專利名稱:制備5’-磷酸二酯酶的方法及用其制備2’-脫氧核苷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種從麥芽根中制備高活力液體5’ -磷酸二酯酶的方法，以及應(yīng)用該酶降解脫氧核糖核酸制備高純度2’ -脫氧核苷酸的方法。
背景技術(shù)：
2’ -脫氧核苷酸為組成遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸(DNA)的重要組成部分，參與細(xì)胞內(nèi)大量的生化反應(yīng)。臨床上，2’-脫氧核苷酸的混合鈉鹽可制備為針劑或口服劑，用于輔助治療免疫低下的患者。近年來隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展，尤其是現(xiàn)代基因工程技術(shù)中大量使用脫氧核苷三磷酸作為PCR的基礎(chǔ)試劑，作為合成脫氧核苷三磷酸的原料-2’-脫氧核苷酸的市場需求日益增加。
目前，2’-脫氧核苷酸的制備主要由酶法降解DNA中獲得，其工藝大體如下1)利用市售的5’-磷酸二酯酶或桔青霉發(fā)酵產(chǎn)生的核酸酶P1，降解由魚白中提取的DNA，獲得酶解液，即2’ -脫氧腺苷酸(dAMP)、2’ -脫氧胞苷酸(dCMP)，2’ -脫氧鳥苷酸(dGMP)和胸苷酸(TMP)的混合物；幻經(jīng)活性炭脫鹽、脫蛋白進(jìn)行純化；幻濃縮干燥后得到混合2’ -脫氧核苷酸的固體。
上述工藝對于制備混合2’ -脫氧核苷酸具有一定的意義，但是對于應(yīng)用到分子生物學(xué)試劑卻沒有實(shí)際作用。因?yàn)榉肿由飳W(xué)試劑需要極高的純度(HPLC純度至少要達(dá)到 98%以上)，以滿足后期的試驗(yàn)需要。
有關(guān)從麥芽根中提取5’-磷酸二酯酶用于降解核糖核酸(RNA)制備核苷酸已有不少報(bào)道，如中國專利公開號CN101012469A提供了一種采用液體5，-磷酸二酯酶制備5，-核苷酸類物質(zhì)的方法；李德瑩等報(bào)道了從麥芽根中提取5’-磷酸二酯酶降解生產(chǎn)5’-核苷酸的方法(華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2002, ) :376-379)。這些報(bào)道中均未提及脫氧核糖核酸的酶解。
有關(guān)從核糖核酸的降解液中提取核苷酸的方法也很多。如中國專利公開號 CN1286259公開了一種使用陽離子樹脂分離5，-核苷酸的方法；中國專利ZL02136839. 2公開了一種使用陰離子樹脂分離5’ -核苷酸的方法；中國專利公開號CN101381382A中提供了一種使用陰離子樹脂分離2’ -脫氧核苷酸的方法。上述方法中大多是以分離5’ -核苷酸為目的，或以制備混合2’ -脫氧核苷酸為目的。
Makoto等使用桔青霉發(fā)酵得到的核酸酶P1，大約有47%的DNA降解為2，-脫氧核苷酸(Food research International, 1996,29(8) 751-755)；吳漢民等亦以同樣的方法降解DNA，并用陰離子交換樹脂分離法分離得到了 2’-脫氧核苷酸，報(bào)道中未提到轉(zhuǎn)化率及2’ -脫氧核苷酸的收率(水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2000，M (3) :275-279)。
上述專利和文獻(xiàn)中所述及的方法，2’_脫氧核苷酸的轉(zhuǎn)化率低、或分離工藝效率低下、或未涉及高純度2’ -脫氧核苷酸的制備。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過廣泛的探索，發(fā)明了一種從麥芽根中制備高活力液體5’ -磷酸二酯酶的方法。然后發(fā)明了應(yīng)用該酶降解脫氧核糖核酸制備2’ -脫氧核苷酸的方法。
因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種從麥芽根中制備5’ -磷酸二酯酶的方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供一種用從麥芽根中制備的5’ -磷酸二酯酶降解DNA生產(chǎn)2’ -脫氧核苷酸，并從酶解液中分離得到高純度的2’ -脫氧核苷酸的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的2’ -脫氧核苷酸的轉(zhuǎn)化率低、或分離工藝效率低下、或未涉及高純度2’ -脫氧核苷酸的制備之類的技術(shù)缺陷。
本發(fā)明的從麥芽根中制備5’_磷酸二酯酶的方法包括如下步驟，(1)浸泡將粉碎或未粉碎的麥芽根與去離子水混合、浸泡，浸泡溫度10-50°C、浸泡時(shí)間1-8小時(shí)；(2)固液分離浸泡結(jié)束后，過濾或離心，收集清液；(3)清液中加入0. 1-0. 5倍的有機(jī)溶劑，并攪拌 1-8小時(shí)，于1000-10000轉(zhuǎn)/min離心去除殘?jiān)?，收集離心液；(4)向離心液中加入0. 5-20 倍離心液體積的有機(jī)溶劑，于室溫下靜置l_24h后，虹吸去除上層的液體，下層的液體攪勻即為高純度液體5’ -磷酸二酯酶。
優(yōu)選的從麥芽根中制備5’-磷酸二酯酶的方法，其中浸泡溫度40-45°C，浸泡時(shí)間為3-5小時(shí)。
更優(yōu)選的從麥芽根中制備5’_磷酸二酯酶的方法其中步驟(1)去離子水用量為麥芽根重量的7-8倍。
所用麥芽根為大麥或燕麥發(fā)芽后的根，也可以為各種植物的根尖部分。優(yōu)選為啤酒工業(yè)中廢棄的麥芽根。麥芽根可浸泡后再進(jìn)行粉碎，也可以粉碎后再浸泡。本發(fā)明優(yōu)選粉碎后再浸泡，粉碎的粒度可在50-400目之間，優(yōu)選為250目-350目。
所用的有機(jī)溶劑可以為甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、二氫呋喃、二甲基亞砜等。本發(fā)明優(yōu)選采用丙酮。第一次加入丙酮的量為0. 1-0. 5倍離心液體積，優(yōu)選為0. 4倍；第二次加入丙酮的量優(yōu)選為4-6倍離心液體積。
由本發(fā)明所制備的5’ -磷酸二酯酶中所含的5’ -磷酸單酯酶活力極低，幾乎檢測不出來活性，非常適合于由脫氧核糖核酸酶解制備2’ -脫氧核苷酸。
本發(fā)明制備2’ -脫氧核苷酸的方法，包括如下步驟；(1)如前述的從麥芽根中制備的方法制備5，-磷酸二酯酶；(2)酶解DNA:配制0.5%-5% (W/V)DNA溶液，加熱到 25-75°C，然后加入上述制備的5，-磷酸二酯酶溶液，加入的酶活為500U-3000U/g DNA，優(yōu)選為1000U-2500U/g DNA，攪勻后于60-65°C反應(yīng)l_24h得酶反應(yīng)液，(3)2，-脫氧核苷酸的分離純化上述酶反應(yīng)液2. OL用氫氧化鈉調(diào)pH至8. 0左右，通過裝有250mL的陰離子交換樹脂的玻璃柱(Φ2. 6cmX70cm)，流速控制在100-200mL/h，上樣結(jié)束后，依次用下列溶液進(jìn)行洗滌或洗脫2500mL氫氧化鈉溶液(pH = 8. 0) U500mL 0. 01mol/L甲酸(I )、 1500mL 0. 15mol/L 甲酸(II )、2000mL 0. 01mol/L 甲酸-0. 05mol/L 甲酸鈉(III)、2000mL 0. lmol/L甲酸-0. 2mol/L氯化鈉(IV )，將I優(yōu)選的制備2’_脫氧核苷酸的方法，包括如下步驟；(1)如前述的從麥芽根中制備的方法制備5，-磷酸二酯酶；(2)酶解DNA 配制1%-3%，(W/V)DNA溶液，加熱到60-65°C， 然后加入上述制備的5，-磷酸二酯酶溶液，加入的酶活為1000U-2500U/g DNA，攪勻后于 60-65°C反應(yīng)7-10h得酶反應(yīng)液；(3) 2’ -脫氧核苷酸的分離純化上述酶反應(yīng)液2. OL用氫氧化鈉調(diào)pH至8. 0左右，通過裝有250mL的陰離子交換樹脂的玻璃柱(Φ2. 6cmX 70cm)， 流速控制在100-200mL/h，上樣結(jié)束后，依次用下列溶液進(jìn)行洗滌或洗脫2500mL氫氧化鈉溶液(pH = 8. 0)、1500mL 0. 01mol/L 甲酸(I )、1500mL 0. 15mol/L 甲酸(II )、 2000mL0. 01mol/L 甲酸-0. 05mol/L 甲酸鈉(III)、2000mL 0. lmol/L 甲酸-0. 2mol/L 氯化鈉(IV)，將I -IV洗脫下來的四種2’ -脫氧核苷酸溶液用氫氧化鈉調(diào)PH8.0-PH10.0，分別用IOOmL的陰離子交換樹脂進(jìn)行吸附(Φ 1. 6cmX 70cm)，流速控制在50_100mL/h，上樣結(jié)束后，用IOOmL去離子水洗滌樹脂柱，棄去洗滌液，最后用150mL 0. lmol/L甲酸_0. 5mol/L 氯化鈉(V )分別從四根柱上洗脫下來2’ -脫氧核苷酸，收集洗脫液，濃縮至10-50mL，加入3-10倍體積的乙醇沉淀出2’ -脫氧核苷酸，經(jīng)過濾、抽干、烘干，分別得到2’ -脫氧胞苷酸、2’ -脫氧腺苷酸、胸苷酸二鈉、2’ -脫氧鳥苷酸二鈉。
經(jīng)HPLC檢測反應(yīng)液，2’-脫氧核苷酸的轉(zhuǎn)化率在80%以上。四種2’-脫氧核苷酸經(jīng)HPLC檢測，其純度均達(dá)到98%以上，四種核苷酸對起始原料DNA的收率約在60%以上。
本發(fā)明的方法所得到的四種2’-脫氧核苷酸純度均在98%以，且分離方法中去除了常用的活性炭脫鹽的方法，極大地提高了產(chǎn)品品質(zhì)，降低了工藝操作難度。
本發(fā)明中所用的陰離子交換樹脂可為各種季胺鹽類樹脂或其它各種型號，本發(fā)明中優(yōu)選采用717，粒度在80-100目。
本發(fā)明中所用的用于調(diào)pH的各種堿液，不限于本發(fā)明中所述，可為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、氨水等，本發(fā)明中優(yōu)選采用氫氧化鈉。
本發(fā)明的特征；
采用本發(fā)明的制備的液體5’ -磷酸二酯酶活力高，無需透析和干燥，可以直接高轉(zhuǎn)化率的由DNA制備2’ -脫氧核苷酸，且無需活性炭脫鹽的方法即可從洗脫液中回收 2’ -脫氧核苷酸，產(chǎn)品的純度可高達(dá)98%以上。
檢測方法
有關(guān)5’ -磷酸二酯酶和5’ -磷酸單酯酶的活力測定參見張群等(生物技術(shù)通報(bào)， 2008年增刊，378-383)的報(bào)道。
HPLC的分析方法
儀器安捷倫1020高效液相色譜儀，UV檢測器。檢測波長254nm。
柱HypersilSAX 5ym(4. 6mmX250mm) 柱溫 25°C。
流動相pH3. 0的磷酸二氫鉀溶液，流速1. OmL/min。


圖1酶液A降解DNA生成的2，-脫氧核苷酸之HPLC圖譜
圖2酶液B降解DNA生成的2，-脫氧核苷酸之HPLC圖譜[0034]圖3酶液C降解DNA生成的2，-脫氧核苷酸之HPLC圖譜
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
稱取粉碎至300目的麥芽根100g，加入去離子水750mL，于45°C浸泡4小時(shí)，期間不停攪拌。然后用二層紗布過濾，棄去殘?jiān)?。約得濾液600mL (酶液A)。經(jīng)檢測，5’-磷酸二酯酶的活力為750U/mL，5，-磷酸單酯酶的活力為120U/mL。
上述濾液加入300mL丙酮，在常溫下攪拌濁后，于lOOOOr/min離心去除殘?jiān)?，得到液體體積為870mL (酶液B)。經(jīng)檢測，5’ -磷酸二酯酶的活力為483U/mL，5’ -磷酸單酯酶的活力為14U/mL。
再在酶液B中加入丙酮約2100mL，在常溫下攪拌2h，然后靜置8h，收集上層溶液用于回收丙酮，得下層溶液約SOmL (酶液C)。經(jīng)檢測，5’-磷酸二酯酶的活力為5821U/mL， 5，-磷酸單酯酶活力為0. 2U/mL。
實(shí)施例2
配制三份10g/L的DNA溶液各1L，加熱到65°C，分別加入酶液A、酶液B和酶液C， 加入的5，-磷酸二酯酶酶活比例為1000U/g DNA(依次為13. 3mL、20. 7mL、l. 7mL)，并于65°C 反應(yīng)他，取樣用HPLC檢測所生成的2，-脫氧核苷酸的量(HPLC圖見附圖，酶液A的反應(yīng)結(jié)果為圖1 ；酶液B的反應(yīng)結(jié)果為圖2 ；酶液C的反應(yīng)結(jié)果為圖3)。結(jié)果見表1.
表 1
權(quán)利要求
1.從麥芽根中制備5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于包括如下步驟，(1)浸泡將粉碎或未粉碎的麥芽根與去離子水混合、浸泡，浸泡溫度10-50°C、浸泡時(shí)間1-8小時(shí)；(2)固液分離浸泡結(jié)束后，過濾或離心，收集清液；(3)清液中加入0. 1-0. 5倍的有機(jī)溶劑，并攪拌1-8小時(shí)，于1000-10000轉(zhuǎn)/min離心去除殘?jiān)?，收集離心液；(4)向離心液中加入0. 5-20 倍離心液體積的有機(jī)溶劑，于室溫下靜置l_24h后，虹吸去除上層的液體，下層的液體攪勻即為高純度液體5’ -磷酸二酯酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的從麥芽根中制備5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于，步驟(1) 去離子水用量為麥芽根重量的7-8倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的從麥芽根中制備5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于，步驟(3) 和的有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、二氫呋喃、二甲基亞砜。
4.制備2’-脫氧核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步驟，(1)根據(jù)權(quán)利要求
1的從麥芽根中制備5’ -磷酸二酯酶的方法從麥芽根中制備5’ -磷酸二酯酶；(2)酶解DNA 配0.5%-5% (W/V)DNA溶液，加熱到25-75°C，然后加入步驟(1)制備的5，-磷酸二酯酶， 加入的酶活為500U-3000U/g DNA，攪勻后于60_65°C反應(yīng)l_24h得酶反應(yīng)液，(3)2，-脫氧核苷酸的分離純化上述酶反應(yīng)液2. OL用氫氧化鈉調(diào)pH至8. 0左右，通過裝有250mL的陰離子交換樹脂的玻璃柱Φ2. 6cmX70cm，流速控制在100_200mL/h，上樣結(jié)束后，依次用下列溶液進(jìn)行洗滌或洗脫2500mL氫氧化鈉溶液pH = 8. 0U500mL0. 01mol/L甲酸(I)、 1500mL 0. 15mol/L 甲酸(II)、2000mL 0. 01mol/L 甲酸-0.05mol/L 甲酸鈉(III)、2000mL 0. lmol/L甲酸-0. 2mol/L氯化鈉(IV)，將I-IV洗脫下來的四種2’ -脫氧核苷酸溶液用氫氧化鈉調(diào)ρΗ8. Ο-ρΗΙΟ. 0，分別用IOOmL的陰離子交換樹脂進(jìn)行吸附Φ 1. 6cmX70cm,流速控制在50-100mL/h，上樣結(jié)束后，用IOOmL去離子水洗滌樹脂柱，棄去洗滌液，最后用150mL 0. lmol/L甲酸-0. 5mol/L氯化鈉(V)分別從四根柱上洗脫下來2’-脫氧核苷酸，收集洗脫液，濃縮至10-50mL，加入3-10倍體積的乙醇沉淀出2’ -脫氧核苷酸，經(jīng)過濾、抽干、烘干， 分別得到2’ -脫氧胞苷酸、2’ -脫氧腺苷酸、胸苷酸二鈉、2’ -脫氧鳥苷酸二鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4的制備2’-脫氧核苷酸的方法，其特征在于，步驟⑵酶解DNA: 配制-3% (W/V)DNA溶液，加熱到60-65 °C，然后加入根據(jù)權(quán)利要求
1的從麥芽根中制備5’ -磷酸二酯酶的方法從麥芽根中制備的5’ -磷酸二酯酶溶液，加入的酶活為 1000U-2500U/g DNA，攪勻后于60_65°C反應(yīng)7_10h得酶反應(yīng)液。
專利摘要
本發(fā)明制備5’-磷酸二酯酶的方法及用其制備2’-脫氧核苷酸的方法提供了一種高活力高純度液體5’-磷酸二酯酶的制備方法，并應(yīng)用該制備的5’-磷酸二酯酶酶法降解脫氧核糖核酸生產(chǎn)2’-脫氧核苷酸。麥芽根粉碎至300目，加入7倍重量的去離子在45℃浸泡4h，紗布過濾，加入0.5倍體積的丙酮，離心去除沉淀，再加入4倍體積的丙酮，分離出5’-磷酸二酯酶，酶活可高達(dá)5000U/mL以上。用該酶降解脫氧核糖核酸，2’-脫氧核苷酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)80％以上。經(jīng)分離純化，制備得到的2’-脫氧核苷的純度與含量均達(dá)到98％以上。
文檔編號C12P19/30GKCN101845422 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201010169002
公開日2012年6月27日 申請日期2010年5月7日
發(fā)明者丁慶豹, 歐伶, 王玥, 許彥梅, 魏曉琨 申請人:上海斯貝生物科技有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan