專(zhuān)利名稱(chēng):一種制備重組人pdcd5的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種制備具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡活性的重組人 PDCD5(programmed cell death 5)的方法。
背景技術(shù)：
PDCD5是北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部在國(guó)際上首先發(fā)現(xiàn)的新的程序性細(xì)胞死亡相關(guān)基因， 編碼125個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。1999年在國(guó)際雜志發(fā)表論文時(shí)曾命名為T(mén)FAR19 (TF-1 cell apoptosis related gene 19)， 2002年國(guó)際人類(lèi)基因命名委員會(huì)將其統(tǒng)一命 名為PDCD5。研究證明，PDCD5是一個(gè)新的抑癌基因，在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，通 過(guò)結(jié)合組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Tip60發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明重組 人PDCD5蛋白對(duì)腫瘤的的化療具有明顯的增敏效應(yīng)，其本身未發(fā)現(xiàn)毒副作用。
中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)CN1218833A公開(kāi)的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)"具 有細(xì)胞凋亡促進(jìn)活性的 多肽"，涉及PDCD5的制備，重組PDCD5為包涵體形式的原核融合表達(dá)，通過(guò)變性 溶解和稀釋復(fù)性后，酶解釋放出目的蛋白，再用陰離子交換柱DEAE分離純化。中 國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)CN101214371A公開(kāi)的"人重組蛋白PDCD5在制備腫瘤化療增敏藥中 的應(yīng)用"，重組PDCD5為原核可溶性表達(dá)，目的蛋白PDCD5的表達(dá)量?jī)H占菌體可溶 性蛋白的8%，在小試水平經(jīng)離子交換和疏水2步層析，目的蛋白龜泳純度大于95%。 上述2個(gè)專(zhuān)利中均未涉及重要純化參數(shù)如pH、離子強(qiáng)度和純化評(píng)價(jià)指標(biāo)如收率等的 描述。大腸桿菌采用可溶性表達(dá)形式表達(dá)重組蛋白可以避免目的蛋白的變復(fù)性過(guò) 程，但菌體破碎液中目的蛋白混雜了大量的可溶性菌體蛋白，給后續(xù)目的蛋白的分 離純化帶來(lái)了很大的困難，特別在工業(yè)化高密度發(fā)酵純化生產(chǎn)時(shí)。本發(fā)明主要體現(xiàn) 在，宿主細(xì)胞經(jīng)流加-批式高密度發(fā)酵，菌體密度和目的蛋白表達(dá)量提高；通過(guò)調(diào) 節(jié)菌液或細(xì)胞破碎液的pH至酸性，可以沉淀大部分的雜蛋白，方便了后續(xù)的層析 分離，而不影響目的蛋白的活性和收率；在層析分離精制時(shí)選用陰離子、陽(yáng)離子或 疏水作用介質(zhì)的任意2種介質(zhì)組合，目的蛋白的純度和收率可分別達(dá)到99%和70% 以上；且本工藝可放大至中試生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種制備基因重組人PDCD5的方法，該方法不僅使重組 人PDCD5的表達(dá)量高，而且產(chǎn)率和純度高，并可放大中試生產(chǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是表達(dá)重組人PDCD5的基因工程菌流加-批式高密度發(fā)酵、 工程菌破碎、目的蛋白粗提、層析分離精制。
重組人PDCD5工程菌流加-批式高密度發(fā)酵的方法為
將表達(dá)重組人PDCD5的工程菌接種于搖瓶中的LB、 2XYT、 S0B或S0C培養(yǎng)基， 置30-37t振搖過(guò)夜。將菌液接種于發(fā)酵罐中繼續(xù)培養(yǎng)。自動(dòng)控制溫度于37'C，用 氨水自動(dòng)流加控制pH于6.8-7.1。發(fā)酵初期通過(guò)增加通氣量、通氧量和逐漸增加轉(zhuǎn) 速維持溶氧飽和度于20%-50%。至溶氧明顯上升時(shí)開(kāi)始流加氮元和碳元，氮元包括 酵母提取物、酵母膏、蛋白胨、酪蛋白水解物等，碳元包括葡萄糖、蔗糖等，流加 速度參考溶氧、菌體密度OD6oo值和尾氣分析。至OD6oo達(dá)70-90時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG ， 終濃度控制在0. 05-0. 35mmol/L。繼續(xù)流加培養(yǎng)3-6小時(shí)，至0D開(kāi)始下降、溶氧上 升、OUR和CER下降時(shí)結(jié)束發(fā)酵，此時(shí)菌體密度0D6(X)平均達(dá)120左右。離心發(fā)酵液 收集菌體。
表達(dá)重組人PDCD5工程菌的破碎和重組人PDCD5粗提的方法為
用1:2至1:10 (體積比，如無(wú)特殊說(shuō)明，以下同)的去離子水重懸離心沉淀的 菌體，用鹽酸、硫酸或磷酸調(diào)節(jié)菌液pH至1.5-5.0，優(yōu)選pH 1.5-4.0，首選pH 2.0-3.0， 勻質(zhì)機(jī)破碎。先在30-50Mpa壓力下預(yù)破碎菌體一次，然后在100 130Mpa壓力下 破碎2-3次。離心，10000rpm， 20 min，收集含重組人PDCD5的上清液。
或用1:2至1:10的去離子水重懸離心沉淀的菌體，勻質(zhì)機(jī)破碎。先在30-50Mpa 壓力下預(yù)破碎菌體一次，然后在100-130Mpa壓力下破碎2-3次。用鹽酸、硫酸或 磷酸調(diào)節(jié)菌體破碎液pH至1.5-5.0，優(yōu)選pH 1.5-4.0，首選pH 2.0-3.0，離心，10000rpm， 20 min，收集含重組人PDCD5的上清液。
將離心收集的含重組人PDCD5上清液的pH調(diào)至6.0-8.0，優(yōu)選6.5-7.5，首選 6.8-7.2，進(jìn)一步沉淀部分雜蛋白，上清液SDS-PAGE電泳重組人PDCD5的含量為 50-60%。
重組人PDCD5層析分離的方法為
陰離子層析介質(zhì)如 Q-s印harose 、 DEAE-s印harose 、 C即toQ-s印harose 、 Toyopearl GigaCap Q-650或Toyopearl DEAE-650， 優(yōu)選Q-sepharose、 DEAE-sepharose、 CaptoQ- sephaxose， 首選Q-s印harose裝填層析柱，用pH 6. 5-7- 5
5的磷酸緩沖液平衡，首選20mraol/L、 pH7.2的磷酸緩沖液。用超濾置換、稀釋等方 法將含重組人PDCD5溶液的離子強(qiáng)度調(diào)整為小于5 ms/cm、 pH調(diào)整為7. 2上樣，用 10±3. 5 ms/cm、 pH 7.2的緩沖液洗滌雜蛋白，再用20±5 ms/cm、 pH 7.2的磷酸 緩沖液洗脫目的蛋白，收集目的蛋白峰。在陰離子層析分離中，本發(fā)明首選 Q-s印harose FF介質(zhì)和20mmol/L、 pH7. 2的磷酸緩沖液；先用10±3.5 ms/cm、 pH 7.2的緩沖液洗滌雜蛋白，再用20土5ms/cm、 pH 7. 2的磷酸緩沖液洗脫目的蛋白。 用超濾置換、稀釋等方法將含重組人PDCD5上清的離子強(qiáng)度調(diào)整為小于6 ms/cra、 pH調(diào)整為4.4-5.0。用陽(yáng)離子層析介質(zhì)如CM-s印harose、 SP- s印harose、 Toyopearl SP-550、 Toyopearl CM-650，優(yōu)選CM-sepharose、 SP- sepharose， 首 選CM-s印harose，裝填層析柱；層析柱用pH 4. 4-5. 0， 10-50mmol/L的乙酸、檸檬 酸或磷酸緩沖液平衡，首選pH 5.0的20mmol/L乙酸緩沖液。將上述樣品上柱，用 電導(dǎo)ll士2ms/cm、 pH 4. 4-5. 0的緩沖液洗滌雜蛋白，再用20±3ms/cm、 pH 4. 4-5. 0
的緩沖液洗脫目的蛋白，收集目的蛋白峰。在陽(yáng)離子層析分離中，本發(fā)明首選 CM-s印harose介質(zhì)和pH 5.0、 20mmol/L檸檬酸緩沖液；先用電導(dǎo)為11 ±2ms/cm、 pH為5.0的緩沖液洗滌雜蛋白，再用20士3ms/cm、 pH5, 0的緩沖液洗脫目的蛋白。
也可采用疏水作用層析，在含重組人PDCD5的溶液中加入硫酸銨至 0.8-1.5mol/L， pH調(diào)整為7.0-7.4。用0.8-1.5mol /L硫酸銨、pH 7. 0-7. 4、 10-100咖ol/L的磷酸緩沖液平衡Phenyl-s印harose、Butyl- sepharose、 Toyopearl Butyl-650 、Toyopearl Phenyl-650柱，優(yōu)選Phenyl-s印harose、Butyl- sepharose， 首選Phenyl-s印harose;緩沖液首選pH 7.2、 lmol /L硫酸銨、20mraol/L磷酸緩 沖液。上述樣品上樣，用1.0mol/L硫酸銨、pH7.2、 20mmo1/L的磷酸緩沖液洗滌 雜蛋白，用pH7.2、 20mmo1 /L的磷酸緩沖液洗脫目的蛋白，收集目的蛋白峰。在 疏水作用層析中，本發(fā)明首選Phenyl-s印harose介質(zhì)和pH 7. 2、 lmol /L硫酸銨、 20mmol/L磷酸緩沖液；先用1. 0mol/L硫酸銨、pH 7.2、 20rnmo1 /L的磷酸緩沖液 洗滌雜蛋白，再用PH 7.2、 20mmo1 /L的磷酸緩沖液洗脫目的蛋白。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)
1. 一般在中性條件下破碎基因工程菌使可溶性表達(dá)的重組蛋白釋放，含目的 蛋白的離心上清可用于后續(xù)的層析分離。但此時(shí)上清中的雜蛋白含量很高，非常不 利于后續(xù)的層析分離。本發(fā)明利用重組人PDCD5在酸性環(huán)境中比較穩(wěn)定的特點(diǎn)，將 破碎時(shí)菌液或破碎后菌液的pH調(diào)至1.5-4.5，使部分雜蛋白沉淀；再將收集上清液的pH調(diào)至6. 5-7. 4，再次使部分雜蛋白沉淀。通過(guò)2次簡(jiǎn)單的沉淀粗提，目的蛋白 純度從25%左右提高至約55%。
2.層析分離是重組蛋白純化精制的常用方法，離子交換和疏水作用層析是最常 選用的層析方法。我們通過(guò)粗提降低了上清中雜蛋白的含量，提高了層析介質(zhì)對(duì)目 的蛋白的載量和分離效果。通過(guò)優(yōu)化層析分離的條件，無(wú)論采用陰離子、陽(yáng)離子或 疏水介質(zhì)均能取得較高純度的PDCD5，再選用另一種層析介質(zhì)進(jìn)一步純化，就可達(dá) 到99%以上的純度，純化收率高于80%。本發(fā)明制備重組人PDCD5的方法可實(shí)現(xiàn)中 試放大。


圖h表達(dá)重組人PDCD5工程菌的生長(zhǎng)曲線(實(shí)施例l)
橫坐標(biāo)發(fā)酵時(shí)間(小時(shí))；縱坐標(biāo)600nm比色的吸光度值(OD600)
圖2:重組人PDCD5工程菌在IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間的SDS-PAGE圖(實(shí)施例1)
泳道l: PDCD5標(biāo)準(zhǔn)品
泳道2: 0. 5小時(shí)
泳道3: 1小時(shí)
泳道4: 1.5小時(shí)
泳道5: 2小時(shí)
泳道6: 2.5小時(shí)
泳道7: 3小時(shí)
泳道8: 3. 5小時(shí)
圖3:重組人PDCD5的粗提(實(shí)施例2) 泳道1:分子量marker 泳道2:重組人PDCD5標(biāo)準(zhǔn)品 泳道3:勻質(zhì)破碎液 泳道4: pH 3.0時(shí)的離心上清液 泳道5: pH 3.0時(shí)的離心沉淀 泳道6: pH 7. 3時(shí)的離心上清液泳道7: PH 7. 3時(shí)的離心沉淀 圖4:重組人PDCD5的層析分離(實(shí)施例3、 4、 5) 泳道l:重組人PDCD5標(biāo)準(zhǔn)品
泳道2:陰離子-陽(yáng)離子層析組合純化的重組人PDCD5 泳道3:陰離子-疏水層析組合純化的的重組人PDCD5
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。應(yīng)該解釋的是，本發(fā)明實(shí)施例的制備方法 僅僅是用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對(duì)本發(fā)明 制備方法的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。在上下文中，除非另有說(shuō)明， 本發(fā)明中的百分?jǐn)?shù)是重量百分?jǐn)?shù)，物料用量比是體積比。
實(shí)施例1、重組人PDCD5工程菌100L生物反應(yīng)器的發(fā)酵培養(yǎng)
將450ml種子液(OD6o。為3.3)接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基45L(蛋白胨720g，酵母提 取物450g， NaCl 225g， KH2PO471.04g， K2HPO4.3H2O,190.52g，加水溶解至45L, 調(diào)pH至7.0， 12rC滅菌30分鐘)發(fā)酵培養(yǎng)。自動(dòng)控制溫度于37'C，用氨水自動(dòng)流 加控制pH于7.0，每小時(shí)取樣檢測(cè)0D6(w值、葡萄糖濃度。為維持溶氧在30%-50% (相對(duì)百分?jǐn)?shù))，攪拌速度從200rpm逐漸調(diào)至600rpm，通氣量從0.8wm調(diào)至 1.2wm，最后通過(guò)調(diào)節(jié)氧氣流量維持溶氧。發(fā)酵約4小時(shí)至溶氧明顯上升時(shí)開(kāi)始流 加碳元(葡萄糖12Kg，溶于20L去離子水)和氮元(蛋白胨1000g，酵母提取物1000g， 溶于12L去離子水)，發(fā)酵約12小時(shí)OD60()達(dá)75時(shí)，在罐中加入IPTG至終濃度為 3.5mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)，至006()()達(dá)122后菌體密度開(kāi)始下降(圖1)、溶氧 上升、OUR和CER下降，結(jié)束發(fā)酵。12000rpm離心發(fā)酵液10分鐘，收集菌體。發(fā) 酵終體積為84L,菌體濕重為17. 05kg。 SDS-PAGE電泳分析誘導(dǎo)不同時(shí)間的菌體蛋白 中目的蛋白含量，誘導(dǎo)0.5-l小時(shí)后，PDCD5即開(kāi)始出現(xiàn)；誘導(dǎo)1.5-2小時(shí)后PDCD5 含量明顯增加；之后PDCD5含量緩慢增加；3.5小時(shí)終止發(fā)酵時(shí)目的蛋白約占菌體 蛋白的25% (圖2)。
實(shí)施例2、基因工程菌表達(dá)的重組人PDCD5的勻質(zhì)破碎和粗提(圖3)
稱(chēng)取濕菌體5Kg，以25L去離子水重懸菌體，勻質(zhì)機(jī)破碎。先在50Mpa壓力 下預(yù)破菌體一次，然后在130Mpa壓力下破碎3次。此時(shí)上清液中PDCD5的含量約 占菌體蛋白的25% (泳道3)。調(diào)pH至3，攪拌20min;離心，10000rpm， 20 min，收集上清液。SDS-PAGE電泳分析上清和沉淀中的蛋白組成，與泳道3比較，上清中 PDCD5純度上升，約為40%,部分雜蛋白缺失。調(diào)整pH至7.3，攪拌20min;離心 10000rpm，時(shí)間20min。得上清液23L，總蛋白濃度為2.5mg/ml，此即為重組人PDCD5 粗提物。SDS-PAGE電泳分析上清和沉淀中的蛋白組成，與泳道3、 4和5比較，上 清中PDCD5純度上升至60%，更多的雜蛋白缺失。該實(shí)施例說(shuō)明通過(guò)調(diào)節(jié)破碎菌液 的pH，提高了層析分離上樣液的PDCD5純度，降低了雜蛋白的含量和數(shù)量。
實(shí)施例3、重組人PDCD5的陰離子-陽(yáng)離子交換層析純化
用20mmol/L、 pH 7.3的磷酸緩沖液平衡Q-sepharose FF (GE)層析柱，層析 柱規(guī)格為100X500mm。將實(shí)例2的重組人PDCD5粗提物23L上柱，先用20mmol/L、 pH7.3的磷酸緩沖液洗滌至流出液的光吸收值達(dá)水平，再用20mmol/L、 pH7.2、含 10Ommol/L的NaCl磷酸緩沖液洗滌至流出液的光吸收值達(dá)水平，最后再用 20mmol/L、 pH7.2、含200mmol/L的NaCl磷酸緩沖液洗脫目的蛋白，共收集目的 蛋白峰1.8L，總蛋白濃度為10.6mg/ml， SDS-PAGE分析其中重組人PDCD5純度為 99.6%，該步收率約為80%。
用20mmol/L、 pH 4.8的乙酸緩沖液平衡CM-s印harose FF (GE)層析柱，層析 柱規(guī)格50X200mm。將實(shí)例3收集的目的蛋白峰0.9L上柱，先用20腿ol/L、 pH 4.8 的乙酸緩沖液洗滌至流出液的光吸收值達(dá)水平，再用20mmol/L、 pH 7.2、含 10Ommol/L的NaCl的pH 4.8的乙酸緩沖液洗脫目的蛋白，共收集的目的蛋白峰 310ml，蛋白濃度為28mg/ml，SDS-PAGE分析其中重組人PDCD5純度為99.6% (圖 4)，該步收率約為90%。
實(shí)施例4、重組人PDCD5的疏水作用層析純化
在實(shí)施例3中，從Q-sepharoseFF洗脫的0.9L目的蛋白樣品中，加入硫酸銨至 終濃度為lmol/L, pH調(diào)整為7.0。用lmol/L硫酸銨、pH 7.0、 20mmol/L的磷酸緩 沖液平衡phenyl-sepharose柱(50X200腿)，上述樣品上樣。用lmol/L硫酸銨、 pH 7.0、 20mmol/L的磷酸緩沖液洗滌雜蛋白，用pH 7.0、 20mmol/L的磷酸緩沖液 洗脫目的蛋白，共收集目的蛋白峰330ml，蛋白濃度為27mg/ml,SDS-PAGE分析重 組人PDCD5純度為99.1% (圖4)，該步收率約為90%。
9
權(quán)利要求
1、一種制備重組人PDCD5的方法，該方法包括表達(dá)重組人PDCD5工程菌的高密度發(fā)酵、菌體破碎、重組人PDCD5粗提和層析分離，其特征在于
(1)通過(guò)調(diào)節(jié)破碎前菌液的pH或菌體破碎液的pH，使雜蛋白沉淀；和
(2)通過(guò)層析分離組合
以簡(jiǎn)化重組人PDCD5的純化工藝和提高重組人PDCD5的純度。
2、 根據(jù)權(quán)利要求
l的方法，其特征在于在菌體破碎前，調(diào)節(jié)菌液pH至1.5-5.0，優(yōu) 選pH 1.5-4.0，首選pH2.0-3.0，沉淀部分雜蛋白。
3、 根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其特征在于在菌體破碎后，調(diào)節(jié)破碎液的pH至1.5-5.0， 優(yōu)選pH 1.5-4.0，首選pH2.0-3.0，沉淀破碎液中的部分雜蛋白。
4、 根據(jù)權(quán)利要求
1-3之一的方法，其特征在于將調(diào)為酸性的離心上清液的pH調(diào)至 6.0-8.0，優(yōu)選6.5-7.5，首選6.8-7.2，進(jìn)一步沉淀部分雜蛋白。
5、 根據(jù)權(quán)利要求
1-4之一的方法，其特征在于在層析分離時(shí)選用陰離子-陽(yáng)離子交 換層析、陰離子交換-疏水作用層析、陽(yáng)離子-陰離子交換層析、陽(yáng)離子交換-疏水作 用層析、疏水作用-陰離子交換或疏水作用-陽(yáng)離子交換層析中的任意組合，優(yōu)選陰 離子-陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換-疏水作用層析，首選陰離子-陽(yáng)離子交換層析。
6、 根據(jù)權(quán)利要求
1-6之一的方法，其特征在于陰離子交換層析介質(zhì)選用 Q-sepharose、 DEAE- s印haxose、 C即toQ- s印harose、 Toyopearl GigaC鄰Q-650 或Toyopearl DEAE-650，優(yōu)選Q-sepharose、DEAE- s印harose、C即toQ- sepharose、， 首選Q-sephaxose; 陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)選用CM-s印harose、 SP- sephaxose、 Toyopearl SP-550、 Toyopearl CM-650，優(yōu)選CM-sepharose、 SP- s印harose， 首 選CM-s印harose; 疏TR作用層析介質(zhì)選用Phenyl-sepharose、 Butyl- s印harose、 Toyopearl Butyl-650 、 Toyopearl Phenyl-650， 優(yōu)選Phenyl-sepharose、 Butyi-sepharose， 首選Phenyl-s印harose。
7、 根據(jù)權(quán)利要求
1-7之一的方法，其特征在于在使用陰離子交換層析時(shí)使用 Q-s印harose介質(zhì)和20mmol/L、 pH7.2的磷酸緩沖液，用10±3.5ms/cm、 pH 7.2的 緩沖液洗滌雜蛋白，再用20士5ms/cm、 pH 7.2的磷酸緩沖液洗脫目的蛋白。
8、 根據(jù)權(quán)利要求
1-7之一的方法，其特征在于在使用陽(yáng)離子交換層析時(shí)使用CM-sepharose介質(zhì)和pH 5.0、 20mmol/L擰檬酸緩沖液，先用電導(dǎo)11 ±2ms/cm、 pH 5.0的緩沖液洗滌雜蛋白，再用20土3ms/cm、 pH5.0的緩沖液洗脫目的蛋白。
9、根據(jù)權(quán)利要求
1-7之一的方法，其特征在于在使用疏水層析時(shí)使用 Phenyl-sepharose介質(zhì)和pH 7.2、 lmol /L硫酸銨、20mmol/L磷酸緩沖液，用1.0mol/L 硫酸銨、pH7.2、 20mmol/L的磷酸緩沖液洗滌雜蛋白，用pH7.2、 20mmol/L的磷酸緩沖液洗脫目的蛋白。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡活性的重組人PDCD5(ProgrammedCell Death 5)的方法。本方法包括重組人PDCD5基因工程菌發(fā)酵、工程菌破碎、目的蛋白粗提和層析分離。本發(fā)明通過(guò)調(diào)節(jié)pH沉淀部分雜蛋白進(jìn)行粗提，再選用層析組合分離精制，與以往報(bào)道的方法相比，不僅簡(jiǎn)化了重組人PDCD5的純化工藝，提高了產(chǎn)品純度，而且可中試放大生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/02GKCN101643763SQ200910169934
公開(kāi)日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年9月10日
發(fā)明者唐治華, 杰 張, 炎 張, 英 張, 白敏姿 申請(qǐng)人:北京天廣實(shí)生物技術(shù)股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan