專利名稱:一種嗜酸乳桿菌活菌制劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和治療病毒性疾病的制劑，具體是一種嗜酸乳桿菌活菌 制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病毒性疾病一直困擾畜禽養(yǎng)殖業(yè)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，目前有多種細(xì)胞因子通 過基因工程菌得以表達(dá)并制成制劑，如豬、雞、牛干擾素和白介素等。目前，利用分子生物學(xué) 技術(shù)構(gòu)建基因工程菌株來防治畜禽傳染病等已取得很大進(jìn)展，例如，免疫增強劑是通過基 因工程技術(shù)構(gòu)建了高效表達(dá)豬干擾素(α、β和Υ)的工程酵母菌株，基因工程抗菌肽是利 用基因工程技術(shù)構(gòu)建表達(dá)抗菌肽cecA-mil,magainin及其突變體的工程畢赤酵母菌株。
公開號為CN 1589776A、名稱為“一種微囊化酵母及其應(yīng)用”的專利申請?zhí)岢?，采?微囊化基因工程酵母菌，通過進(jìn)入人體消化道生長代謝并分泌蛋白藥物，用于治療人體某 些疾病。此外，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌作為一種益生菌，目前也被用于食品級表達(dá)系統(tǒng)的 研究。
現(xiàn)有的采用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌作為宿主菌制備的用于預(yù)防和治療 畜禽病毒性疾病的制劑存在如下缺陷
(1)蛋白產(chǎn)物純化方法繁瑣、純化成本高昂；
(2)為保證蛋白的生物學(xué)活性及穩(wěn)定性，制劑需冷鏈運輸和低溫保存。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提出一種可耐受胃酸環(huán)境并進(jìn)入腸 道定植、正常生長代謝時產(chǎn)生乳酸和乙酸、造成腸道低PH環(huán)境、從而抑制有害菌在人或動 物腸道的生長和繁殖的嗜酸乳桿菌活菌制劑。
本發(fā)明的目的還在于提供所述嗜酸乳桿菌活菌制劑的制備方法。
本發(fā)明的目的還在于提供所述嗜酸乳桿菌活菌制劑的應(yīng)用。
嗜酸乳桿菌是普遍存在于人或動物腸道中的益生乳酸桿菌，本發(fā)明提出以嗜酸乳 桿菌為宿主菌在人或動物腸道作為抗病毒多肽的細(xì)胞反應(yīng)器，與酵母菌、大腸桿菌和枯草 芽孢桿菌相比，嗜酸乳桿菌本身就是人或動物腸道的正常菌群，可定植于動物腸道，并且能 耐受胃酸環(huán)境，進(jìn)入腸道后能發(fā)揮益生作用。因此，以嗜酸乳桿菌作為宿主菌進(jìn)行基因改造 后，作為食物或藥物進(jìn)入人或動物消化道發(fā)揮作用，更易被接受。
本發(fā)明的嗜酸乳桿菌活菌制劑由一種攜帶有表達(dá)人或動物各種特異性的干擾素 或白介素家族中的一種或幾種基因工程嗜酸乳桿菌制成；
所述基因工程嗜酸乳桿菌是在重組蛋白N末端連接原核細(xì)胞信號肽，采用分泌型 表達(dá)載體并以抗性基因作篩選標(biāo)記；克隆干擾素或白介素成熟蛋白基因構(gòu)建重組質(zhì)粒；用 電穿孔法導(dǎo)入感受態(tài)嗜酸乳桿菌后篩選得到。
所述嗜酸乳桿菌活菌制劑的制備方法包括如下步驟[0014](1)用基因克隆常規(guī)手段，在重組蛋白N末端連接原核細(xì)胞信號肽，采用分泌型表 達(dá)載體并以抗性基因作篩選標(biāo)記；克隆干擾素或白介素成熟蛋白基因構(gòu)建重組質(zhì)粒；用電 穿孔法導(dǎo)入感受態(tài)嗜酸乳桿菌后進(jìn)行篩選，得到性狀穩(wěn)定的基因工程嗜酸乳桿菌活菌；
(2)步驟(1)得到的基因工程嗜酸乳桿菌的濃縮液中添加載體后低溫20-40°C干 燥，或者步驟(1)得到的嗜酸乳桿菌濃縮液中添加保護(hù)劑后冷凍干燥制備，制劑中含嗜酸 乳桿菌活菌體數(shù)量為lif-ioncfu/g。
步驟(2)中所述載體是植物性載體或礦質(zhì)載體。其中植物性載體主要指淀粉，礦 質(zhì)載體包括磷酸鈣，磷酸氫鈣和沸石粉中的一種或幾種。所述保護(hù)劑是脫脂奶粉，蔗糖和海 藻糖中的一種或幾種。
得到的嗜酸乳桿菌活菌制劑可用于制備預(yù)防和治療病毒性疾病的制劑或藥物。其 所含基因工程嗜酸乳桿菌活菌體通過作為飼料或食品或飲料添加劑，加入食品或飼料中、 或加入飲水中通過自由飲水、或通過飲水灌服的方式進(jìn)入人或動物腸道內(nèi)定植，并高效分 泌表達(dá)相應(yīng)的細(xì)胞因子，由腸道吸收后用于預(yù)防和治療病毒性疾病。
該制劑通過飼料或食品或飲料添加、自由飲水添加或飲水灌服等方式進(jìn)入人或動 物消化道，其中所含的基因工程嗜酸乳桿菌活菌體可耐受胃酸環(huán)境后到達(dá)人或動物腸道內(nèi) 生長代謝，并特異性分泌表達(dá)抗病毒多肽，達(dá)到抗病毒和治療病毒性疾病效果。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點
(1)本發(fā)明采用的嗜酸乳桿菌本身是一種腸道正常菌，在人或動物腸道內(nèi)可定植 并正常生長代謝；
(2)嗜酸乳桿菌作為一種益生菌，在人或動物腸道生長代謝時，可造成腸道低PH 環(huán)境，抑制病原菌的生長；
(3)嗜酸乳桿菌具有良好的胃酸環(huán)境耐受性能，因此不需進(jìn)行繁瑣的制劑包被工 藝。
(4)本發(fā)明制劑的制備方法中，省去了方法復(fù)雜而且制劑成本高的蛋白純化工藝， 并且克服了常規(guī)基因工程藥物運輸和保藏不便的缺點。
具體實施方式
實施例
分別構(gòu)建豬α干擾素(PoIFN-α )和豬、干擾素(PoIFN-Y)基因工程嗜酸乳桿 菌，按常規(guī)方法和條件進(jìn)行工程菌的培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心分離菌體，將分離得到的菌泥 按α y = 1 0.5-1混合，再與淀粉按重量1 1-1. 5的比例混合均勻，在鼓風(fēng)烘箱中 以35°C的熱風(fēng)烘干至含水分6-8%，即得制劑。制劑中基因工程嗜酸乳桿菌活菌體數(shù)量為 109cfu/go
將得到的制劑通過飲水灌服的方式給豬只服用，并保證進(jìn)入豬只體內(nèi)的基因工程 嗜酸乳桿菌活菌體總量達(dá)到IO9以上時，可有效預(yù)防和治療豬病毒性流行性腹瀉、豬流感、 豬輪狀病毒感染、豬傳染性胃腸炎、藍(lán)耳病等病毒感染。
權(quán)利要求
一種嗜酸乳桿菌活菌制劑，其特征在于由一種攜帶有表達(dá)人或動物各種特異性的干擾素或白介素家族中的一種或幾種基因工程嗜酸乳桿菌制成，制劑中含嗜酸乳桿菌活菌體數(shù)量為107 1011cfu/g。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的嗜酸乳桿菌活菌制劑，其特征在于其基因工程嗜酸乳桿菌是 在重組蛋白N末端連接原核細(xì)胞信號肽，采用分泌型表達(dá)載體并以抗性基因作篩選標(biāo)記； 克隆干擾素或白介素成熟蛋白基因構(gòu)建重組質(zhì)粒；用電穿孔法導(dǎo)入感受態(tài)嗜酸乳桿菌后篩 選得到。
3.權(quán)利要求
1或2所述嗜酸乳桿菌活菌制劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)用基因克隆常規(guī)手段，在重組蛋白N末端連接原核細(xì)胞信號肽，采用分泌型表達(dá)載 體并以抗性基因作篩選標(biāo)記；克隆干擾素或白介素成熟蛋白基因構(gòu)建重組質(zhì)粒；用電穿孔 法導(dǎo)入感受態(tài)嗜酸乳桿菌后進(jìn)行篩選，得到性狀穩(wěn)定的基因工程嗜酸乳桿菌活菌；(2)步驟⑴得到的基因工程嗜酸乳桿菌的濃縮液中添加載體后低溫20-40°C干燥，或 者步驟(1)得到的嗜酸乳桿菌濃縮液中添加保護(hù)劑后冷凍干燥制備，制劑中含嗜酸乳桿菌 活菌體數(shù)量為IO7-IO11Cfu/^
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述載體是植物性載體或礦質(zhì) 載體；其中植物性載體是淀粉，礦質(zhì)載體包括磷酸鈣，磷酸氫鈣和沸石粉中的一種或幾種； 所述保護(hù)劑是脫脂奶粉，蔗糖和海藻糖中的一種或幾種。
5.權(quán)利要求
1或2所述嗜酸乳桿菌活菌制劑在制備預(yù)防和治療病毒性疾病的制劑或藥 物中的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種可耐受胃酸環(huán)境并進(jìn)入腸道定植、正常生長代謝時產(chǎn)生乳酸和乙酸、造成腸道低pH環(huán)境、從而抑制有害菌在人或動物腸道的生長和繁殖的嗜酸乳桿菌活菌制劑，由一種攜帶有表達(dá)人或動物各種特異性的干擾素或白介素家族中的一種或幾種基因工程嗜酸乳桿菌制成。其制備方法包括在重組蛋白N末端連接原核細(xì)胞信號肽，采用分泌型表達(dá)載體并以抗性基因作篩選標(biāo)記；克隆干擾素或白介素成熟蛋白基因構(gòu)建重組質(zhì)粒；用電穿孔法導(dǎo)入感受態(tài)嗜酸乳桿菌后進(jìn)行篩選；得到的基因工程嗜酸乳桿菌的濃縮液中添加載體后低溫干燥，或者添加保護(hù)劑后冷凍干燥制備。所述嗜酸乳桿菌活菌制劑可用于制備預(yù)防和治療病毒性疾病的制劑或藥物。
文檔編號A23L2/52GKCN101892188SQ201010191693
公開日2010年11月24日 申請日期2010年5月28日
發(fā)明者李清雄, 林向劍, 鄺金媚, 陶正國 申請人:廣州立達(dá)爾生物科技有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan