專(zhuān)利名稱(chēng):卷煙全煙氣染毒的細(xì)胞毒性測(cè)試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及卷煙煙氣體外毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種卷煙全煙氣染毒的細(xì)胞毒性測(cè)試方法。
背景技術(shù)：
卷煙煙氣的體外毒理學(xué)研究已經(jīng)成為評(píng)價(jià)吸煙對(duì)健康危害的重要手段之一。卷煙煙氣是一種由幾千種化學(xué)物質(zhì)組成的復(fù)雜的氣溶膠，煙氣成分分布于煙氣氣溶膠的粒相和氣相之中。煙氣粒相中的主要有害成分有煙堿、芳香胺類(lèi)、酚類(lèi)、煙草特有亞硝胺、多環(huán)芳烴類(lèi)化合物等；co、氮氧化物及揮發(fā)性有機(jī)化合物等有害成分分布于氣相中；醛、酮類(lèi)羰基化合物，氫氰酸、氨等有害成分于氣、粒相中均有分布。同時(shí)，隨著煙氣的陳化時(shí)間，煙氣成分在氣相和粒相之間的分配會(huì)有所改變。以往研究中，有關(guān)卷煙煙氣的體外毒理學(xué)研究大多集中于煙氣總粒相物的細(xì)胞毒性和基因毒性方面，僅研究其中煙氣總粒相物的毒性影·響不能夠全面真實(shí)地反映煙氣混合物體系的生物學(xué)效應(yīng)。近年來(lái)，對(duì)于卷煙煙氣中氣相組分的收集和體外毒性的測(cè)試方法也發(fā)展建立起來(lái)。加拿大衛(wèi)生部推薦了進(jìn)行卷煙煙氣總粒相物和氣相組分的體外毒性測(cè)試方法(Health Canada Official Method T-501 ;T_502 ；Τ-503 )，但是這些方法均是對(duì)卷煙煙氣中部分組分的毒性效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
目前，有關(guān)卷煙煙氣體外染毒方法國(guó)內(nèi)已有專(zhuān)利公開(kāi)。專(zhuān)利(公開(kāi)號(hào)CN101671733)是一種改進(jìn)的卷煙煙氣體外染毒方法，該方法通過(guò)將煙氣粒相部分提取液和氣相部分提取液混合后，進(jìn)行細(xì)胞染毒。該方法中，細(xì)胞沒(méi)有處于真實(shí)的煙氣環(huán)境下直接、實(shí)時(shí)地感受新鮮的卷煙主流煙氣，測(cè)試結(jié)果不能直接反映卷煙煙氣實(shí)際暴露下的毒性效應(yīng)。專(zhuān)利(公開(kāi)號(hào)CN101393190)是一種卷煙主流煙氣細(xì)胞毒性測(cè)定方法，該方法是將煙氣導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行染毒，細(xì)胞與溶于培養(yǎng)液中的煙氣成分間接接觸，而對(duì)于不溶于培養(yǎng)液的煙氣成分無(wú)法與細(xì)胞接觸，使得測(cè)試結(jié)果不能全面地反映卷煙煙氣的細(xì)胞毒性。以上兩種方法的不足之處在于，無(wú)法使培養(yǎng)的細(xì)胞與卷煙煙氣進(jìn)行直接且全面、充分地接觸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的不足之處，并基于中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)的原理，而建立的一種卷煙全煙氣染毒的細(xì)胞毒性測(cè)試方法。本方法在進(jìn)行卷煙全煙氣暴露時(shí)，使用插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，從而使培養(yǎng)的細(xì)胞處于煙氣和培養(yǎng)液的氣-液交界面，以到達(dá)細(xì)胞與卷煙煙氣直接、充分接觸的目的，可以全面地反映細(xì)胞對(duì)卷煙煙氣的感受，該方法靈敏度高，結(jié)果可以較為真實(shí)地反映卷煙煙氣的細(xì)胞毒性。
本發(fā)明的目的可通過(guò)下述技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明的方法包括以下步驟
a、配制實(shí)驗(yàn)試劑
⑴生長(zhǎng)培養(yǎng)液RPMI-1640 + 10%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+ 100 μ g/ml鏈霉素；[0009](2)0.01 M 磷酸緩沖鹽溶液(PBS) :0. 2 g KCl, O. 2 g KH2PO4,8 g NaCl, 2. 9 gNa2HPO4 · 12H20，加雙蒸水至I L，pH 7. 2 7. 4，高壓滅菌；
⑶暴露培養(yǎng)液RPMI-1640 + 5%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+ 100 μ g/ml 鏈霉素；
⑷中性紅儲(chǔ)存液0. 2 g中性紅，加雙蒸水至100 ml，過(guò)濾除菌；
(5)中性紅工作液用RPMI-1640稀釋至50 μ g/ml ；
(6)中性紅提取液50%乙醇，1%冰醋酸，49%雙蒸水，現(xiàn)用現(xiàn)配；
b、細(xì)胞接種培養(yǎng)
擴(kuò)增培養(yǎng)的處于指數(shù)生長(zhǎng)期的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，接種于12 mm插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中——Transwell小室，細(xì)胞密度為3. 5X IO4個(gè)/ Transwell小室，于37°C >5% CO2條件下培養(yǎng)24 h ；
C、卷煙全煙氣染毒
細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將Transwell小室轉(zhuǎn)移至煙氣暴露裝置中，吸煙機(jī)抽吸卷煙產(chǎn)生的主流煙氣，與不同流速的潔凈空氣混合后排入到煙氣暴露裝置中，Transwell小室微孔膜上層為煙氣環(huán)境，下層為暴露培養(yǎng)液，生長(zhǎng)在微孔膜上的細(xì)胞處于氣-液交界面處，于不同稀釋比例的卷煙主流煙氣中暴露培養(yǎng)；設(shè)置4個(gè)不同稀釋比例的卷煙煙氣劑量，每個(gè)卷煙煙氣劑量組抽吸4支卷煙，對(duì)照組細(xì)胞暴露于潔凈空氣中；
煙氣劑量以卷煙煙氣稀釋因子表示，即DF = (TS+Air) /TS
注DF(DilutionFactor),稀釋因子；TS(Tobacco Smoke),卷煙煙氣(流速);Air,潔凈空氣(流速)
d、中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)，
中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)
全煙氣暴露結(jié)束后，將Transwell小室轉(zhuǎn)入12孔板中，細(xì)胞于37°C、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入2 ml預(yù)熱的PBS洗一次，加入2 ml中性紅染液，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h，吸去中性紅染液，每孔加入2 ml PBS洗一次，加入I ml中性紅提取液，室溫下快速振蕩2(T30 min,將中性紅提取液轉(zhuǎn)入96孔板中(150 μ I/孔)，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)96孔板上中性紅提取液在540 nm波長(zhǎng)處的吸光值(A(raw))。計(jì)算相對(duì)吸光值，
相對(duì)吸光值代表細(xì)胞存活率；
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e、結(jié)果與分析
分析單支卷煙的總粒相物(TPM)的釋放量，可以將以稀釋因子表示的煙氣劑量轉(zhuǎn)換為細(xì)胞所感受的TPM總量；繪制卷煙全煙氣暴露下細(xì)胞毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線。
本發(fā)明的有益效果如下[0027]本發(fā)明為了使卷煙主流煙氣中的粒相部分與氣相部分與培養(yǎng)的細(xì)胞直接且充分接觸，使用了插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，當(dāng)進(jìn)行卷煙全煙氣暴露時(shí)，貼壁生長(zhǎng)在微孔膜上的細(xì)胞處于卷煙煙氣與暴露培養(yǎng)液的氣-液交界面處，從而解決了以往實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞不能全面感受卷煙全煙氣的不足之處；同時(shí)，本發(fā)明減少了甲醛固定液的固定步驟，使得實(shí)驗(yàn)過(guò)程更加簡(jiǎn)便。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、靈敏性更高、結(jié)果更全面可靠的優(yōu)點(diǎn)。


圖I為實(shí)施例I的卷煙的全煙氣細(xì)胞毒性曲線圖。
圖2為實(shí)施例2的卷煙的全煙氣細(xì)胞毒性曲線圖。
圖3為實(shí)施例3的卷煙的全煙氣細(xì)胞毒性曲線圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明以下將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步描述
本發(fā)明的方法包括以下步驟
a、配制實(shí)驗(yàn)試劑
⑴生長(zhǎng)培養(yǎng)液RPMI-1640 + 10%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+ 100 μ g/ml鏈霉素；
(2)0.01 M 磷酸緩沖鹽溶液(PBS) :0. 2 g KCl, O. 2 g KH2PO4,8 g NaCl, 2. 9 gNa2HPO4 · 12H20，加雙蒸水至I L，pH 7. 2 7. 4，高壓滅菌；
⑶暴露培養(yǎng)液RPMI-1640 + 5%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+ 100 μ g/ml 鏈霉素；
⑷中性紅儲(chǔ)存液0. 2 g中性紅，加雙蒸水至100 ml，過(guò)濾除菌；
(5)中性紅工作液用RPMI-1640稀釋至50 μ g/ml ；
(6)中性紅提取液50%乙醇，1%冰醋酸，49%雙蒸水，現(xiàn)用現(xiàn)配；
b、細(xì)胞接種培養(yǎng)
擴(kuò)增培養(yǎng)的處于指數(shù)生長(zhǎng)期的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，接種于12 mm插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中——Transwell小室，細(xì)胞密度為3. 5X IO4個(gè)/Transwell小室，于37°C >5% CO2條件下培養(yǎng)24 h ；
C、卷煙全煙氣染毒
細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將Transwell小室轉(zhuǎn)移至煙氣暴露裝置中，吸煙機(jī)抽吸卷煙產(chǎn)生的主流煙氣，與不同流速的潔凈空氣混合后排入到煙氣暴露裝置中，Transwell小室微孔膜上層為煙氣環(huán)境，下層為暴露培養(yǎng)液，生長(zhǎng)在微孔膜上的細(xì)胞處于氣-液交界面處，于不同稀釋比例的卷煙主流煙氣中暴露培養(yǎng)；設(shè)置4個(gè)不同稀釋比例的卷煙煙氣劑量，每個(gè)卷煙煙氣劑量組抽吸4支卷煙，對(duì)照組細(xì)胞暴露于潔凈空氣中；
煙氣劑量以卷煙煙氣稀釋因子表示，即DF = (TS+Air) /TS
注DF(DilutionFactor),稀釋因子；TS(Tobacco Smoke),卷煙煙氣(流速);Air,潔凈空氣(流速)
d、中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)，
中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)[0048]全煙氣暴露結(jié)束后，將Transwell小室轉(zhuǎn)入12孔板中，細(xì)胞于37°C、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入2 ml預(yù)熱的PBS洗一次，加入2 ml中性紅染液，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h，吸去中性紅染液，每孔加入2 ml PBS洗一次，加入I ml中性紅提取液，室溫下快速振蕩2(T30 min,將中性紅提取液轉(zhuǎn)入96孔板中(150 μ I/孔)，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)96孔板上中性紅提取液在540 nm波長(zhǎng)處的吸光值(A(raw))。計(jì)算相對(duì)吸光值，
相對(duì)吸光值代表細(xì)胞存活率；

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e、結(jié)果與分析
分析單支卷煙的總粒相物(TPM)的釋放量，可以將以稀釋因子表示的煙氣劑量轉(zhuǎn)換為細(xì)胞所感受的TPM總量；繪制卷煙全煙氣暴露下細(xì)胞毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線。
具體實(shí)施例如下
實(shí)施例I某一國(guó)產(chǎn)卷煙的全煙氣染毒細(xì)胞毒性試驗(yàn)。
首先按照上述步驟a配制實(shí)驗(yàn)試劑，之后按照上述步驟b進(jìn)行細(xì)胞接種培養(yǎng)，將培養(yǎng)的CHO細(xì)胞接種于12mm插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中(Transwell小室)，細(xì)胞密度為3. 5 X IO4個(gè)/ Transwell小室，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h ;再按照上述步驟c進(jìn)行卷煙全煙氣染毒，即將Transwell小室轉(zhuǎn)入煙氣暴露裝置中，卷煙樣品在深度抽吸條件下抽吸，產(chǎn)生的卷煙主流煙氣經(jīng)潔凈空氣稀釋后導(dǎo)入煙氣暴露裝置，設(shè)置4個(gè)不同稀釋比例的卷煙煙氣劑量(卷煙煙氣每口抽吸容量55 ml，每口排出時(shí)間2.8 s ;潔凈空氣流速分別設(shè)置為6 L/min、3.5 L/min、I. 25 L/min,O L/min)，每個(gè)卷煙煙氣劑量組抽吸4支卷煙，對(duì)照組細(xì)胞暴露于潔凈空氣中；暴露結(jié)束后，按照上述步驟d將Transwell小室轉(zhuǎn)入12孔板中，細(xì)胞于37°C、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入2 ml預(yù)熱的PBS洗一次，加入2 ml中性紅染液，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h，吸去中性紅染液，每孔加入2 ml PBS洗一次，加入I ml中性紅提取液，室溫下快速振蕩2(T30 min,將中性紅提取液轉(zhuǎn)入96孔板中(150μ I/孔)，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)96孔板上中性紅提取液在540 nm波長(zhǎng)處的吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。單支卷煙的TPM釋放量為48. 19 mg/支。
卷煙全煙氣的細(xì)胞毒性
權(quán)利要求
1.一種卷煙全煙氣染毒的細(xì)胞毒性測(cè)試方法，其特征在于所述方法包括以下步驟 a、配制實(shí)驗(yàn)試劑 ⑴生長(zhǎng)培養(yǎng)液RPMI-1640 + 10%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+.100 u g/ml鏈霉素； (2)0.01 M 磷酸緩沖鹽溶液(PBS) :0. 2 g KCl, 0. 2 g KH2PO4,8 g NaCl, 2. 9 gNa2HPO4 12H20，加雙蒸水至I L，pH 7. 2 7. 4，高壓滅菌； ⑶暴露培養(yǎng)液RPMI-1640 + 5%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+.100 u g/ml鏈霉素； ⑷中性紅儲(chǔ)存液0. 2 g中性紅，加雙蒸水至100 ml，過(guò)濾除菌； (5)中性紅工作液用RPMI-1640稀釋至50u g/ml ； (6)中性紅提取液50%こ醇，1%冰醋酸，49%雙蒸水，現(xiàn)用現(xiàn)配； b、細(xì)胞接種培養(yǎng) 擴(kuò)增培養(yǎng)的處于指數(shù)生長(zhǎng)期的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，接種于12 mm插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中——Transwell小室，細(xì)胞密度為3. 5 X IO4個(gè)/Transwell小室，于37°C >5% CO2條件下培養(yǎng)24 h ； C、卷煙全煙氣染毒 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將Transwell小室轉(zhuǎn)移至煙氣暴露裝置中，吸煙機(jī)抽吸卷煙產(chǎn)生的主流煙氣，與不同流速的潔凈空氣混合后排入到煙氣暴露裝置中，Transwell小室微孔膜上層為煙氣環(huán)境，下層為暴露培養(yǎng)液，生長(zhǎng)在微孔膜上的細(xì)胞處于氣-液交界面處，于不同稀釋比例的卷煙主流煙氣中暴露培養(yǎng)；設(shè)置4個(gè)不同稀釋比例的卷煙煙氣劑量，每個(gè)卷煙煙氣劑量組抽吸4支卷煙，對(duì)照組細(xì)胞暴露于潔凈空氣中； d、中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)， 中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn) 全煙氣暴露結(jié)束后，將TranswelI小室轉(zhuǎn)入12孔板中，細(xì)胞于37°C、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入2 ml預(yù)熱的PBS洗一次，加入2 ml中性紅染液，于37°C、.5% CO2條件下培養(yǎng)3 h，吸去中性紅染液，每孔加入2 ml PBS洗一次，加入I ml中性紅提取液，室溫下快速振蕩2(T30 min,將中性紅提取液轉(zhuǎn)入96孔板中，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)96孔板上中性紅提取液在540 nm波長(zhǎng)處的吸光值；計(jì)算相對(duì)吸光值，相對(duì)吸光值代表細(xì)胞存活率； e、結(jié)果與分析 分析單支卷煙的總粒相物(TPM)的釋放量，可以將以稀釋因子表示的煙氣劑量轉(zhuǎn)換為細(xì)胞所感受的TPM總量；繪制卷煙全煙氣暴露下細(xì)胞毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線。
專(zhuān)利摘要
一種卷煙全煙氣染毒的細(xì)胞毒性測(cè)試方法，所述方法在進(jìn)行卷煙全煙氣暴露時(shí)，使用插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，從而使培養(yǎng)的細(xì)胞處于煙氣和培養(yǎng)液的氣-液交界面，以到達(dá)細(xì)胞與卷煙煙氣直接、充分接觸的目的，可以全面地反映細(xì)胞對(duì)卷煙煙氣的感受，該方法靈敏度高，結(jié)果可以較為真實(shí)地反映卷煙煙氣的細(xì)胞毒性。本發(fā)明為了使卷煙主流煙氣中的粒相部分與氣相部分與培養(yǎng)的細(xì)胞直接且充分接觸，使用了插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，當(dāng)進(jìn)行卷煙全煙氣暴露時(shí)，貼壁生長(zhǎng)在微孔膜上的細(xì)胞處于卷煙煙氣與暴露培養(yǎng)液的氣-液交界面處，從而解決了以往實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞不能全面感受卷煙全煙氣的不足之處；同時(shí)，本發(fā)明減少了甲醛固定液的固定步驟，使得實(shí)驗(yàn)過(guò)程更加簡(jiǎn)便。
文檔編號(hào)C12Q1/02GKCN102140489 B發(fā)布類(lèi)型授權(quán) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N 201110025480
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2011年1月24日
發(fā)明者李翔, 尚平平, 聶聰, 楊松, 王宜鵬, 劉惠民, 謝劍平 申請(qǐng)人:中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專(zhuān)利引用 (2), 非專(zhuān)利引用 (1),