺脂醇為前體通過微生物催化途徑合成白樺脂酸已成為目前研究重點(diǎn)。
公開號(hào)為CN101457250A的中國(guó)專利申請(qǐng)中已經(jīng)篩選獲得一株黃綠密環(huán)菌 (Armillaria luteo-virens Sacc) ZJUQH，在水相體系中能催化白樺脂醇合成白樺脂酸，并利用響應(yīng)面方法進(jìn)一步優(yōu)化了發(fā)酵條件。由于有機(jī)相的底物溶液在水相體系中溶解度不高，不但影響酶對(duì)底物的催化作用，而且對(duì)微生物細(xì)胞存在一定毒害，導(dǎo)致前期實(shí)驗(yàn)獲得的菌株和發(fā)酵條件催化白樺脂醇合成白樺脂酸的產(chǎn)率仍較低，且轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間很長(zhǎng)。為此，對(duì)生物轉(zhuǎn)化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法還有待進(jìn)一步的改進(jìn)，以期提高白樺脂酸的轉(zhuǎn)化得率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種生物催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法，利用綠色溶劑離子液體或者離子液體與其它溶劑組成的兩相體系替代傳統(tǒng)的水相體系作為黃綠密環(huán)菌ZJUQH 催化白樺脂醇合成白樺脂酸的反應(yīng)介質(zhì)，將白樺脂醇生物轉(zhuǎn)化成白樺脂酸，具有操作簡(jiǎn)單、 產(chǎn)物易于分離、轉(zhuǎn)化條件溫和、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化時(shí)間短、安全性高的特點(diǎn)。
本發(fā)明所使用的黃綠蜜環(huán)菌(Armillarialuteo-virens Sacc.) ZJUQHCGMCC No. 1884，于2006年12月08日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 1884，其獲取、培養(yǎng)方法和形態(tài)在中國(guó)發(fā)明專利CN200610155189. 7中有詳細(xì)描述。
一種生物催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法，包括以下步驟
(1)將黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH經(jīng)過活化和種子培養(yǎng)后得到種子培養(yǎng)液，再經(jīng)冷凍離心得到黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞；
(2)在離子液體或含離子液體的兩相體系中加入黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，得到預(yù)培養(yǎng)體系；
(3)向預(yù)培養(yǎng)體系中加入白樺脂醇溶液，于25°C 30°C發(fā)酵培養(yǎng)6小時(shí) M小時(shí)得到轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液；
(4)轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液經(jīng)后處理得到白樺脂酸；
其中，所述的白樺脂醇用量以每升離子液體或含離子液體的兩相體系計(jì)為 15mg 150mgo
離子液體作為生物催化反應(yīng)的溶劑，應(yīng)用模式通常有純?nèi)軇w系、作為水的共溶劑、與其他有機(jī)溶劑組成兩相體系或多相體系。針對(duì)具體的生物催化反應(yīng)需要選擇合適的離子液體應(yīng)用模式，本發(fā)明根據(jù)白樺脂醇生物轉(zhuǎn)化得到白樺脂酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的特點(diǎn)，選擇合適的反應(yīng)體系，來提高轉(zhuǎn)化效率，縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間。
所述的含離子液體的兩相體系為離子液體與正己烷的混合溶劑或者離子液體與磷酸緩沖溶液的混合溶劑，優(yōu)選離子液體與正己烷的混合溶劑。
所述的磷酸緩沖溶液采用本領(lǐng)域常規(guī)的配制方法進(jìn)行配制即可。
兩相體系中合適的離子液體濃度能增強(qiáng)酶的活性和選擇性，因此，所述的含離子液體的兩相體系中離子液體的體積百分濃度優(yōu)選為3% 98%，進(jìn)一步優(yōu)選為40% 60%，最優(yōu)選50%。
氧化還原酶的催化通常需要輔酶，微生物細(xì)胞中含有可催化氧化還原反應(yīng)的多種脫氫酶和輔酶，用微生物整細(xì)胞作為生物催化劑可省去酶的分離純化步驟，同時(shí)不需要添加輔酶再生系統(tǒng)。然而，微生物細(xì)胞中的輔酶含量有限，添加共基質(zhì)有助于輔酶的回收利用。因此，可在所述的兩相體系中添加共基質(zhì)，每升離子液體或含離子液體的兩相體系中共基質(zhì)的添加量為0. 05mol 0. Imol。
其中，所述的共基質(zhì)選自葡萄糖、乙醇、正丁醇、甘油、蔗糖、異丙醇中的一種。
所述的離子液體選自1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM]BF4)、1_ 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([BMIM]Pig、l-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([EMIM]BF4)、 1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([OMIM]PF6)中的一種。可直接采用市售產(chǎn)品，如上海成捷化學(xué)有限公司生產(chǎn)的純度> 99%的離子液體。
步驟(3)中，所述的白樺脂醇溶液為白樺脂醇的二甲基亞砜溶液，即溶劑為二甲基亞砜，其中的白樺脂醇濃度優(yōu)選為7. 5mg/mL ；白樺脂醇用量?jī)?yōu)選以每升離子液體或含離子液體的兩相體系計(jì)為75mg。
所述的白樺脂醇可選用根據(jù)公開號(hào)為CN1013^201A中國(guó)專利申請(qǐng)中記載的從白樺樹皮中提取得到白樺脂醇的方法而自行提取的白樺脂醇，純度一般為90%，相比購(gòu)買高純度白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)樣品作為催化底物更具現(xiàn)實(shí)意義，不但可以降低生產(chǎn)成本，還可以實(shí)現(xiàn)資源的綜合利用。
步驟(3)中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)溫度優(yōu)選為^°C，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為18小時(shí)，一般可在轉(zhuǎn)速180 220r/min (優(yōu)選200r/min)的搖床上進(jìn)行培養(yǎng)。
步驟(1)中，活化所用的斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，其原料質(zhì)量百分比組成為馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂3% ；所述的活化溫度為25°C 30°C，活化時(shí)間為4天 6天。
種子培養(yǎng)所用的種子培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，其原料質(zhì)量百分比組成為馬鈴薯20%，葡萄糖2%，余量為水，pH自然；所述的種子培養(yǎng)溫度為25°C 30°C，培養(yǎng)時(shí)間為3天，一般在轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。
將活化后的黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH制成黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液接入種子培養(yǎng)基，黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液中孢子濃度為1 X IO6個(gè)/毫升 1 X IO7個(gè)/毫升，種子培養(yǎng)基與接入的黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液的體積比為10 30。
步驟O)中，所述的黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞的用量以每升離子液體或含離子液體的兩相體系計(jì)為50g 400g，優(yōu)選以每升離子液體或含離子液體的兩相體系計(jì)為300g ； 所述的預(yù)培養(yǎng)條件為在25°C 30°C培養(yǎng)5分鐘 15分鐘，優(yōu)選培養(yǎng)lOmin，一般可在轉(zhuǎn)速180 220r/min (優(yōu)選200r/min)搖床上進(jìn)行培養(yǎng)。
步驟(4)中，所述的后處理包括將轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理得到上清液，調(diào)節(jié)pH至3 4，乙酸乙酯萃取后得到萃取液，經(jīng)濃縮得到白樺脂酸。調(diào)節(jié)pH值時(shí)可采用通用的酸、堿，如氫氧化鈉、鹽酸等。
本發(fā)明方法中白樺脂醇、白樺脂酸含量同步檢測(cè)方法為步驟⑷中轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液經(jīng)后處理，用甲醇定容于IOml容量瓶，采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC) 檢測(cè)所得物中白樺脂醇、白樺脂酸的含量。RP-HPLC色譜條件色譜柱為Diamonsil C18 (250mmX4. 6mm, 5 μ m)；流動(dòng)相為乙腈/水(體積比)=91/9 ；流速1. OmL/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)210. Inm ；柱溫25°C ；進(jìn)樣量10 μ 1 ；跑樣時(shí)間30 45min。
本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明選擇離子液體或含離子液體的兩相非水相體系用于微生物整細(xì)胞催化白樺脂醇合成白樺脂酸，與采用普通水相體系相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)離子液體或含離子液體的兩相體系有利于提高轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)物得率，白樺脂酸的產(chǎn)率可以達(dá)到12. 17%以上，相比普通水相體系提高了 30. 58% ； (2)離子液體或含離子液體的兩相體系大大縮短了催化反應(yīng)時(shí)間，轉(zhuǎn)化時(shí)間不超過M小時(shí)；(3)離子液體或含離子液體的兩相體系中產(chǎn)物分離簡(jiǎn)單，離子液體易于回收循環(huán)使用；(4)離子液體或含離子液體的兩相體系不易揮發(fā)，生物相容性好，不污染環(huán)境，為白樺脂醇生物催化合成白樺脂酸產(chǎn)率的提高提供了新思路，同時(shí)為離子液體體系在白樺脂酸催化合成中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。


圖1為本發(fā)明方法的流程示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 8不同兩相體系中黃綠密環(huán)菌ZJUQH催化白樺脂醇合成白樺脂酸
(1)將黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH接入滅菌過的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(其原料質(zhì)量百分比組成為馬鈴薯20%，葡萄糖2%和瓊脂3% )，在觀1，活化4天后制成黃綠蜜環(huán)菌 ZJUQH孢子懸浮液，然后接入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(其原料質(zhì)量百分比組成為馬鈴薯 20 %，葡萄糖2 %，余量為水，pH自然)，在、轉(zhuǎn)速為120r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)3天， 得到種子培養(yǎng)液。黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液中孢子濃度為1 X IO6個(gè)/毫升，馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基與接入的黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH孢子懸浮液的體積比為30。
將種子培養(yǎng)液經(jīng)3000r/min冷凍離心30分鐘，無菌水洗滌3次后除去發(fā)酵液獲得黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞。
(2)具塞試管中加入5mL離子液體與磷酸緩沖液的混合溶劑或離子液體與正己烷的混合溶劑形成兩相體系，兩相體系中離子液體的體積濃度為50%，無菌條件下加入上述黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞，黃綠密環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞的用量以每升兩相體系計(jì)為200g，于 ^°C，轉(zhuǎn)速200r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上預(yù)培養(yǎng)lOmin，得到預(yù)培養(yǎng)體系。
(3)向上述預(yù)培養(yǎng)體系中加入0. ImL濃度為7. 5mg/mL白樺脂醇的二甲基亞砜溶液，繼續(xù)于，轉(zhuǎn)速200rpm旋轉(zhuǎn)式搖床上發(fā)酵培養(yǎng)1 得到轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液。
(4)將轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液經(jīng)離心、調(diào)pH至3、乙酸乙酯萃取和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等后處理得到白樺脂酸。
以[bmim]bf4、[bmim]pf6、[emim]bf4、[omim]pf6四種離子液體和磷酸緩沖液、正己烷兩種溶劑分別組成兩相體系進(jìn)行白樺脂酸的催化合成，結(jié)果見表1
表 1
權(quán)利要求
1.一種生物催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法，包括以下步驟(1)將黃綠蜜環(huán)菌(Armillarialuteo-virens Sacc.) ZJUQH CGMCC No. 1884 經(jīng)過活化和種子培養(yǎng)后得到種子培養(yǎng)液，再經(jīng)冷凍離心得到黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH CGMCC No. 1884濕細(xì)胞；(2)在含有離子液體的兩相體系中加入黃綠蜜環(huán)菌ZJUQHCGMCC No. 1884濕細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，得到預(yù)培養(yǎng)體系；(3)向預(yù)培養(yǎng)體系中加入白樺脂醇溶液，于25°C 30°C發(fā)酵培養(yǎng)6小時(shí) M小時(shí)得到轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液；(4)轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液經(jīng)后處理得到白樺脂酸；其中，所述的白樺脂醇用量以每升兩相體系計(jì)為15mg 150mg;所述的兩相體系為離子液體與正己烷的混合溶劑；所述的兩相體系中添加有正丁醇，每升兩相體系中正丁醇的添加量為0. 05mol 0. Imol ；所述的離子液體選自1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽中的一種
2.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述的兩相體系中離子液體的體積百分濃度為3% 98%。
3.如權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于所述的兩相體系中離子液體的體積百分濃度為40% 60%。
4.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述的白樺脂醇溶液為白樺脂醇的二甲基亞砜溶液，其中的白樺脂醇的濃度為7. 5mg/mL ；白樺脂醇用量以每升兩相體系計(jì)為75mg。
5.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)溫度為^°C， 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為18小時(shí)。
6.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，活化所用的斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)所用的種子培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基；所述的活化溫度為25 V 30°C，活化時(shí)間為4天 6天；所述的種子培養(yǎng)溫度為25°C 30°C，培養(yǎng)時(shí)間為3天。
7.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述的黃綠蜜環(huán)菌ZJUQHCGMCC No. 1884濕細(xì)胞的用量以每升兩相體系計(jì)為50g 400g ；所述的預(yù)培養(yǎng)條件為在25 V 30°C培養(yǎng)5分鐘 15分鐘。
8.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于步驟(4)中，所述的后處理包括將轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理得到上清液，調(diào)節(jié)pH至3 4，乙酸乙酯萃取后得到萃取液，經(jīng)濃縮得到白樺脂酸。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種生物催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法，包括(1)黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞的制備；(2)在離子液體或兩相體系中加入黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH濕細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，得到預(yù)培養(yǎng)體系；(3)向預(yù)培養(yǎng)體系中加入白樺脂醇溶液，于25℃～30℃發(fā)酵培養(yǎng)6小時(shí)～24小時(shí)得到轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液；(4)轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液經(jīng)后處理得到白樺脂酸；其中，所述的兩相體系為離子液體與正己烷的混合溶劑或者離子液體與磷酸緩沖溶液的混合溶劑。該方法與傳統(tǒng)方法相比，提高了產(chǎn)物的得率，縮短了催化反應(yīng)時(shí)間，且產(chǎn)物分離簡(jiǎn)單，同時(shí)離子液體體系不易揮發(fā)，生物相容性好，不污染環(huán)境。
文檔編號(hào)C12R1/645GKCN101709322 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200910154901
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2009年11月26日
發(fā)明者何國(guó)慶, 傅明亮, 劉婧, 劉曉杰, 章海鋒, 陳啟和 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (5), 非專利引用 (3),