專利名稱:抗老年癡呆原料藥石杉堿甲的發(fā)酵技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗老年癡呆原料藥石杉堿甲的發(fā)酵技術(shù)。
技術(shù)背景
2008年6月11日公開的專利技術(shù)蛇足石杉內(nèi)生真菌及其應(yīng)用(專利申請?zhí)?200610119149. 7 ；公開號CN101195804A)公開了一種可以產(chǎn)石杉堿甲的內(nèi)生真菌——內(nèi)生枝頂孢霉(Acremonium endophytium)，保藏號為CCTCC M 206118。并涉及到了利用該菌發(fā)酵可以生產(chǎn)石杉堿甲的技術(shù)應(yīng)用。
目前，國內(nèi)外有一些機構(gòu)和個人在開展利用石杉植物的多種內(nèi)生菌(包括真菌和細(xì)菌)發(fā)酵生產(chǎn)石杉堿甲的技術(shù)研究，但實驗研究的成品得率一直非常低下，使其難以進入產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，而我們本技術(shù)項目的研究獲得了優(yōu)選的配方和創(chuàng)新工藝，通過添加前體物質(zhì)2-亞甲基-1，3-丙二醇二醋酸酯，可使石杉堿甲的發(fā)酵產(chǎn)量提高12. 5% -18.7%，具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
石杉堿甲是我國首次從蕨類植物蛇足石杉中分離得到的一種活性物質(zhì)，它對中樞乙酰膽堿酯酶具有高效、可逆、高選擇的抑制作用，有強效、高選擇性的抗乙酰膽堿酯酶活性及提高學(xué)習(xí)和改善老年人記憶功能的作用。由于石杉堿甲僅存在于石杉科植物中，隨著石杉堿甲被分離并應(yīng)用于臨床，掀起了研究開發(fā)的熱潮，人們便開始對石杉科植物進行掠奪式開發(fā)，加上該植物對環(huán)境要求苛刻、分布星散、生長緩慢、資源更新周期長，使其資源越來越匱乏。中國作為石杉野生資源主要分布區(qū)，其商業(yè)可開采量不足200噸，遠(yuǎn)不能滿足市場對藥源的需求，已成為制約石杉堿甲開發(fā)的瓶頸。
石杉科植物中存在多種內(nèi)生真菌，它們與寄主形成共生關(guān)系，從蛇足石杉植物中分離的內(nèi)生枝頂孢霉(Acremonium endophytium)，保藏號為CCTCC M 206118，能夠生成與宿主植物相同的活性成分石杉堿甲。我們發(fā)明了特殊的培養(yǎng)配方和優(yōu)化發(fā)酵條件可以高效生產(chǎn)石杉堿甲。
工藝流程
1、將保存于低溫條件下的石杉堿甲產(chǎn)生菌接種于新鮮的PDA斜面培養(yǎng)基上，28°C 培養(yǎng)4d。
2、挑取培養(yǎng)成熟的斜面菌種接種于液體搖瓶種子培養(yǎng)基中J8°C，150-180r/min 條件下恒溫振蕩培養(yǎng)4-5d。
3、將培養(yǎng)好的搖瓶液體種子培養(yǎng)基接種于車間種子罐培養(yǎng)基中二8°C，通氣量 1 1WM，培養(yǎng) 3-4d。
4、按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱取各種原材料，配制好發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后， 接入培養(yǎng)好的液體種子，300C，攪拌轉(zhuǎn)速200-220r/min，種子接入量10 %，全程pH值控制在 6. 0-7. 0，培養(yǎng) 8d。
3[0011]5、發(fā)酵前期，通氣量控制為1 1. IVVM ；發(fā)酵后期通氣量控制為1 0. 8VVM。
6、在發(fā)酵96_120h后，向發(fā)酵液中添加0. 05%-0. 065%的前體物質(zhì)2_亞甲基_1， 3-丙二醇二醋酸酯，可使石杉堿甲的發(fā)酵產(chǎn)量提高12. 5% -18. 7%。
7、發(fā)酵過程中，前期保持發(fā)酵液中總糖含量控制在6% -7% ；中期保持半饑餓狀態(tài)，總糖含量控制在3.5% -4. 5%;后期控制在2.5% -3. 5%;放罐時殘?zhí)强刂茷橐韵隆?br>8、發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液進行預(yù)處理，并對產(chǎn)品進行提取和精制。附
一、種子培養(yǎng)基配方玉米粉2% 葡萄糖2% 玉米漿0.8% 酵母粉豆餅粉 1. 65% KH2PO4 0. 2% MgSO4. 7H20 0. 05% CaCO3 0. 35%
二、發(fā)酵培養(yǎng)基配方玉米粉4%麥芽糖2% 玉米淀粉2%酵母粉1.2% 玉米菜0.6% 豆餅粉 1.55% KH2PO4 0. 1 %MgSO4. 7H2 0 0. 06% NaCl 0. 05% CaCO3 0. 4%
三、石杉堿甲提取工藝
(1)、將發(fā)酵處理液在76mmHg，8(TC條件下真空濃縮15-20倍。
(2)、加入稀氨水，調(diào)節(jié)pH值為8. 5-9. 0。
(3)、加入氯仿萃取，萃取次數(shù)按發(fā)酵液中石杉堿甲的含量而定。
(4)、分離萃取液，加入NaOH與氯仿液再次萃取。
(5),1% HCl與氯仿液反復(fù)萃取。
(6)、脫色在pH為1-2條件下，用活性炭脫色。
(7)、結(jié)晶用氯仿萃取并蒸干后，固體物質(zhì)用丙酮溶解，4_5°C靜置24h左右，得到結(jié)晶體。
(8)、重結(jié)晶將得到的第一次結(jié)晶體用丙酮溶解，進行重結(jié)晶。
(9)、將晶體于60°C左右溫度條件下烘干，檢測，可得純度為99%以上的純品。
四、工藝成果以該發(fā)酵工藝進行實驗室生產(chǎn)的石杉堿甲經(jīng)過高效液相色譜檢測含量為 4. 98yg/mL。
具體實施方式
實施例1 抗老年癡呆原料藥石杉堿甲的發(fā)酵技術(shù)(實施例中要用具體的克數(shù)或其它具體的數(shù)值)
1、將保存于低溫條件下的石杉堿甲產(chǎn)生菌接種于新鮮的PDA斜面培養(yǎng)基上，28°C 培養(yǎng)4d。
2、挑取培養(yǎng)成熟的斜面菌種接種于液體搖瓶種子培養(yǎng)基中J8°C，150r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)4d。
3、將培養(yǎng)好的搖瓶液體種子培養(yǎng)基接種于車間種子罐培養(yǎng)基中二8°C，通氣量 1 1WM，培養(yǎng) 3d。
4、按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱取各種原材料，配制好發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后， 接入培養(yǎng)好的液體種子，300C，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，種子接入量10%，全程pH值控制在6. 2， 培養(yǎng)8d。
5、發(fā)酵前期，通氣量控制為1 1. 2VVM ；發(fā)酵后期通氣量控制為1 0. 9VVM。
6、在發(fā)酵IOOh后，向發(fā)酵液中添加0. 06%的前體物質(zhì)2_亞甲基-1，3_丙二醇二醋酸酯，可使石杉堿甲的發(fā)酵產(chǎn)量提高15.5%。[0035]7、發(fā)酵過程中，前期保持發(fā)酵液中總糖含量控制在6. 2% ；中期保持半饑餓狀態(tài)， 總糖含量控制在3.6% ；后期控制在2.9% ；放罐時殘?zhí)强刂茷橐韵隆?br>8、發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液進行預(yù)處理，并對產(chǎn)品進行提取和精制。附
(1)種子培養(yǎng)基配方
玉米粉2% 葡萄糖2. 2% 玉米漿0.85% 酵母粉1. 1 % 豆餅粉1.8% KH2PO4 0. 2% MgSO4. 7H20 0. 05% CaCO3 0. 35%
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基配方
玉米粉4. 2% 麥芽糖1.8% 玉米淀粉2% 酵母粉1.3% 玉米漿0.65% 豆餅粉 1. 75% KH2PO4 0. 1% MgSO4. 7H20 0. 05% NaCl 0. 05% CaCO3 0. 4%
石杉堿甲提取工藝
1、將發(fā)酵處理液在76mmHg，80°C條件下真空濃縮16倍。
2、加入稀氨水，調(diào)節(jié)pH值為8. 5。
3、加入氯仿萃取，萃取次數(shù)按發(fā)酵液中石杉堿甲的含量而定。
4、分離萃取液，加入NaOH與氯仿液再次萃取。
5,1% HCl與氯仿液反復(fù)萃取。
6、脫色在pH為1.75條件下，用活性炭脫色。
7、結(jié)晶用氯仿萃取并蒸干后，固體物質(zhì)用丙酮溶解，5°C靜置24h左右，得到結(jié)晶體。
8、重結(jié)晶將得到的第一次結(jié)晶體用丙酮溶解，進行重結(jié)晶。
9、將晶體于60°C左右溫度條件下烘干，檢測，可得純度為99. 3%的純品。
工藝成果以該發(fā)酵工藝進行實驗室生產(chǎn)的石杉堿甲經(jīng)過高效液相色譜檢測含量為 4. 45 μ g/mL。
實施例2 抗老年癡呆原料藥石杉堿甲的發(fā)酵技術(shù)(實施例中要用具體的克數(shù)或其它具體的數(shù)值)
1、將保存于低溫條件下的石杉堿甲產(chǎn)生菌接種于新鮮的PDA斜面培養(yǎng)基上，28°C 培養(yǎng)4d。
2、挑取培養(yǎng)成熟的斜面菌種接種于液體搖瓶種子培養(yǎng)基中J8°C，180r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)3. 5d。
3、將培養(yǎng)好的搖瓶液體種子培養(yǎng)基接種于車間種子罐培養(yǎng)基中J8°C，通氣量 1 1. 1VVM，培養(yǎng) 4d。
4、按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱取各種原材料，配制好發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后， 接入培養(yǎng)好的液體種子，300C，攪拌轉(zhuǎn)速230r/min，種子接入量10%，全程pH值控制在6. 9， 培養(yǎng)8d。
5、發(fā)酵前期，通氣量控制為1 1. OVVM ；發(fā)酵后期通氣量控制為1 0. 95VVM。
6、在發(fā)酵120h后，向發(fā)酵液中添加0. 055%的前體物質(zhì)2_亞甲基_1，3_丙二醇二醋酸酯，可使石杉堿甲的發(fā)酵產(chǎn)量提高16.8%。
7、發(fā)酵過程中，前期保持發(fā)酵液中總糖含量控制在6. 7% ；中期保持半饑餓狀態(tài)， 總糖含量控制在3. 9% ；后期控制在3. 3% ；放罐時殘?zhí)强刂茷橐韵隆?br>8、發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液進行預(yù)處理，并對產(chǎn)品進行提取和精制。附[0061](1)種子培養(yǎng)基配方
玉米粉2. 2% 葡萄糖2% 玉米漿0.8% 酵母粉豆餅粉1. 7% KH2PO4 0. 2% MgSO4. 7H20 0. 05% CaCO3 0. 35%
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基配方
玉米粉3. 7% 麥芽糖1.7% 玉米淀粉2.1% 酵母粉1. 4% 玉米漿0.65% 豆餅粉 1. 75% KH2PO4 0. 1% MgS04. 7H20 0. 05% NaCl 0. 05% CaCO3 0. 4%
石杉堿甲提取工藝
1、將發(fā)酵處理液在76mmHg，80°C條件下真空濃縮20倍。
2、加入稀氨水，調(diào)節(jié)pH值為8. 2。
3、加入氯仿萃取，萃取次數(shù)按發(fā)酵液中石杉堿甲的含量而定。
4、分離萃取液，加入NaOH與氯仿液再次萃取。
5,1% HCl與氯仿液反復(fù)萃取。
6、脫色在pH為1.40條件下，用活性炭脫色。
7、結(jié)晶用氯仿萃取并蒸干后，固體物質(zhì)用丙酮溶解，5°C靜置24h左右，得到結(jié)晶體。
8、重結(jié)晶將得到的第一次結(jié)晶體用丙酮溶解，進行重結(jié)晶。
9、將晶體于60°C左右溫度條件下烘干，檢測，可得純度為99. 65%的純品。工藝成果以該發(fā)酵工藝進行實驗室生產(chǎn)的石杉堿甲經(jīng)過高效液相色譜檢測含量為4. 78μ g/mL。
權(quán)利要求
1.抗老年癡呆原料藥石杉堿甲的發(fā)酵技術(shù)，其特征在于包括以下步驟(1)、將保存于低溫條件下的石杉堿甲產(chǎn)生菌接種于新鮮的PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4d。(2)、挑取培養(yǎng)成熟的斜面菌種接種于液體搖瓶種子培養(yǎng)基中J8°C，150-180r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)4-5d。(3)、將培養(yǎng)好的搖瓶液體種子培養(yǎng)基接種于車間種子罐培養(yǎng)基中二8°C，通氣量 1 1WM，培養(yǎng) 3-4d。、按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱取各種原材料，配制好發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，接入培養(yǎng)好的液體種子，300C，攪拌轉(zhuǎn)速200-220r/min，種子接入量10 %，全程pH值控制在 6. 0-7. 0，培養(yǎng) 8d。(5)、發(fā)酵前期，通氣量控制為1 1. IVVM ；發(fā)酵后期通氣量控制為1 0.8VVM。(6)、在發(fā)酵96-120h后，向發(fā)酵液中添加0.05% -0. 065%的前體物質(zhì)2-亞甲基-1， 3-丙二醇二醋酸酯，可使石杉堿甲的發(fā)酵產(chǎn)量提高12. 5% -18. %。(7)、發(fā)酵前期發(fā)酵液中總糖含量控制在6%-7%;中期保持半饑餓狀態(tài)，總糖含量控制在3. 5% -4.5% ；后期控制在2.5% -3.5% ；放罐時殘?zhí)强刂茷橐韵隆?8)、發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液進行預(yù)處理，并對產(chǎn)品進行提取和精制。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的抗老年癡呆原料藥石杉堿甲的發(fā)酵技術(shù)，其特征在于所述生產(chǎn)石杉堿甲菌的發(fā)酵菌株為蛇足石杉內(nèi)生枝頂孢霉(Acremonium endophytium，保藏號為 CCTCCM 206118)；在發(fā)酵過程中，所添加的前體物質(zhì)為2-亞甲基-1，3-丙二醇二醋酸酯。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種抗老年癡呆原料藥石杉堿甲的發(fā)酵技術(shù)。是以蛇足石杉內(nèi)生枝頂孢霉(Acremonium endophytium，保藏號為CCTCC M206118)為生產(chǎn)菌株，在發(fā)酵過程中，通過添加前體物質(zhì)2-亞甲基-1，3-丙二醇二醋酸酯，可使石杉堿甲的發(fā)酵產(chǎn)量提高12.5％-18.7％。種子培養(yǎng)基配方玉米粉2％，葡萄糖2％，玉米漿0.8％，酵母粉1％，豆餅粉1.65％，KH2PO4 0.2％，MgSO4.7H2O 0.05％，CaCO3 0.35％，發(fā)酵培養(yǎng)基配方玉米粉4％，麥芽糖2％，玉米淀粉2％，酵母粉1.2％，玉米漿0.6％，豆餅粉1.55％，KH2PO4 0.1％ MgSO4.7H2O 0.06％，NaCl 0.05％，CaCO3 0.4％。
文檔編號C12P17/12GKCN102191294SQ201010114981
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月1日
發(fā)明者蘭時樂, 王玲, 肖宏 申請人:湖南佰倫科技有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan