專利名稱:用于產(chǎn)生莽那亭的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶等產(chǎn)生莽那亭(Monatin)的方法。
背景技術(shù)：
莽那亭[4_(卩引哚 _3_ 基-甲基)-4-輕基-谷氨酸](4_ (indole-3-yl-methyl) _4-hydroxy-glutamic acid)是一種包含于南非的灌木 Schlerochitom ilicifolius 的根中的氨基酸，并特別期待其作為低熱量增甜劑，因?yàn)槠渚哂袨檎崽且磺?shù)百倍的甜度(參見專利文獻(xiàn)I)。莽那亭在位置2和4具有不對(duì)稱碳原子，且莽那亭的天然存在的立體異構(gòu)體為2S，4S異構(gòu)體。已通過有機(jī)化學(xué)方法合成了非天然存在的三種立體異構(gòu)體。所有這些立體異構(gòu)體具有優(yōu)異的甜度，并期待用作增甜劑。
已報(bào)道幾種方法作為產(chǎn)生莽那亭的方法(例如，參見專利文獻(xiàn)2)。然而，所有報(bào)道的方法需要多階段的步驟，并因此需要改善莽那亭的合成收率。
具體而言，對(duì)于用于產(chǎn)生莽那亭的方法，已知下述用于產(chǎn)生2R，4R_莽那亭的方法，即從L-色氨酸(L-Trp)合成吲哚-3-丙酮酸(根據(jù)需要，在后文中稱作“IPA”)，從所得的IPA和丙酮酸合成4R形式的4-(吲哚-3-基-甲基)-4-羥基-2-酮戊二酸(根據(jù)需要，在后文中稱作“4R-IH0G”)，并隨后對(duì)獲得的4R-IH0G進(jìn)行肟化反應(yīng)，還原反應(yīng)和差向異構(gòu)-結(jié)晶方法(常規(guī)方法(I))(參見專利文獻(xiàn)2)。
然而，醛縮酶步驟(第二步驟)是平衡反應(yīng)，因此，并不總是在該反應(yīng)中獲得令人滿意的收率。
用于產(chǎn)生2R，4R_莽那亭的常規(guī)方法(I)
t肟化
脫氨酶醛縮酶+
(脫氨)(縮合)還原
a a a a
T NHT NHT NHT NH
i i yco2h 5e<r 5 :
H2N CO2H^CO2HOHO CO2H uHO CO2H
L-TrpIPA4R-IHOG2民4R-莽那亭
為了改善2R，4R_莽那亭的收率，已經(jīng)發(fā)明了通過一鍋法酶反應(yīng)產(chǎn)生2R，4R_莽那亭的方法(常規(guī)方法(2))(參見專利文獻(xiàn)3至6)。
專利文獻(xiàn)I JP Sho-64-25757-A
專利文獻(xiàn)2 :國際公開W02003/059865
專利文獻(xiàn)3 :國際公開W02007/133184
專利文獻(xiàn)4 國際公開TO2005/042756
專利文獻(xiàn)5 :美國專利公開號(hào)2006/0252135說明書[0014]專利文獻(xiàn)6 :美國專利公開號(hào)2008/020434說明書
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明待解決的問題
本發(fā)明的目標(biāo)是提供以良好收率產(chǎn)生莽那亭的方法。
解決問題的手段
作為廣泛研究的結(jié)果，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)上述問題可通過使用L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶來解決，并完成了本發(fā)明。目前尚未知任何作用于4R-IH0G的L-氨基酸-氨基轉(zhuǎn)移酶。
相應(yīng)地，本發(fā)明如下所述
[I] 一種用于產(chǎn)生2S，4R_莽那亭或其鹽的方法，包括在L-氨基酸的存在下將 4R-IH0G與L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶相接觸而形成2S，4R-莽那亭。
[2] [I]的產(chǎn)生方法，進(jìn)一步包括將酮酸與脫羧酶相接觸而降解所述酮酸，其中所述酮酸是由于L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的作用從L-氨基酸形成的。
[3] [I]的產(chǎn)生方法，其中所述L-氨基酸是L-天冬氨酸。
[4] [3]的產(chǎn)生方法，進(jìn)一步包括將草酰乙酸與草酰乙酸脫羧酶相接觸而不可逆地形成丙酮酸，其中所述草酰乙酸是通過L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的作用從L-天冬氨酸形成的。
[5] [I]的產(chǎn)生方法，其中所述L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶來源于屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假絲酵母屬(Candida)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、洛德酵母屬(Lodderomyces)、微球菌屬(Micrococcus)、微桿菌屬(Microbacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、迪茨氏菌屬(Dietzia)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、Carnimonas 屬、西洋蓍霉屬(Yarrowia)、梭菌屬(Clostridium)、異常球菌屬(Deinococcus)、真桿菌屬(Eubacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、甲焼嗜熱桿菌屬(Methanothermobacter)、席藍(lán)細(xì)菌(Phormidium)、火球菌屬(Pyrococcus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、酵母屬(Saccharomyces)、嗷糖菌屬(Saccharophagus)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)、棲熱袍菌屬(Thermotoga)或棲熱菌屬(Thermus)的微生物。
[6] [5]的產(chǎn)生方法，其中所述L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶來源于屬于節(jié)桿菌屬菌種(Arthrobacter sp.)、高地芽抱桿菌(Bacillus altitudinis)、解纖維芽抱桿菌(Bacillus ce I lulosi Iyt icus)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、芽抱桿菌屬菌種(Bacillus sp.)、挪威假絲酵母(Candida norvegensis)、平常假絲酵母(Candida inconspicua)、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、長抱洛德酵母(Lodderomyces elongisporus)、藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)、微桿菌屬菌種(Microbacterium sp.)、小球諾卡氏菌(Nocardia globerula)、綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、香茅醇假單胞菌(Pseudomonas citronocllolis)、莓實(shí)假單胞菌(Pseudomonas fragi)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、產(chǎn)黃假單胞菌(Pseudomonas synxantha)、腐臭假單胞菌(Pseudomonas taetrolens)、假單胞菌屬菌種(Pseudomonas sp.)、放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)、根瘤菌屬菌種(Rhizobium sp.)、寡養(yǎng)單胞菌屬菌種(Stenotrophomonassp.)、海洋迪茨氏菌(Dietzia mar is)、Ochrobactrum pseudogrignonense、缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)、伯克霍爾德氏菌屬菌種(Burkholderia sp.)、Carnimonas sp.、解脂西洋蓍霉(Yarrowia lypolytica)、解纖維梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、Deinococcus geothermal is、直腸真桿菌(Eubacterium rectale)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、熱自養(yǎng)甲燒嗜熱桿菌(Methanothermobacterthermautotrophicus)、Phormidium lapideum、掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、降解卩遼糖菌(Saccharophagus degradans)、 苜猜中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、騰沖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)或嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的微生物。
[7] [I]的產(chǎn)生方法，其中所述L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶由與以EQ ID NO :2、SEQ IDNO :48、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :69、SEQID NO :73、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO 89, SEQ ID NO 9USEQ ID NO 93, SEQ ID NO 95, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO:99、SEQ ID NO 10U SEQ ID NO 103,SEQ ID NO 105,SEQ ID NO107,SEQ ID NO :109 或SEQ ID NO :111表示的氨基酸序列顯示90%或更高同一性的氨基酸序列組成。
[8] [7]的產(chǎn)生方法，其中所述L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶在以SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的突變，所述氨基酸殘基選自下組位置39、位置109、位置128、位置150、位置258、位置287、位置288、位置289、位置303、位置358和位置431處的氨基酸殘基。
[9] [8]的產(chǎn)生方法，其中所述一種或多種氨基酸殘基的突變選自下組
i)用精氨酸取代位置39處的賴氨酸；
ii)用甘氨酸取代位置258處的絲氨酸；
iii)用谷氨酸取代位置287處的谷氨酰胺；
iv)用甘氨酸取代位置288處的蘇氨酸；
V)用丙氨酸取代位置289處的異亮氨酸；
vi)用甘氨酸取代位置109處的天冬氨酸；
vii)用酪氨酸取代位置150處的組氨酸；
viii)用亮氨酸取代位置303處的苯丙氨酸；
ix)用酪氨酸取代位置358處的天冬氨酸；
X)用蘇氨酸取代位置431處的絲氨酸；和
xi)用甘氨酸取代位置128處的谷氨酸。
[10] [I]的產(chǎn)生方法，其中使用表達(dá)L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)化體將4R-IH0G與L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶相接觸。
[11] [I]的產(chǎn)生方法，進(jìn)一步包括將吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸縮合而形成4R-IH0G。
[12] [11]的產(chǎn)生方法，通過將吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸與醛縮酶相接觸而將吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸縮合。[0043][13] [11]的產(chǎn)生方法，其中至少部分用于形成4R-IH0G的丙酮酸是來自由于草酰乙酸脫羧酶的作用從草酰乙酸形成的丙酮酸。
[14] [11]的產(chǎn)生方法，進(jìn)一步包括使色氨酸脫氨基而形成吲哚-3-丙酮酸。
[15] [14]的產(chǎn)生方法，其中所述色氨酸通過將色氨酸與脫氨酶相接觸來脫氨基。
[16] [11]或[14]的產(chǎn)生方法，其中所述2S，4R_莽那亭或其鹽的產(chǎn)生是在一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行的。
[17] 一種用于產(chǎn)生2R，4R_莽那亭或其鹽的方法，包括下述⑴和(II)
(I)進(jìn)行[I]的方法而形成2S，4R_莽那亭；和
(II)異構(gòu)化2S，4R_莽那亭而形成2R，4R_莽那亭。[18] [17]的產(chǎn)生方法，其中2S，4R-莽那亭在芳族醛的存在下異構(gòu)化。
[19] [17]的產(chǎn)生方法，其中所述鹽是鈉鹽或鉀鹽。
[20] 一種L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶，其為選自下組(A)-(D)的蛋白
(A)蛋白，其由以 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :53 或 SEQID NO :61 表示的氨基酸序列組成。
(B)蛋白，其包含以 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO 48, SEQ ID NO :53 或 SEQID NO 61
表示的氨基酸序列。
(C)蛋白，其由與以 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO 48, SEQ ID NO :53 或 SEQID NO 61
表示的氨基酸序列顯示90%或更高同一性，并具有L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的氨基酸序列組成；和
(D)蛋白，其由在以 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO 48, SEQ ID NO :53 或 SEQID NO 61
表示的氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的突變，并具有L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的氨基酸序列組成，所述突變選自下組氨基酸殘基的缺失、取代、添加和插入。
[21] [20]的L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶，其中L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶在以SEQ IDNO :2表示的氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的突變，其中氨基酸殘基選自下組位置39，位置109，位置128，位置150，位置258，位置287，位置288和位置289，位置303，位置358和位置431處的氨基酸殘基。
[22] [21]的L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的突變選自下組
i)用精氨酸取代位置39處的賴氨酸；
ii)用甘氨酸取代位置258處的絲氨酸；
iii)用谷氨酸取代位置287處的谷氨酰胺；
iv)用甘氨酸取代位置288處的蘇氨酸；
V)用丙氨酸取代位置289處的異亮氨酸；
vi)用甘氨酸取代位置109處的天冬氨酸；
vii)用酪氨酸取代位置150處的組氨酸；
viii)用亮氨酸取代位置303處的苯丙氨酸；
ix)用酪氨酸取代位置358處的天冬氨酸；
X)用蘇氨酸取代位置431處的絲氨酸；和
xi)用甘氨酸取代位置128處的谷氨酸。[0070][23] 一種多核苷酸，選自下組(a)-(e)
(a)多核苷酸，其由以 SEQ ID NO USEQ ID NO : 47、SEQ ID N0:52 或 SEQ ID NO:60表示的核苷酸序列組成；
(b)多核苷酸，其包含以 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO 52 或 SEQ IDNO 60表不的核苷酸序列；
(c)多核苷酸，其由與以 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO 52 或 SEQ ID
NO 60表不的氣基酸序列顯不90%或更聞同一性,并編碼具有L-氣基酸氣基轉(zhuǎn)移酶的蛋白的核苷酸序列組成；(d)多核苷酸，其在嚴(yán)格條件下與由互補(bǔ)于以SEQ ID NO USEQ ID NO :47、SEQ IDN0:52或SEQ ID NO :60表示的核苷酸序列的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，并編碼具有L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；和
(e)多核苷酸，其編碼[20]的L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶。
[24] 一種表達(dá)載體,其包含[23]的多核苷酸。
[25] 一種轉(zhuǎn)化體，其導(dǎo)入[24]的表達(dá)載體。
[26] 一種用于產(chǎn)生L-氨基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)[25]的轉(zhuǎn)化體而獲得L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶。
[27] 一種產(chǎn)生2S，4R_莽那亭或其鹽的方法，包括在L-氨基酸的存在下將4R-IH0G與[20]的L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶相接觸而形成2S，4R-莽那亭。
[28] 一種用于產(chǎn)生2R，4R_莽那亭或其鹽的方法，包括下述(I’ )和(II’ )
(I’ )進(jìn)行[27]的方法而形成2S，4R_莽那亭；和
(II’)異構(gòu)化2S，4R_莽那亭而形成2R，4R_莽那亭。
[29] [28]的產(chǎn)生方法，其中2S，4R-莽那亭在芳族醛的存在下異構(gòu)化。
[30] [28]的產(chǎn)生方法，其中所述鹽是鈉鹽或鉀鹽。
發(fā)明的效果
本發(fā)明的方法可通過使用L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶從4R-IH0G以良好收率產(chǎn)生2S，4R-莽那亭而有助于莽那亭收率的改善。本發(fā)明的方法具有下述優(yōu)點(diǎn):當(dāng)從IHOG形成2S，4R-莽那亭時(shí)無需使用昂貴的D-氨基酸(D-Asp等)作為底物，或無需添加酶如消旋酶以從L-氨基酸形成D-氨基酸。在本發(fā)明的方法中，當(dāng)不僅進(jìn)行從4R-IH0G形成2S，4R-莽那亭的反應(yīng)(第三步)，還進(jìn)行從L-Trp形成IPA的反應(yīng)(第一步)，和進(jìn)行從IPA形成4R-IH0G的反應(yīng)(第二步)時(shí)，可在第三步中限定全反應(yīng)的平衡，并將第二步中的反應(yīng)平衡極大地移向形成4R-IH0G的方向。在此情況下，本發(fā)明的方法使得可通過避免副產(chǎn)物L(fēng)-Trp (第一步的逆反應(yīng)的進(jìn)程)而以非常良好的收率(yield)產(chǎn)生2S，4R-莽那亭。


圖I是顯示本發(fā)明的產(chǎn)生方法的一個(gè)實(shí)例的圖。Trp :色氨酸；IPA:D引哚-3-丙酮酸；IHOG :4-(吲哚-3-基-甲基)-4-羥基-2-酮戊二酸；莽那亭4-(吲哚-3-基-甲基)-4-輕基-谷氨酸。
圖2是顯示本發(fā)明的產(chǎn)生方法的一個(gè)實(shí)例的圖。縮寫與圖I中的相同；和
圖3是顯示本發(fā)明的產(chǎn)生方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例的圖。L-Trp :L_色氨酸；L_Asp L-天冬氨酸；OAA :草酰乙酸；PA :丙酮酸；而其他縮寫與圖I中的相同。
圖4是顯示使用L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶突變體(ID166)以400ml規(guī)模從L-Trp形成2S，4R-莽那亭的反應(yīng)的圖。SR-莽那亭2S，4R-莽那亭；SS_莽那亭2S，4S_莽那亭；IH0G 4R-IH0G ；Trp :L-Trp。
圖5是顯示使用L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶突變體(ID189)以80ml規(guī)模從L-Trp形成2S，4R-莽那亭的反應(yīng)的圖?？s寫與圖4中的那些類似。
圖6是顯示使用L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶突變體(ID296)以80ml規(guī)模從L-Trp形成2S，4R-莽那亭的反應(yīng)的圖?？s寫與圖4中的那些類似。
實(shí)施發(fā)明的最佳模式(I)用于產(chǎn)生2S，4R_莽那亭或其鹽的方法
本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生2S，4R_莽那亭或其鹽的方法(I)。本發(fā)明的產(chǎn)生方法可分類為(1-1) 一種用于從4R-IH0G產(chǎn)生2S,4R-莽那亭的方法，(1-2) —種用于從IPA和丙酮酸產(chǎn)生2S，4R-莽那亭的方法，和(1-3) —種用于從色氨酸產(chǎn)生2S，4R-莽那亭的方法。方法(1-1)、(1-2)和(1-3)在將4R-IH0G與L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶在L-氨基酸的存在下相接觸而形成2S，4R-莽那亭方面是共同的。
(1-1)用于從4R-IH0G產(chǎn)生2S，4R_莽那亭的方法
該方法包括在L-氨基酸的存在下將4R-IH0G與L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶相接觸而形成2S，4R-莽那亭(反應(yīng)I)。通過在L-氨基酸的存在下將4R-IH0G與L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶相接觸，可將L-氨基酸中的氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)移至4R-IH0G而形成2S，4R-莽那亭。
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生2S，4R-莽那亭(2S，4R-M0natin)或其鹽的方法，包括在L-氨基酸的存在下將4R-IH0G與L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶相接觸而形成2S，4R-莽那亭。
2.權(quán)利要求
I的產(chǎn)生方法，進(jìn)一步包括將酮酸與脫羧酶相接觸而降解所述酮酸，其中所述酮酸是由于L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的作用從L-氨基酸形成的。
3.權(quán)利要求
I的產(chǎn)生方法，其中所述L-氨基酸是L-天冬氨酸。
4.權(quán)利要求
3的產(chǎn)生方法，進(jìn)一步包括將草酰乙酸與草酰乙酸脫羧酶相接觸而不可逆地形成丙酮酸，其中所述草酰乙酸是通過L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的作用從L-天冬氨酸形成的。
5.權(quán)利要求
I的產(chǎn)生方法，其中所述L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶來源于屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假絲酵母屬(Candida)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、洛德酵母屬(Lodderomyces)、微球菌屬(Micrococcus)、微桿菌屬(Microbacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、根 瘤菌屬(Rhizobium)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、迪茨氏菌屬(Dietzia)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、Carnimonas 屬、西洋蓍霉屬(Yarrowia)、梭菌屬(Clostridium)、異常球菌屬(Deinococcus)、真桿菌屬(Eubacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、甲焼嗜熱桿菌屬(Methanothermobacter)、席藍(lán)細(xì)菌屬(Phormidium)、火球菌屬(pyrococcus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、酵母屬(Saccharomyces)、嗷糖菌屬(Saccharophagus)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)、棲熱袍菌屬(Thermotoga)或棲熱菌屬(Thermus)的微生物。
6.權(quán)利要求
5的產(chǎn)生方法，其中所述L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶來源于屬于節(jié)桿菌屬菌種(Arthrobacter sp.)、高地芽抱桿菌(Bacillus altitudinis)、解纖維芽抱桿菌(Bacillus ceIlulosiIyticus)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、芽抱桿菌屬菌種(Bacillus sp.)、挪威假絲酵母(Candida norvegensis)、平常假絲酵母(Candida inconspicua)、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、長抱洛德酵母(Lodderomyces elongisporus)、藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)、微桿菌屬菌種(Microbacterium sp.)、小球諾卡氏菌(Nocardia globerula)、綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、香茅醇假單胞菌(Pseudomonas citronocllolis)、莓實(shí)假單胞菌(Pseudomonas fragi)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、產(chǎn)黃假單胞菌(Pseudomonas synxantha)、腐臭假單胞菌(Pseudomonas taetrolens)、假單胞菌屬菌種(Pseudomonas sp.)、放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)、根瘤菌屬菌種(Rhizobium sp.)、寡養(yǎng)單胞菌屬菌種(Stenotrophomonassp.)、海洋迪茨氏菌(Dietzia mar is)、Ochrobactrum pseudogrignonense、缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)、伯克霍爾德氏菌屬菌種(Burkholderia sp.)、Carnimonas sp.、解脂西洋蓍霉(Yarrowia Iypolytica)、解纖維梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、Deinococcus geothermalis、直腸真桿菌(Eubacterium rectale)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、熱自養(yǎng)甲焼嗜熱桿菌(Methanothermobacterthermautotrophicus)、Phormidium lapideum、掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、降解曬糖菌(Saccharophagus degradans)、苜猜中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、騰沖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)或嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的微生物。
7.權(quán)利要求
I的產(chǎn)生方法，其中所述L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶由與以EQID N0:2、SEQ IDNO 48, SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :69、SEQID NO :73、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO 89, SEQ ID NO 9USEQ ID NO 93, SEQ ID NO 95, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO:99、SEQ ID NO 10U SEQ ID NO 103,SEQ ID NO 105,SEQ ID NO107,SEQ ID NO :109 或SEQ ID NO :111表示的氨基酸序列顯示90%或更高同一性的氨基酸序列組成。
8.權(quán)利要求
7的產(chǎn)生方法，其中所述L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶在以SEQID NO 2表示的氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的突變，所述氨基酸殘基選自下組位置39、位置109、位置128、位置150、位置258、位置287、位置288、位置289、位置303、位置358和位置431處的氨基酸殘基。
9.權(quán)利要求
8的產(chǎn)生方法，其中所述一種或多種氨基酸殘基的突變選自下組 i)用精氨酸取代位置39處的賴氨酸； ii)用甘氨酸取代位置258處的絲氨酸； iii)用谷氨酸取代位置287處的谷氨酰胺； iv)用甘氨酸取代位置288處的蘇氨酸； V)用丙氨酸取代位置289處的異亮氨酸； vi)用甘氨酸取代位置109處的天冬氨酸； vii)用酪氨酸取代位置150處的組氨酸； viii)用亮氨酸取代位置303處的苯丙氨酸； ix)用酪氨酸取代位置358處的天冬氨酸； X)用蘇氨酸取代位置431處的絲氨酸；和 xi)用甘氨酸取代位置128處的谷氨酸。
10.權(quán)利要求
I的產(chǎn)生方法，其中使用表達(dá)L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)化體將4R-IH0G與L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶相接觸。
11.權(quán)利要求
I的產(chǎn)生方法，進(jìn)一步包括使吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸縮合而形成4R-IH0G。
12.權(quán)利要求
11的產(chǎn)生方法，通過使吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸與醛縮酶相接觸而將吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸縮合。
13.權(quán)利要求
11的產(chǎn)生方法，其中至少部分用于形成4R-IH0G的丙酮酸是來自由于草酰乙酸脫羧酶的作用而從草酰乙酸形成的丙酮酸。
14.權(quán)利要求
11的產(chǎn)生方法，進(jìn)一步包括使色氨酸脫氨基而形成吲哚-3-丙酮酸。
15.權(quán)利要求
14的產(chǎn)生方法，其中所述色氨酸通過將色氨酸與脫氨酶相接觸來脫氨基。
16.權(quán)利要求
11或14的產(chǎn)生方法，其中2S，4R-莽那亭或其鹽的產(chǎn)生是在一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行的。
17.一種用于產(chǎn)生2R，4R-莽那亭或其鹽的方法，包括下述(I)和(II)(I)進(jìn)行權(quán)利要求
I的方法而形成2S，4R-莽那亭；和 (II)異構(gòu)化2S，4R-莽那亭而形成2R，4R-莽那亭。
18.權(quán)利要求
17的產(chǎn)生方法，其中2S，4R-莽那亭在芳族醛的存在下異構(gòu)化。
19.權(quán)利要求
17的產(chǎn)生方法，其中所述鹽是鈉鹽或鉀鹽。
20.一種L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶，其為選自(A)-(D)的蛋白
⑷蛋白，其由以 SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :53 或 SEQ ID NO :61 表示的氨基酸序列組成。
(B)蛋白，其包含以SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :53 或 SEQ ID NO 61 表示的氨基酸序列。
(C)蛋白，其由與以SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO 53 或 SEQ ID NO 61 表示的氨基酸序列顯示90%或更高同一性，并具有L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的氨基酸序列組成；和
(D)蛋白，其由在以SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO 53 或 SEQ ID NO 61 表示的氨基酸序列中包含一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的突變，并具有L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的氨基酸序列組成，所述突變選自下組氨基酸殘基的缺失、取代、添加和插入。
21.權(quán)利要求
20的L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶，其中L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶在以SEQID NO2表示的氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的突變，其中氨基酸殘基選自下組位置39，位置109，位置128，位置150，位置258，位置287，位置288，位置289，位置303，位置358和位置431處的氨基酸殘基。
22.權(quán)利要求
21的L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的突變選自下組 i)用精氨酸取代位置39處的賴氨酸； ii)用甘氨酸取代位置258處的絲氨酸； iii)用谷氨酸取代位置287處的谷氨酰胺； iv)用甘氨酸取代位置288處的蘇氨酸； V)用丙氨酸取代位置289處的異亮氨酸； vi)用甘氨酸取代位置109處的天冬氨酸； vii)用酪氨酸取代位置150處的組氨酸； viii)用亮氨酸取代位置303處的苯丙氨酸； ix)用酪氨酸取代位置358處的天冬氨酸； X)用蘇氨酸取代位置431處的絲氨酸；和 xi)用甘氨酸取代位置128處的谷氨酸。
23.一種多核苷酸，選自下組(a)-(e)
(a)多核苷酸，其由以SEQ ID NO U SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :52 或 SEQ ID NO 60表示的核苷酸序列組成；
(b)多核苷酸，其包含以SEQ ID NO USEQ ID NO :47、SEQ ID NO:52 或 SEQ ID NO 60表示的核苷酸序列；
(c)多核苷酸,其由與以SEQ ID NO USEQ ID NO :47、SEQ ID NO:52 或 SEQ ID NO 60表示的氨基酸序列顯示90%或更高同一性，并編碼具有L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的蛋白的核苷酸序列組成； (d)多核苷酸，其在嚴(yán)格條件下與由互補(bǔ)于以SEQID NO U SEQ ID NO :47、SEQ IDNO :52或SEQ ID NO :60表示的核苷酸序列的核苷酸序列組成的多核苷酸雜交，并編碼具有L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；和 (e)多核苷酸，其編碼權(quán)利要求
20的L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶。
24.—種表達(dá)載體,其包含權(quán)利要求
23的多核苷酸。
25.—種轉(zhuǎn)化體，其導(dǎo)入有權(quán)利要求
24的表達(dá)載體。
26.一種用于產(chǎn)生L-氨基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求
25的轉(zhuǎn)化體而獲得所述L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶。
27.一種產(chǎn)生2S，4R-莽那亭或其鹽的方法，包括在L-氨基酸的存在下將4R-IH0G與權(quán)利要求
20的L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶相接觸而形成2S，4R-莽那亭。
28.一種用于產(chǎn)生2R，4R-莽那亭或其鹽的方法，包括下述(I’ )和(II’ ) (I’ )執(zhí)行權(quán)利要求
27的方法而形成2S，4R-莽那亭；和 (II’)異構(gòu)化2S，4R-莽那亭而形成2R，4R-莽那亭。
29.權(quán)利要求
28的產(chǎn)生方法，其中2S，4R-莽那亭在芳族醛的存在下異構(gòu)化。
30.權(quán)利要求
28的產(chǎn)生方法，其中所述鹽是鈉鹽或鉀鹽。
專利摘要
本發(fā)明提供了用于改善2R，4R-莽那亭收率的方法。具體而言，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生2S，4R-莽那亭或其鹽的方法，包括在L-氨基酸存在下用L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶接觸4R-IHOG而形成2S，4R-莽那亭；用于產(chǎn)生2R，4R-莽那亭或其鹽的方法，包括異構(gòu)化2S，4R-莽那亭以產(chǎn)生2R，4R-莽那亭；等等。這些產(chǎn)生方法可進(jìn)一步包括將吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸縮合而形成4R-IHOG，和使色氨酸脫氨基而形成吲哚-3-丙酮酸。
文檔編號(hào)C12N9/10GKCN102741406SQ201180004246
公開日2012年10月17日 申請日期2011年10月12日
發(fā)明者杉山雅一, 森健一, 田上宇乃, 田渕英莉, 石川弘紀(jì), 荻野博臣, 藤井秀美, 高倉康彰 申請人:味之素株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan