專利名稱:抗hiv-i的多肽、其編碼序列及其用途的制作方法
抗HIV-1的多肽、其編碼序列及其用途[0001]本案為以下專利申請的分案申請[0002]申請?zhí)?200710037104.x ；[0003]申請日2007年2月2日；[0004]發(fā)明名稱抗HIV-1的多肽、其編碼序列及其用途。技術領域：
[0005]本發(fā)明涉及基因工程領域，更具體地，本發(fā)明涉及新的抗HIV-1的多肽、其編碼序列及其用途。
背景技術：
[0006]人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)引起獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS),即艾滋病。HIV 屬 RNA逆轉錄病毒科, 可分為I型(HIV-1)和II型(HIV-1I)，其中HIV-1感染率高、危害性大。感染者終生攜帶病毒，在數年的潛伏期后發(fā)病，全身免疫系統(tǒng)受到嚴重損害，最終走向死亡。因目前對艾滋病仍缺乏有效的治療手段，自1981年在美國紐約發(fā)現了第一個艾滋病病例以來，艾滋病已發(fā)展成一個全球性的流行病，以其傳播速度快、死亡率高和無法根治而嚴重影響了人類健康和社會發(fā)展，受到了各國政府和國際社會的廣泛重視。HIV-1從對細胞的入侵、細胞內復制、 組裝及釋放等的全過程都是藥物設計的靶點，但現在仍然缺少既能長期有效又沒有毒副作用的治療藥物，隨著研究的深入，病毒對細胞的粘附和融合過程越來越受到研究者重視。[0007]HIV-1的錨定與侵入主要是膜融合的過程，是由HIV-1外膜前體糖蛋白gpl60的加工開始的，gpl60經前體加工酶水解成兩個片段表面糖蛋白gpl20和跨膜蛋白gp41,其中 gpl20不含有穿膜區(qū)，它與gp41非共價鍵連接，gp41與細胞受體結合后即導致HIV-1的感染，gpl20主要與細胞受體⑶4結合后而造成感染，因而對gpl60的裂解，gp41和gpl20的結合位點以及與細胞受體相互作用的研究是了解HIV-1感染機理和研制抗感染藥物的關鍵，已引起了各國科學家的極大關注，各方面的研究圍繞此展開。[0008]1993年，Jiang等最早發(fā)現衍生于gp41CHR區(qū)域的具有融合抑制活性的 C-多肽 SJ-2176 ￠30-659 殘基)在 nmol/L 水平可抑制 HIV-1 感染[Jiang S et al. HIV-1inhibition by a peptide[J]. Nature,1993,365(6442) :113。]。麻省理工大學的Lu等對gp41用蛋白酶進行了一系列的水解研究，發(fā)現C43 (624 666)、 C34(628 655)、C28 (628 655)等C-多肽具有融合抑制活性[Weissenhorn W, Dessen A， Harrison SC， et al, Atomic structure of ectodomain from HIV_lgp4L Nature, 1997 ；387 :426. Chan D C，Fass D，Berger JM, et al, Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein. Cell,1997,89(2) :263-273] 0 1994 年，Wild 等又發(fā)現gp41C端多肽DP-178 (638-673殘基)抑制HIV-1誘導合胞體形成的效率大幅度提高[Wild CT, Shugars DC, Greenwel l TK, et al, Peptides corresponding to a predictive alpha-helical domain of human immunodeficiency virus type lgp41arepotent inhibitors of virus infection[J]. Proc. Natl. Acad. Sc1. USA,1994,91(21) 9770-9774。]。Enfuviritide (T-20)是第一個阻斷HIV-1侵入靶細胞的抗膜融合類新型抑制劑[Jason LaBonte et al. Enfuvirtide, Nature reviews drug discovery, May 2003， volume 2，345-346]，由 36 個氨基酸殘基組成[Wild CT et al. Peptides corresponding to a predictive a -helical domain of human immunodeficiency virus type lgp41are potent inhibitors of virus infection. Medical Sciences，October 1994, Proc.Natl. Acad. Sc1. USA，Vol. 91，pp. 9770-9774。]，其結構模擬 HIV-1 跨膜蛋白 gp41 的 HR2 端，能夠有效地抑制HIV-1病毒。其抑制機理為人工模擬HR2合成的T20在病毒與靶細胞競爭結合 HRl [Isabel M et al. Dilation of the Human Immunodeficiency Virus-1Envelope Glycoprotein Fusion Pore Revealed by the Inhibitory Action of a Synthetic Peptide from gp41. The Journal of Cell Biology, Volume 140，Number 2，January 26， 1998,315-323。]，從而從入口處切斷病毒進入靶細胞。臨床研究表明多肽enfuviritide作為口服抑制劑并不可行，但是可用作皮下注射。在一項對78例HIV-1病毒攜帶者進行的每 28天一期的臨床觀察中發(fā)現，傳統(tǒng)的大劑量不是很有效，但是可以通過減小劑量一日兩次進行皮下注身寸[Wheeler DA. et al. Safety，tolerability，and plasma pharmacokinetics of high-strength formulations of enfuvirtide(T-20) in treatment experienced HIV-l-1nfected patients. Journal of clinical virology 2004. 30 (2)，183—190]。藥劑量與病毒負荷量相關，但持續(xù)皮下注射受阻于技術問題。最大病毒減小率為enfuvirtide 每日兩次，每次 IOOmg[Greenberg M et al. Enfuvirtide (T-20) and T-1249resistance observations from phase II clinical trials of enfuvirtide in combination with oral antiretrovirals and a phase I/IIdose-ranging monotherapy trial of T-1249. Antiviral Ther 2002 ;7 :Suppl :S140. abstract。]。[0009]T-1249是在T-20的基礎上發(fā)展的又一個抗膜融合多肽抑制劑，其綁定區(qū)域與 T-20綁定區(qū)域有部分重合，但是比T-20更加深入HRl的疏水槽區(qū)域[Greenberg ML et al.1n vitro antiviral activity of T-1249,a second generation fusion inhibitor. Antiviral Ther2002，7 (Suppl I) :S10. abstract。]。這個六螺旋疏水區(qū)域在膜融合的過程中起著重要作用。T-1249已經在115名HIV-1病毒攜帶者中進行了每14天一期的臨床觀察。T-1249的服用劑量為6. 25-200mg，并且有些對照組每天一次皮下注射，有些為兩次，最大病毒減小率為每日皮下注射T-1249總量150-200mg[EiOn J et al. A 14-day assessment of the safety, pharmacokinetics， and antiviral activity of T-1249, a peptide inhibitor of membrane fusion.1n Programs and abstracts of the Eighth Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections， Chicago， February 4-8,2001.Alexandria, Va. Foundation for Retrovirology and Human Health，2001: 47.abstracto ]。[0010]另外以gp41核心 的HRl和HR2結構為基礎，經基因重組合成的HR1-HR2系列多肽，可以形成一個穩(wěn)定性較好的六螺旋束結構，類似于gp41具有膜融合功能的核心區(qū)域。 在HR1-HR2的C端加上一個HRl形成HR121結構，或者在N端加上一個HR2形成HR212結構，這兩個融合多肽均具有較好的穩(wěn)定性和溶解性，用假病毒和T細胞體外融合實驗表明， 融合多肽對HIV-1的膜融合作用有潛在的抑制效果[Ling Ni et al. Rational designof highly potent HIV-1fusion inhibitory proteins Implication for developing antiviral therapeutics. Biochemical and Biophysical Research Communications 2005,332:831-836。]。[0011]申請人已申請過專利“抗HIV-1多肽C22，其編碼序列及其制備方法”(公開號 CN1810830A)，該申請?zhí)峁┝艘环N基于gp41C端多肽序列的多肽抑制劑。[0012]目前HIV抑制劑藥物存在的普遍問題在于，藥物進入人體以后易于酶解，HIV易對藥物產生抗藥性以及因藥物分子量大而產生免疫原性，直接影響了藥物的使用效果。本領域迫切需要開發(fā)出一種專一性強而又不易酶解的小分子量的新多肽抑制劑。
發(fā)明內容
[0013]本發(fā)明的第一個目的是提供一系列活性高的抗HIV-1抑制劑，包括多肽和組合多肽。[0014]本發(fā)明的第二個目的是提供一系列抗HIV-1抑制劑的編碼序列。[0015]本發(fā)明的第三個目的是提供了本方面多肽和組合多肽的制備方法。[0016]本發(fā)明的第四個目的是提供所述抗HIV-1抑制劑的多肽和組合多肽的用途。[0017]本發(fā)明的第一方面，提供一種抑制HIV病毒的多肽，所述多肽含有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列(C22 =ELDKffASLffNWF NITNWLWYIK)。在一實施例中，所述多肽為SEQID NO I所示的多肽與TrpLE的融合蛋白。優(yōu)選的，所述多肽具有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。[0018]本發(fā)明的第二方面，提供一種抑制HIV病毒的多肽，所述多肽含有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列(M3 :EPSCKASRCKSIPPQCHCAN)。在一實施例中，所述多肽為SEQ ID NO 2 所示的多肽與TrpLE的融合蛋白。優(yōu)選的，所述多肽具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。[0019]本發(fā)明的第三方面，提供一種抑制HIV病毒的組合多肽，其特征在于，該組合多肽包括SEQ ID NO 1,SEQ ID NO :2或SEQ ID N0:3(CD4M9)所示的任意二條或三條氨基酸序列。優(yōu)選的，所述組合多肽含有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的序列、SEQID NO :1和SEQ ID NO :3 的序列、SEQ ID NO :2和 SEQ ID NO :3 的序列或SEQ ID NO USEQ ID NO :2和 SEQ ID NO :3的序列，其連接方式可以有多種排列組合。更佳的，所述連接方式如SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 所示。[0020]本發(fā)明的第四方面 ，提供一種上述多肽的編碼序列。優(yōu)選的，所述編碼序列選自下組中的一種[0021](I)SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列；[0022](2) SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列。[0023]本發(fā)明的第五方面，提供一種編碼上述組合多肽的編碼序列。[0024]本發(fā)明的第六方面，提供一種上述多肽的應用，即上述多肽在制備預防或治療HIV 病毒感染的藥物中的應用。較佳的，上述多肽用于制備預防HIV病毒感染的疫苗。[0025]本發(fā)明的第七方面，提供一種上述組合多肽的應用，即上述組合多肽在制備預防或治療HIV病毒感染的藥物中的應用。優(yōu)選的，上述組合多肽用于制備預防HIV病毒感染的疫苗。[0026]本發(fā)明的第八方面，提供一種載體，所述載體含有編碼上述多肽或組合多肽的序列。優(yōu)選的，所述載體選自pTMHa30-51中的一種。[0027]本發(fā)明的第九方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它是被上述載體轉化或轉導的宿主細胞。[0028]本發(fā)明的第十方面，提供一種制備抑制HIV病毒的多肽的制備方法，其特征在于， 該方法包含[0029](a)在適合表達抑制HIV病毒的多肽的條件下，培養(yǎng)上述宿主細胞；[0030](b)從培養(yǎng)物中分離出抑制HIV病毒的多肽。[0031]本發(fā)明的第i^一方面，提供一種制備抑制HIV病毒的組合多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含[0032](a)在適合表達抑制HIV病毒的組合多肽的條件下，培養(yǎng)上述宿主細胞；[0033](b)從培養(yǎng)物中分離出抑制HIV病毒的組合多肽。[0034]本發(fā)明的第十二方面，提供一種能與上述多肽特異性結合的抗體。優(yōu)選的，所述抗體為單克隆抗體。[0035]本發(fā)明的第十三方面，提供一種能與上述組合多肽特異性結合的抗體。優(yōu)選的，所述抗體為單克隆抗體。[0036]本發(fā)明的第十四方面，提供一種HIV疫苗，所述疫苗包含上述任意一種或二種以上的多肽及藥學上所允許的載體。較佳的，所述疫苗含有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列、SEQID NO :1和SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列、SEQID NO 2和SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列、或者SEQ ID NO U SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。[0037]本發(fā)明的第十五方面，提供一種HIV疫苗，所述疫苗包含上述任意一種或二種以上的組合多肽及藥學上所允許的載體。所述組合多肽的連接方式是很多的，在此不一一列舉。較佳的，所述疫苗含有 SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14,SEQ ID N0:15 或 SEQ ID NO 16 所示的氨基酸序列，或者所述疫苗含有SEQ ID N0:13、14、15或16中任意二種、三種甚至四種組合多肽。
具體實施方式
[0038]本研究主要從阻止HIV-1 gp41穿膜的三方面入手，獲得各關鍵的多肽，通過雞尾酒療法將三個或兩個多肽的活性中心組合成一個組合多肽，探討其治療HIV-1的效果和作用機理。近幾年來本實驗室以胰蛋白酶抑制劑MBI結構為基礎，設計了一種多肽抑制劑 M3 (SEQ IDNO 2 EPSCKASRCKSIPPQCHCAN)，對 fur in 酶(蛋白質前體加工酶)抑制活性 Ki 值達到3. 26X 10_9M，抑制HIV-1的細胞實驗效果也較好。以gp41核心結構的C端多肽分別與類gp41的核心蛋白結合的強弱進行比較，以最近本實驗室制備的C22多肽對HIV-1有非常好的抑制效果，經過計算機模擬，設計出系列類C22多肽；針對CD4與gpl20綁定的結構分析，從CD4M3 CD4M9系列肽中，IC50從CD4M3的40 μ M變?yōu)镃D4M9的O.1 1. O μ Μ， 抑制效果得到很大的提高。本研究根據雞尾酒療法的原理，利用單一多肽來阻止膜融合是有一定的難度的，必須使用多種藥物或具有多個活性中心的多肽方可使用，或者使用本發(fā)明多肽和其他藥物組合，可提高治療艾滋病的效果。綜合分析上述三多肽活性中心，將這些三個或兩個多肽活性 中心組合成一個新的活性多肽，最后篩選出可用于HIV-1治療的多肽或組合多肽藥物。[0039]本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，發(fā)現在用融合蛋白pTMHa30_51系統(tǒng)表達抗 HIV-1組合多肽，可以大大簡化抗HIV-1多肽的生產手段，提高多肽的得率。[0040]本發(fā)明的多肽可以是重組多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是多肽合成儀合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、 昆蟲和哺乳動物細胞)產生。[0041]本發(fā)明的組合多肽的序列可以通過多肽合成儀合成或通過PCR技術將單個多肽的DNA序列連接在一起。本發(fā)明涉及一系列含制備本發(fā)明組合多肽的方法，其包括步驟[0042]A.表達載體的構建；[0043]B.培養(yǎng)宿主細胞，所述宿主細胞含有上述的組合多肽表達前體；[0044]C.分離純化出所述的組合多肽融合蛋白；[0045]D.用化學裂解得到所述的組合多肽；[0046]E.分離出組合多肽。[0047]本發(fā)明中，抗HIV-1組合多肽的核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。[0048]本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含抗HIV-1組合多肽編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的Iac或trp啟動子,真核啟動子包括CMV早期啟動子、HSV胸腺激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子和其他一些已知的可控制基因在原核和真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。[0049]此外，表達載體優(yōu)選包含一個或多個選擇性標記基團，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白 (GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或卡那霉素抗性。[0050]包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化或轉導到適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。[0051]宿主細胞可以是原核細`胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；真核細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CH0、C0S細胞等動物細胞。[0052]用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數生長期后收獲，用CaC12法處理， 所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。[0053]獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的編碼序列所編碼的多肽或組合多肽。根據所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。[0054]在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其他特性通過各種分離方法分離和純化蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超濾、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、 離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其他各種液相層析技術及這些方法的結合。[0055]在一優(yōu)選例中，本發(fā)明的抗HIV-1組合多肽是以融合蛋白的形式表達，然后再經化學裂解處理。最后用分子篩層析等方法分離產物，即可獲得本發(fā)明的組合多肽。[0056]本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。[0057]本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的本發(fā)明多肽或者組合多肽可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達本發(fā)明多肽或者組合多肽的細胞可用來免疫動物來生產抗體。[0058]本發(fā)明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。本發(fā)明的各類抗體可以利用本發(fā)明多肽或者組合多肽，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些多肽或者組合多肽可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與本發(fā)明多肽或者組合多肽的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E. Coli)中生產的多肽或者組合多肽來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的多肽或者組合多肽來免疫動物而獲得。[0059]多克隆抗體的生產可用本發(fā)明多肽或者組合多肽免疫動物，如家兔，羊等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。[0060]本發(fā)明多肽、組合多肽或者本發(fā)明編碼序列可用于制備檢測、預防和/或治療HIV 病毒感染的藥物。特別是用于制備預防和/或治療HIV病毒感染的疫苗。[0061]本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明多肽或者組合多肽以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、 水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。 諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、 片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，每天約5-90微克/千克體重，較佳的，每天約24微克/千克 體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。[0062]本發(fā)明的優(yōu)點在于[0063](I)本發(fā)明揭示的組合多肽是根據雞尾酒療法治療HIV-1的原理，從HIV-1膜融的過程三個重要方面入手，將這三個關鍵點的活性中心合成多肽，使該多肽行使雞尾酒療法的功能，從而可以作為有效地抗HIV-1膜融合抑制劑。[0064](2)本發(fā)明的多肽或組合多肽可以由表達的融合蛋白一步裂解就可以得到，或通過多肽合成儀合成得到，制備方法易操作。[0065](3)本發(fā)明的多肽或組合多肽經過合理設計，具有較高的抑制HIV病毒的效價。[0066]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，所用的試劑均可以在市場上購買到。[0067]實施例1組合多肽的基因合成[0068]參考大腸桿菌偏愛密碼子，化學合成組合多肽C22單鏈核苷酸模板(SEQ ID NO 4) (5，GAA TTG GAT AAA TGG GCG TCG CTG TGG AAT TGG TTT AAT ATT ACC AAT TGG CTG TGG TAT ATT AAA3’ )和正向引物(SEQ ID NO :5) (5，GCG AAG CTT ATG GAA TTG GAT AAA TGG GCG 3’ )及反向引物(SEQ ID NO 6) :5’ GCG GGA TCC TTA TTT AAT ATA CCA CAG CCA3’，用 PCR 反應獲得 C22 基因。C22-M3 (SEQ ID NO : 13)、C22-CD4M9 (SEQ ID NO 14), M3-CD4M9(SEQ ID NO : 15)、C22-CD4M9-M3 (SEQ ID NO :16)皆參照此原理進行基因合成，在每個組合多肽的正向引物引入限制性酶切位點Hindlll，在反向引物中設計限制性酶切位點Ecol I和終止密碼子。M3單鏈核苷酸模板(SEQ ID NO 7) (CTT GGA GCA CTA CGA TCT TCA CTT ACG TTC TCT TCA TAT CGA GGA TTG ACG GTA CGA CGA TTG)，正向引物(SEQ ID NO 8) (5，GCG AAG CTT ATG CTT GGA GCA CTA CGA TCT TCA CTT 3，)及反向引物(SEQ ID NO 9) :(5，GCG GGA TCC TTA CAA TCG TCG TAC CGT CTT TCC 3，)；CD4M9 單鏈核苷酸模板 (SEQ ID NO 10) (ACG TTG AAT CGA TCA ACG TTC MT TCT ACG CTA TCA MT CCG AAT AAT CAG TTC ACG CGA CCG TCA CTT ACG CGA ACG CCG GGA)，正向引物(SEQ ID NO 11) (5，GCG AAG CTT ATG ACG TTG AAT CGA TCA ACG TTC AAT 3，)及反向引物(SEQ ID NO 12) (5，GCG GGA TCC TTA TCC CGG CGT TCG CGT AAG TGA 3’)。[0069]PCR 反應條件在 50 μ I 反應體系中(50mM KCl，IOmM Tris-HCl, pH8. 3,2. OmM MgC12,200yM dNTPs)加入擴增引物各50pmol。充分混勻后開始PCR循環(huán)95°C變性I分鐘，94°C變性5分鐘，53°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，共進行30個循環(huán)。最后在72°C保溫10分鐘。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收后用于克隆。[0070]實施例2組合多肽質粒構建[0071]將實施例1中獲得的PCR片段分別使用限制性內切酶HindIII和BamHI雙酶切， 與同樣雙酶切的載體pTMHa30 (購自Amersham公司)連接，連接好的載 體(50 μ I感受態(tài)細胞需25ngDNA)轉化于感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)中，體積不應超過感受態(tài)細胞的5%，輕輕旋轉幾次混勻內容物。冰浴30分鐘；將管放入42°C水浴，定時90秒熱休克；快速將管轉移到冰浴90秒，使細胞冷卻；每管加入800 μ ILB培養(yǎng)基，37°C緩搖45分鐘，使細菌復蘇并表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因；低速離心2分鐘，去上清，留約100 μ I培養(yǎng)基在微量離心管內，重懸菌體；用玻璃鋪菌器將菌液在瓊脂板上鋪勻；將平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱， 12-16小時后可出現菌落。涂板后挑取陽性克隆進行鑒定，結果顯示質粒構建正確。[0072]實施例3 :本發(fā)明組合多肽的表達[0073]將實施例2中獲得的重組質粒分別轉化至E. coli BL21(DE3)中，挑單菌落于37°C 培養(yǎng)過夜，次日按I %轉接于LB (含kana 10 μ g/ml)中，37°C培養(yǎng)至0D600約為O. 6 O. 8 時，加入終濃度為O. 5mmol/L IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3 4h，誘導目的蛋白表達，離心，收集菌體， 超聲破菌后，再離心，收集上清和沉淀，分別經SDS-PAGE (分離膠15%，堆積膠4. 5% )分析目的蛋白的表達部位。結果表明表達產物在沉淀中。[0074]實施例4 :本發(fā)明組合多肽的純化[0075]將實施例3 中收集的菌體用 IOmM Tris-HCl (pH = 8. O) >ImM EDTA, 10% sucrose 超聲洗滌兩次，再用 IOmMTris-HCl (pH = 8. O)、ImMEDTA, I % TritonX-1OO 超聲洗滌一次， 包涵體用 buffer A(6MGuHCl, 50mM phosphate buffer (pH = 8· 0), DTT)溶解后上預平衡的 Ni 柱，用 bufferB (8M Urea, 50mM phosphate buffer (pH = 6. 3))洗至基線，Buffer C 洗脫 (6MGuHCl，冰醋酸，pH= 2. O)，收集洗脫液，用水透析過夜。得蛋白，凍干后，用70%甲酸溶解，用CNBr裂解3小時后，水透析過夜。凍干后再次用buffer A溶解，上預平衡的Ni柱，并用buffer A洗至基線，收集所有流出液，用氧化型谷胱苷肽氧化，水透析后，用反相HPLC分離目標蛋白(安捷倫公司Agilent 1100型HPLC)，分別獲得C22-M3、C22-CD4M9、M3-CD4M9 或C22-CD4M9-M3組合多肽。[0076]實施例5 :本發(fā)明組合多肽的細胞毒性及HIV-1進入抑制活性檢測[0077]抗病毒活性試驗[0078]取105MT-2細胞包被接種在96-孔細胞培養(yǎng)板內，加入連續(xù)3倍稀釋的實驗多肽 (5，1·67，0·56，0· 19，0.021，0mg/ml，每樣作2孔平行試驗)孵化2小時。用100半數致細胞病變滴度(TCID50)的HTLV-1IIB (馬里蘭大學生物醫(yī)學部提供)感染每孔細胞，5天后收取細胞上清液，測定HIV-1P24抗原產量。[0079]細胞毒性試驗[0080]105MT-2細胞接種在96-孔細胞培養(yǎng)板內，加入不同稀釋度的實驗多肽(1，0. 5， O. 25，O. 125，O. 064，O. 032，O. 016，Omg/ml，每樣作2孔平行試驗)，培養(yǎng)5天后，加入MTT試劑，測定OD值。[0081]結果表明C22-M3(SEQID NO : 13)、C22-CD4M9 (SEQ ID NO : 14)、M3-CD4M9 (SEQ ID NO 15)、C22-CD4M9-M3 (SEQ ID NO :16)等組合多肽抑制HIV-1的LD50均達到和好于O.1 ImM 水平。[0082]各組合多肽在使用濃度未顯示任何毒性。[0083]實施例6C22-M3組合·多肽兔源性多克隆抗體的制備[0084]按照分子克隆指南(Coldspring harbor laboratory edition, 1989),將實施例4中純化得到的C22-M3組合多肽與福氏佐劑混合后免疫家兔，加強三次后取血，制得抗 C22-M3組合多肽的兔源多克隆抗體抗血清。[0085]實施例7藥物組合物的制備[0086]以生理鹽水為溶劑制備藥物針劑，每針劑的藥物溶解量為0. 6毫克。體重為50千克的病人，每天注射兩次，每次一劑。[0087]在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求
書所限定的范圍。序列表<110>同濟大學〈120〉抗HIV-1的多肽、其編碼序列及其用途<130)061055〈160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>22<212>PRT<213>C22<400>1Glu Leu AspITrp Leu TrpLys Trp 5Tyr Ile 20Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn He Thr Asn 1015Lys<210>2<211>21<212>PRT<213>M3<400>2Glu Pro Ser·ICys His AlaAsp Ala 5Ala Asn 20Arg Ser Glu Cys Lys Arg Ser lie Ala Pro Asn 1015<210>3<211>28<212>PRT<213>CD4M9<400>3Cys Asn LeuIVal Lys CysAla Ser Cys Asn Leu Arg Cys Asp Ser Leu Gly Leu Leu 51015Ala Gly Ser Glu Cys Ala Cys Gly Pro 2025<210>4
權利要求
1.一種組合多肽，其特征在于，該組合多肽的氨基酸序列為SEQ ID N0:15。
2.—種核酸分子，其編碼權利要求
1所述的組合多肽。
3.權利要求
1所述的組合多肽在制備預防或治療HIV病毒感染的藥物中的應用。
4.一種載體，其特征在于，它含有權利要求
2所述的核酸分子。
5.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它是被權利要求
4所述的載體轉化或轉導的宿主細胞。
6.一種制備抑制HIV病毒的組合多肽的制備方法,其特征在于,該方法包含 (a)在適合表達抑制HIV病毒的多肽或組合多肽的條件下,培養(yǎng)權利要求
5所述的宿主細胞； (b)從培養(yǎng)物中分離出抑制HIV病毒的組合多肽。
7.一種能與權利要求
1所述的組合多肽特異性結合的抗體。
8.—種HIV疫苗，其特征在于，所述疫苗包含權利要求
1所述的組合多肽及藥學上所允許的載體。
專利摘要
本發(fā)明提供了抗HIV-I的多肽和組合多肽，以及這些多肽和組合多肽的編碼序列、表達載體、制備方法和用途。本發(fā)明的多肽和組合多肽是基因重組后表達或通過多肽合成儀合成，工藝簡單，且可提高最終產率和抑制HIV-I的侵入效果，適合工業(yè)化生產。
文檔編號A61K39/00GKCN101899100 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 201010142581
公開日2013年4月3日 申請日期2007年2月2日
發(fā)明者汪世龍, 史鈞, 孫曉宇, 王玫, 何嬌娟, 林楠, 王淵 申請人:同濟大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (5),