專利名稱:一種重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及用生物工程技術(shù)獲得重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的方法，其中包括bar基因的克隆、重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法、工程菌的發(fā)酵表達(dá)方法以及重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的分離與純化方法。
背景技術(shù)：
隨著轉(zhuǎn)基因作物的商品化生產(chǎn)，其產(chǎn)品安全性及其是否對(duì)生態(tài)環(huán)境有影響引發(fā)了人們廣泛關(guān)注。許多國(guó)家以立法或其它形式要求轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在上市前必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)已納入國(guó)內(nèi)外檢驗(yàn)檢疫部門的檢測(cè)項(xiàng)目。
轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)主要從兩個(gè)方面入手，一是核酸水平，即檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中是否含有插入的外源基因；二是蛋白質(zhì)水平，即通過(guò)插入外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其功能進(jìn)行檢測(cè)。其中以基于核酸水平定性或定量檢測(cè)技術(shù)較為成熟。如中國(guó)發(fā)明專利公開號(hào) CN1580782描述了可同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中常用的啟動(dòng)子、終止子、篩選標(biāo)記基因、抗除草劑基因、抗蟲基因等9個(gè)外源DNA序列進(jìn)行檢測(cè)分析的低密度基因芯片檢測(cè)方法；中國(guó)發(fā)明專利公開號(hào)CN101343666A描述了用于抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻多重PCR檢測(cè)的試劑盒及檢測(cè)方法；中國(guó)發(fā)明專利公開號(hào)CN1480538描述了一種基于PCR技術(shù)的轉(zhuǎn)基因油菜籽及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)；中國(guó)發(fā)明專利公開號(hào)CN1769488描述了一種基于PCR技術(shù)的轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)方法及所用引物。但核酸檢測(cè)技術(shù)的主要缺點(diǎn)是會(huì)出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。 目前，基于蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)技術(shù)較少，雖然市場(chǎng)上也有研制出的一系列相關(guān)的轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)蛋白的快速檢測(cè)試劑盒，但由于多數(shù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)非國(guó)內(nèi)所有，檢測(cè)試劑價(jià)格昂貴。因此，積極研發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的檢測(cè)技術(shù)，不僅可以建立健全的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管制度，而且可以在國(guó)際貿(mào)易中增強(qiáng)我國(guó)的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。
對(duì)于蛋白質(zhì)水平檢測(cè)的免疫測(cè)定技術(shù)來(lái)說(shuō)，首先要獲得高產(chǎn)量的靶標(biāo)蛋白，并且要保證蛋白的生物學(xué)活性，即可溶性和功能性，然后以此為抗原制備特異的抗體，再應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的測(cè)定。因此，如何獲得高產(chǎn)量的靶標(biāo)蛋白是關(guān)鍵。由于重組蛋白在理化性質(zhì)和生物學(xué)活性上已日趨接近于天然蛋白質(zhì)，人們利用各種高效表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行制備足夠的重組蛋白。其中，因大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)遺傳背景清楚、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快、成本低、易大規(guī)模培養(yǎng)和擁有大量可利用的表達(dá)載體、宿主和純化系統(tǒng)，是最為常用的表達(dá)系統(tǒng)。但不足之處在于，大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白因過(guò)量表達(dá)、環(huán)境脅迫、宿主代謝系統(tǒng)受干擾等原因， 靶標(biāo)蛋白往往以不溶的無(wú)功能的包涵體形式存在。因此，大多數(shù)情況下都需要將無(wú)活性的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成有生物活性的可溶形式，傳統(tǒng)方法是對(duì)包涵體進(jìn)行變性復(fù)性處理，但這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)工，得率很低，而且需要根據(jù)每種蛋白的不同理化性質(zhì)優(yōu)化復(fù)性的條件，可能會(huì)影響到蛋白的完整性。隨著對(duì)大腸桿菌中蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的深入研究，目前已發(fā)展了許多技術(shù)來(lái)提高重組蛋白表達(dá)的可溶性。
其中融合蛋白標(biāo)簽技術(shù)在增溶重組蛋白研究中應(yīng)用廣泛。蛋白標(biāo)簽技術(shù)不僅可以提高重組蛋白的表達(dá)量、可溶性和穩(wěn)定性，而且能避免重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)的降解，簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)的純化過(guò)程，便于目的蛋白的檢測(cè)和純化。其中由六個(gè)組氨酸聚合組成的His標(biāo)簽是經(jīng)常使用的蛋白標(biāo)簽。它的原理是固定在基質(zhì)上的金屬元素能和組氨酸側(cè)鏈間相互作用，使得含有連續(xù)幾個(gè)組氨酸殘基的多肽能有效的保留在色譜柱上，接下來(lái)通過(guò)調(diào)節(jié)咪唑的濃度洗脫基質(zhì)材料，就可以把含有多聚組氨酸序列的多肽洗脫下來(lái)。該系統(tǒng)具有蛋白表達(dá)產(chǎn)率高、表達(dá)產(chǎn)物純化方便以及利于抗體制備等優(yōu)點(diǎn)。但目前大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使通過(guò)融合標(biāo)簽蛋白仍有多數(shù)重組蛋白以包涵體形式存在，因此，需要通過(guò)另一些途徑來(lái)進(jìn)一步提高重組蛋白表達(dá)的可溶性。由于蛋白質(zhì)種類繁多，理化性質(zhì)各異，至今還沒(méi)有找到一種通用的解決方法。
抗除草劑bar基因，編碼膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶(PAT)，通過(guò)催化乙酰輔酶A與草胺磷游離氨基結(jié)合，使草胺磷失去活性。目前，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已將bar基因?qū)胨?、玉米?油菜、大豆等作物中，其中一些轉(zhuǎn)基因作物已大面積種植。但bar基因的表達(dá)產(chǎn)物詳細(xì)的安全性評(píng)價(jià)資料甚少，其安全性評(píng)價(jià)成為制約轉(zhuǎn)基因植物大面積推廣的關(guān)鍵。因此，建立bar 基因表達(dá)蛋白的快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，對(duì)含bar基因的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的蛋白檢測(cè)技術(shù)的方法有重要意義。博慧杰等O007)采用大腸桿菌體外表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)His標(biāo)簽技術(shù)得到以包涵體形式存在于菌體中膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶。因此，進(jìn)一步改進(jìn)現(xiàn)有的試驗(yàn)技術(shù)方法，獲取可溶性表達(dá)的膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶，顯得非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)一種重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的制備方法，通過(guò)該方法可以快速得到大量、高純度、可溶的重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶，該酶可作為抗原用以制備單克隆抗體，用于進(jìn)行含膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性、 定量檢測(cè)，為有效抗原篩選、診斷試劑的開發(fā)以及轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。
所述的一種重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征包括以下工藝步驟
1)設(shè)計(jì)bar基因PCR引物，上游引物barl核苷酸序列如SEQ No. 1所示，下游引物 bar2核苷酸序列如SEQ No. 2所示，采用引物barl和bar2，以質(zhì)粒pDsBar 1300為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得bar基因全長(zhǎng)序列，bar基因全長(zhǎng)序列如SEQ No. 3所示；
2)將得到的bar基因定向克隆到含有T7啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體pET30a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a (+) -bar ；
3)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30a(+)-bar轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)宿主菌中，構(gòu)建工程菌 BL21/pET30a(+)-bar ；
4)將工程菌BL21/pET30a(+)-bar發(fā)酵培養(yǎng)，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，使工程菌內(nèi)獲得特異性表達(dá)蛋白；
5)將得到的特異性表達(dá)蛋白進(jìn)行增加可溶性處理，然后進(jìn)行分離提取，得到膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶粗制品；
6)將膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶粗制品進(jìn)行分離純化，即得到膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶純
P
m ；
7)純品經(jīng)透析、冷凍干燥后，置于-70°C超低溫冰箱中保存。
所述的一種重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于所述的步驟1)中 PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性^iin ；94°C變性50s，55°C退火50s，72°C延伸50s，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72°C再延伸lOmin。
所述的一種重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于所述的步驟4)中工程菌BL21/pET30a(+)-bar在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6時(shí)，加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷至終濃度為ImM，然后在30°C低溫下誘導(dǎo)表達(dá)4h，使工程菌內(nèi)獲得特異性表達(dá)蛋白。
所述的一種重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于步驟幻中特異性表達(dá)蛋白進(jìn)行增加可溶性處理具體步驟包括
a)發(fā)酵培養(yǎng)后的工程菌，用含有50mM NaH2PO4,300mM NaCl和20mM咪唑且pH為 8. O的低咪唑濃度結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再在菌體中加入溶菌酶、核糖核酸酶A、脫氧核糖核酸苷酶I，終濃度分別為100 μ g/mL、200 μ g/mL、20 μ g/mL,冰上作用20 30min ；
b)接著在上述溶液中依次加入二硫蘇糖醇、N-十二烷基肌氨酸鈉和脫氧膽酸鈉， 終濃度分別為2. 5 10mM、1 2. 5%和0. 2%，冰上作用20 30min，再進(jìn)行冰上超聲破碎 IOmin ；
c)破碎后在溫度4°C下進(jìn)行高速離心，離心速度為12000 14000r/m，離心10 20min后，棄沉淀取上清，然后在上清中加入終濃度為1 2%的聚乙二醇辛基苯基醚，過(guò) 0. 45 μ m濾膜后，得到膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶粗制品。
所述的一種重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于步驟6)中膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶粗制品進(jìn)行分離純化具體步驟包括先將膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶粗制品與 M-NTA瓊脂糖在4°C下結(jié)合1小時(shí)，再將該混合物裝入空色譜柱；然后先用漂洗緩沖液洗柱，再用低咪唑濃度的洗脫緩沖液洗脫去除雜蛋白，最后用高咪唑濃度的洗脫緩沖液收集目的蛋白，即可獲得膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶純品。
所述的一種重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于所述的漂洗緩沖液含有50mM NaH2PO4,300mM NaCl和50mM咪唑，所述的低咪唑濃度的洗脫緩沖液含有50mM NaH2PO4,300mM NaCl和75 125mM咪唑，pH為8. 0，所述的高咪唑濃度的洗脫緩沖液含有 50mM NaH2PO4、300mM NaCl 和 150 250mM 咪唑，pH 為 8. O。
大腸桿菌表達(dá)的膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)其主要以包涵體的形式存在于沉淀中。主要原因可能是其表達(dá)量過(guò)高，表達(dá)產(chǎn)物來(lái)不及形成正確的空間構(gòu)象。因而，發(fā)生了大量聚集而形成包涵體。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)通過(guò)降低培養(yǎng)溫度誘導(dǎo)重組蛋白，降低無(wú)活性聚合體形成的速率，減少包涵體的形成；( 用二硫蘇糖醇、N-十二烷基肌氨酸鈉和脫氧膽酸鈉進(jìn)行處理，結(jié)合超聲破碎相結(jié)合的物理手段，洗滌除去菌體中的脂類和膜蛋白，使目的蛋白以可溶性形式最大限度地釋放出來(lái)；C3)利用組氨酸蛋白標(biāo)簽融合表達(dá)重組蛋白，降低宿主對(duì)所表達(dá)產(chǎn)物的降解，提高膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性，有利于后續(xù)的分離純化；(4)所用的M-NTA Agarose蛋白純化系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單，依據(jù)6個(gè)組氨酸中咪唑基與M離子的螯合，使表達(dá)蛋白得到純化，具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)，且得到的蛋白純度高；(5)在鎳親和層析過(guò)程中，上柱前向樣品緩沖液中加入少量咪唑(終濃度20mM)是一個(gè)重要步驟，有助于減少非特異性蛋白與Ni-NTA組氨酸基質(zhì)結(jié)合；(6)在蛋白掛柱后，使用含 75 125mM咪唑濃度的漂洗緩沖液沖洗層析柱，可以有效地去除非特異性結(jié)合蛋白，再用含150 225mM咪唑濃度的洗脫緩沖液沖洗層析柱，可以獲得高純度的重組蛋白；(7)純化獲得的重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶，其穩(wěn)定性好、生物學(xué)活性較高；(8)緊鄰插入序列上游含有腸激酶切割位點(diǎn)，用腸激酶切割融合蛋白，可將6個(gè)組氨酸標(biāo)簽完全去除；(8)目前尚未有市售的膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶，本發(fā)明專利對(duì)于獲得高純度的膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶有積極的幫助，并可用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在蛋白水平的分子檢測(cè)，對(duì)類似的外源蛋白的研發(fā)有重要的指導(dǎo)作用。


圖1質(zhì)粒pDsBar 1300總DNA中bar基因的PCR擴(kuò)增圖；
圖 1 中 M 標(biāo)準(zhǔn) DNA 分子標(biāo)記(IOObp) ；1 質(zhì)粒 pDsBar 1300 總 DNA ；
圖2pET30a (+) -bar重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖；
圖3為重組質(zhì)粒pET30a⑴-bar的BamH I和Hind III雙酶切鑒定圖；
圖3中Ml 標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(IOObp) ；M2 標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(λ DNA/Hind III)； 1 重組質(zhì)粒pET30a(+)-bar雙酶切產(chǎn)物；
圖4為BL21/pET30a(+)-bar菌體中表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)圖；
圖4中M 低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 重組表達(dá)菌BL21/pET30a(+)-bar誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；2 重組表達(dá)菌BL21/pET30a(+)-bar未誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；3 空載表達(dá)菌BL21/pET30a(+)誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；4 空載表達(dá)菌BL21/pET30a (+)未誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；
圖5BL21/pET30a(+)-bar菌體中表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析圖；
圖5中M 低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 重組表達(dá)菌BL21/pET30a(+)-bar誘導(dǎo)表達(dá)的上清；2 重組表達(dá)菌BL21/pET30a(+)-bar誘導(dǎo)表達(dá)的沉淀；3 重組表達(dá)菌BL21/ pET30a(+)-bar誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；4 重組表達(dá)菌BL21/pET30a(+)-bar未誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；5 空載表達(dá)菌BL21/pET30a(+)誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；6 空載表達(dá)菌BL21/ pET30a(+)未誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；
圖6BL21/pET30a(+)-bar菌體中表達(dá)產(chǎn)物增溶性處理后的可溶性分析圖；
圖6中M 低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 重組表達(dá)菌BL21/pET30a(+)-bar誘導(dǎo)表達(dá)的沉淀；2 重組表達(dá)菌BL21/pET30a(+)-bar誘導(dǎo)表達(dá)的上清；3 重組表達(dá)菌BL21/ pET30a(+)-bar誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；4 重組表達(dá)菌BL21/pET30a(+)-bar未誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；5 空載表達(dá)菌BL21/pET30a(+)誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；6 空載表達(dá)菌BL21/ pET30a(+)未誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；
圖7為親和層析過(guò)柱純化收集產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖；
圖7中M 低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 :50mM咪唑；2 :75mM咪唑；3 :100mM咪唑；4 125mM咪唑；5 :150mM咪唑；6 :175mM咪唑；7 :200mM咪唑；8 :225mM咪唑；9 :250mM咪唑第一次；10 :250mM咪唑第二次；
圖8為純化后重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的SDS-PAGE分析圖；
圖8中M 低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 純化后的重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶；2 重組表達(dá)菌BL21/pET30a(+)-bar誘導(dǎo)表達(dá)的沉淀；3 重組表達(dá)菌BL21/pET30a (+)-bar誘導(dǎo)表達(dá)的上清；4 重組表達(dá)菌BL21/pET30a(+)-bar誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；5 重組表達(dá)菌BL21/ pET30a(+)-bar未誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；6 空載表達(dá)菌BL21/pET30a(+)誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；7 空載表達(dá)菌BL21/pET30a(+)未誘導(dǎo)表達(dá)的菌體總蛋白；
圖9為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1 寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)bar基因全長(zhǎng)的核苷酸序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，
上游引物barl CGGGATCCATGAGCCCAGAACGACGC, 5，端設(shè)計(jì)有 BamH I 限制性內(nèi)切酶序列(劃線部分)，其核苷酸序列如SEQ No. 1所示；
下游引物bar2 :CCCAAGCTTATCAAATCTCGGTGACGGGCAGG, 3，端設(shè)計(jì)有 Hind III限制性內(nèi)切酶序列(劃線部分)，其核苷酸序列如SEQ No. 2所示。
實(shí)施例2 =PCR擴(kuò)增bar基因目的片段
以質(zhì)粒pDsBar 1300總DNA為模板，采用引物barl和kir2擴(kuò)增bar基因序列。 PCR反應(yīng)體系為25μ L總體積中含有10/139反應(yīng)緩沖液2.5“1^，25111^%(12，2. 5mM dNTP， 10 μ M 引物 barl，10 μ M 引物 bar2，質(zhì)粒 DNA IOOng, 0. 5UTaq DNA 聚合酶，加 ddH20 補(bǔ)足體積 M 25 μ L0 PCR 反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 ^iin ；94°C變性 50s，55°C退火 50s，72°C延伸 50s， 共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72°C再延伸10min，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，bar基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在500 750bp之間有1條特異性條帶，與預(yù)期的結(jié)果相符。
實(shí)施例3 重組載體的構(gòu)建和序列測(cè)定
PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖電泳分離后回收目的片段，純化后的PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pET30a(+)各自進(jìn)行BamH I和Hind III雙酶切處理，分別回收帶有雙粘性末端的目的片段和表達(dá)載體。在T4連接酶的作用下，16°C連接池，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a (+) -bar, 如圖2所示。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，如圖3所示。重組質(zhì)粒DNA在500 750bp之間和4361 6557bp之間分別有特異性的目的基因條帶和pET30a(+)DNA載體條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。挑選陽(yáng)性克隆交上海生物工程有限公司測(cè)定bar基因的序列。其核苷酸序列如SEQ No. 3所示，測(cè)序結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的完全一致，bar基因片段的大小為552bp，且讀碼框正確，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
實(shí)施例4 重組表達(dá)bar基因大腸桿菌BL21 (DE3)的構(gòu)建
將重組質(zhì)粒pET30a(+)-bar轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE!3)感受態(tài)細(xì)菌中，在含有Kan 的LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜，然后挑取白色菌落抽質(zhì)粒經(jīng)電泳鑒定，得到BL21/pET30a (+) -bar表達(dá)工程菌。
實(shí)施例5 :BL21/pET30a(+)-bar表達(dá)工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)
挑取BL21/pET30a(+)-bar單個(gè)菌落，接種于含終濃度為30 μ g/mL卡那霉素(Kan) 的LB液體培養(yǎng)基中(1L溶液中含有IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和10gNaCl，pH 7. 0),37 °C 過(guò)夜培養(yǎng)。第二天以2%接種量接入新鮮的含Kan終濃度為30 μ g/mL的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C繼續(xù)培養(yǎng)3 4h，至菌密度OD6tltl達(dá)到0.6。誘導(dǎo)之前取ImL樣品，作為未誘導(dǎo)對(duì)照。在剩余的菌液中加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷至終濃度lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，收獲菌體。
實(shí)施例6 :BL21/pET30a(+)-bar表達(dá)工程菌發(fā)酵菌體中表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)
將對(duì)照和誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體分別取ImL離心去上清，沉淀各自加入100 μ L的 2XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液重懸菌體，樣品在100°C沸水鍋中煮沸5min，取20 μ L進(jìn)行 15%的SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果可見(jiàn)，異丙基硫代_ β -D-半乳糖苷誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的重組菌相比，在30KDa附近明顯增加了一條表達(dá)量較高的蛋白條帶，產(chǎn)物表達(dá)量約占總菌體蛋白的50%以上，而空載體轉(zhuǎn)化菌pET30a(+)誘導(dǎo)后在同一位置未出現(xiàn)相應(yīng)的蛋白帶，如圖4 所示。
實(shí)施例7 重組基因工程大腸桿菌的保存
工程菌加3O %甘油，-7O度保存。
實(shí)施例8 重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的可溶性分析
(1)菌體破碎與裂解將BL21/pET30a(+)-bar表達(dá)工程菌發(fā)酵菌體用Tris緩沖液(pH8.0)重懸沉淀。加入溶菌酶、核糖核酸酶A、脫氧核糖核酸酶I，終濃度依次為 100 μ g/mL、200 μ g/mL、20 μ g/mL,冰浴作用 20min。13000r/m, 4°C，離心 20min，分別收集沉
淀和上清。
(2)重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶可溶性的分析分別取上清和沉淀，各自加入 100 μ 1的2X SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，100°C煮沸5min，取20μ 1進(jìn)行15%的SDS-PAGE 電泳鑒定。結(jié)果表明，上清和沉淀在靠近30KDa分子量處均產(chǎn)生了明顯的表達(dá)條帶，但是沉淀樣品中重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶含量較高，說(shuō)明其主要以包涵體形式存在，如圖5所示。
實(shí)施例9 優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件提高重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的溶解性
為了獲得可溶性表達(dá)的重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶，先后采用了以下方法優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件⑴搖菌溫度由37°C降至30°C和20°C; (2)縮短異丙基硫代-β _D_半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間，由4h降至池和Ih ； (3)降低異丙基硫代- β -D-半乳糖苷的濃度，由ImM降至0. 5mM和0. 25mM ； (4)升高異丙基硫代-β -D-半乳糖苷誘導(dǎo)前菌體的0D_值，由0. 6提高至0. 8和1. 0。除了搖菌溫度下降能提高重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的可溶性外，其它處理的效果均不明顯，大部分重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶仍在沉淀中。說(shuō)明溫度較低有利于重組蛋白的可溶性增加。
實(shí)施例10 重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的可溶性增強(qiáng)的處理
(1)菌體細(xì)胞裂解BL21/pET30a(+)-bar表達(dá)工程菌發(fā)酵培養(yǎng)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷至終濃度lmm0l/L，3(TC低溫下誘導(dǎo)表達(dá)4h，收集菌體。用結(jié)合緩沖液 (50mM NaH2PO4,300mM NaCl、20mM咪唑)重懸細(xì)胞，每克菌體加2 5mL結(jié)合緩沖液，加溶菌酶、核糖核酸酶A、脫氧核糖核酸酶I，終濃度依次為100 μ g/mL、200 μ g/mL和20 μ g/mL, 冰浴20min。
(2)提高可溶性重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶效率的方案在細(xì)胞裂解液中加入二硫蘇糖醇、N-十二烷基肌氨酸鈉和0. 2%的脫氧膽酸鈉，冰上超聲破碎IOmin (每次超聲8s，間隔6s)。4°C下，13000r/m,20min離心，分別收集沉淀和上清。將上清中加入2%的聚乙二醇辛基苯基醚，用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后進(jìn)行過(guò)柱純化。設(shè)計(jì)16種不同的試驗(yàn)方案對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行處理，以尋找能提高蛋白可溶性的最佳方案。結(jié)果表明，N-十二烷基肌氨酸鈉終濃度在1. 0% 2. 5%時(shí)，均能有效提高重組蛋白的可溶性，但為了防止其對(duì)重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的活性造成影響，選擇較低濃度1. 0% N-十二烷基肌氨酸鈉；二硫蘇糖醇終濃度在2. 5 IOmM時(shí)，能提高蛋白可溶性，其中5mM 二硫蘇糖醇效果最好。此外，先加二硫蘇糖醇比先加N-十二烷基肌氨酸鈉的增溶效果要好，可能是二硫蘇糖醇處理后促進(jìn)了 N-十二烷基肌氨酸鈉對(duì)菌體的裂解。超聲破碎處理的時(shí)間越長(zhǎng)越能提高蛋白的可溶性，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)引起蛋白的降解，因此選擇超聲破碎lOmin。經(jīng)過(guò)二硫蘇糖醇、N-十二烷基肌氨酸鈉和脫氧膽酸鈉處理后得到的上清液，在過(guò)柱前，不加入聚乙二醇辛基苯基醚處理較加入聚乙二醇辛基苯基醚處理得到的可溶性蛋白量少，說(shuō)明，聚乙二醇辛基苯基醚有利于重組蛋白的掛柱，可以較少洗脫過(guò)程中重組蛋白的損失。
表1不同處理對(duì)重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶可溶性的影響
權(quán)利要求
1.一種重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征包括以下工藝步驟1)設(shè)計(jì)bar基因PCR引物，上游引物barl核苷酸序列如SEQNo. 1所示，下游引物bar2 核苷酸序列如SEQ No. 2所示，采用引物barl和bar2，以質(zhì)粒pDsBar 1300為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得bar基因全長(zhǎng)序列，bar基因全長(zhǎng)序列如SEQ No. 3所示；2)將得到的bar基因定向克隆到含有T7啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體pET30a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET30a(+)-bar ；3)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30a(+)-bar轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE!3)宿主菌中，構(gòu)建工程菌 BL21/pET30a(+)-bar ；4)將工程菌BL21/pET30a(+)-bar發(fā)酵培養(yǎng)，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，使工程菌內(nèi)獲得特異性表達(dá)蛋白；5)將得到的特異性表達(dá)蛋白進(jìn)行增加可溶性處理，然后進(jìn)行分離提取，得到膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶粗制品；6)將膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶粗制品進(jìn)行分離純化，即得到膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶純品；7)純品經(jīng)透析、冷凍干燥后，置于-70°C超低溫冰箱中保存；上述步驟幻中特異性表達(dá)蛋白進(jìn)行增加可溶性處理具體步驟包括a)發(fā)酵培養(yǎng)后的工程菌，用含有50mMNaH2PO4,300mM NaCl和20mM咪唑且pH為8. 0的低咪唑濃度結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再在菌體中加入溶菌酶、核糖核酸酶A、脫氧核糖核酸苷酶I，終濃度分別為100 μ g/mL、200 μ g/mL、20 μ g/mL,冰上作用20 30min ；b)接著在上述溶液中依次加入二硫蘇糖醇、N-十二烷基肌氨酸鈉和脫氧膽酸鈉，終濃度分別為2. 5 IOmMU 2. 5%和0. 2%，冰上作用20 30min，再進(jìn)行冰上超聲破碎 IOmin ；c)破碎后在溫度4°C下進(jìn)行高速離心，離心速度為12000 14000r/m，離心10 20min 后，棄沉淀取上清，然后在上清中加入終濃度為1 2%的聚乙二醇辛基苯基醚，過(guò)0. 45 μ m 濾膜后，得到膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶粗制品。
2.如權(quán)利要求
1所述的一種重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于所述的步驟1)中PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min ；94°C變性50s，55°C退火50s，72°C延伸50s， 共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72°C再延伸lOmin。
3.如權(quán)利要求
1所述的一種重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于所述的步驟4)中工程菌BL21/pET30a(+)-bar在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD_為0.6時(shí)，加入異丙基硫代- β -D-半乳糖苷至終濃度為ImM，然后在30°C低溫下誘導(dǎo)表達(dá)4h，使工程菌內(nèi)獲得特異性表達(dá)蛋白。
4.如權(quán)利要求
1所述的一種重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于步驟6) 中膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶粗制品進(jìn)行分離純化具體步驟包括先將膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶粗制品與M-NTA瓊脂糖在4°C下結(jié)合1小時(shí)，再將該混合物裝入空色譜柱，然后先用漂洗緩沖液洗柱，再用低咪唑濃度的洗脫緩沖液洗脫去除雜蛋白，最后用高咪唑濃度的洗脫緩沖液收集目的蛋白，即可獲得膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶純品。
5.如權(quán)利要求
4所述的一種重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于所述的漂洗緩沖液含有50mM NaH2PO4,300mM NaCl和50mM咪唑，所述的低咪唑濃度的洗脫緩沖液含有50mM NaH2PO4,300mM NaCl和75 125mM咪唑，pH為8. 0，所述的高咪唑濃度的洗脫緩沖液含有 50mM NaH2PO4,300mM NaCl 和 150 250mM 咪唑，pH 為 8. 0。
專利摘要
一種重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
。其包括以下步驟1)設(shè)計(jì)bar基因PCR引物，PCR擴(kuò)增得到bar基因；2)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a(+)-bar；3)構(gòu)建工程菌BL21/pET30a(+)-bar；4)發(fā)酵培養(yǎng)，獲得特異性表達(dá)蛋白；5)特異性表達(dá)蛋白進(jìn)行增加可溶性處理；6)分離純化膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶粗制品；7)保存。本發(fā)明設(shè)計(jì)合理，通過(guò)本發(fā)明可以快速得到大量、高純度、可溶的重組膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶，該酶可作為抗原用以制備單克隆抗體，用于進(jìn)行含膦絲菌素乙酞轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性、定量檢測(cè)，為有效抗原篩選、診斷試劑的開發(fā)以及轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/54GKCN101864438 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201010177058
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2010年5月19日
發(fā)明者劉連盟, 王玲, 黃世文 申請(qǐng)人:中國(guó)水稻研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan