專利名稱:一種分子標記在豬初生重性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于豬的分子標記制備與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種豬繁殖相關(guān)性狀特別是與豬初生重性狀分子標記的應(yīng)用。該分子標記與豬初生重性狀相關(guān)，從HPSE基因中克隆得到，本發(fā)明主要涉及該分子標記的新用途。
背景技術(shù)：
豬是重要的經(jīng)濟動物，作為我國廣大人民動物性蛋白的主要來源之一。近年來，人們對豬肉的消費量與日俱增，對于養(yǎng)豬生產(chǎn)者來說，如何提高生產(chǎn)性能、降低生產(chǎn)成本成了他們關(guān)注的焦點。在過去的幾十年里，育種工作者通過常規(guī)的育種技術(shù)，對豬的許多重要經(jīng)濟性狀進行了遺傳改良，并取得了較理想的成果(如瘦肉率，背膘厚等)。但是對于豬繁殖性狀的改良進度很緩慢，且效果不是很明顯，沒有取得預(yù)期的實質(zhì)性突破。
分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展為此提供了重要的契機，憑借這一技術(shù)手段，科學家們發(fā)掘出了一大批與豬的初生重，生長速度，斷奶重，產(chǎn)仔數(shù)等重要的繁殖性狀有著顯著關(guān)聯(lián)的分子標記。這為提高豬的生產(chǎn)性能提供了理論依據(jù)，并從實質(zhì)上使之得到了很大的提聞。
豬的初生重作為一個重要的繁殖性狀，對豬出生后的生長速度及成活率具有重要的作用。最近有很多文獻報道了初生重對豬出生后生長速度的影響，李劍豪(李劍豪.長白豬初生重對生長速度及哺育率的影響.仔豬生產(chǎn)[J].2006.18)研究發(fā)現(xiàn)長白豬60日齡重與35日齡重均與初生重呈正相關(guān)且初生重與生長速度呈正相關(guān)。Beaulieu等(BeaulieuAD 等，Impact of piglet birth weight, birth order and litter size on subsequentgrowth performance， carcass quality, muscle composition and eating quality ofpork[J].J Anim Sc1.2010)和 Poore 等(Poore K.R.等，The effects of birth weightand postnatal growth patterns on fat depth and plasma leptin concentrations injuvenile and adult pigs.J.Physiol.2004)研究發(fā)現(xiàn),初生重較低的豬生長速度較慢,從而使其進入市場的時間增加。另有研究表明仔豬的初生重與育成率亦悉悉相關(guān)，初生重在
1.0Kg以下時仔豬育成率隨著初生重的增加而上升；初生重在1.0Kg以上時仔豬育成率沒有明顯的規(guī)律。初生重小于等于0.5Kg時仔豬育成率僅為55.56% (高建國.二花臉豬初生重對出生后生長速度及育成率的影響[J].畜牧與獸醫(yī)，1992，24(1):26),Gondret,F.L.等(Gondret,F.L.等，Low birth weight is associated with enlarged muscle fiber areaand impaired meat tendesness of the longissimus muscle in pigs.J.Anim.Sc1.2006)和Wolter 等(Wolter,B.F.等 The effect of birth weight and feeding of supplementmilk replacer to piglets during lactation on preweaning and postweaning growthperformance and carcass characteristic.J.Anim.Sc1.2002)研究報道稱,豬出生重與出生后早期的生長速度相關(guān)，初生重小的胎兒初生重大的胎兒更虛弱，出生后需要更好地環(huán)境條件來保證它的存活。因此，對豬初生重相關(guān)基因的克隆和鑒定可為解釋豬和其它哺乳動物胎兒生長發(fā)育的遺傳機制提供重要線索，并為豬的繁殖性狀遺傳改良提供理論依據(jù)。豬在妊娠期，絨毛膜上皮和子宮內(nèi)膜上皮形成皺褶，褶皺折疊水平影響著胎盤的相對大小，胎盤的相對大小是影響胎兒存活的主要因素之一，胎兒的存活率又與豬初生重具有重要的關(guān)系。
粘多糖(Glycosaminoglycans,GAG)是ECM的主要組成成分之一,硫酸類肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans, HPSGs)在胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、血管生成、上皮間葉細胞間的相互作用中起著主要作用，肝素蛋白酶(heparannase, HPSE)是一類可以裂解連接于HPSGs核心分子上硫酸肝素的一類內(nèi)切糖苷酶，HPSE主要降解硫酸類肝素，是豬胎盤中最豐富的一種糖胺聚糖(GAG)。即HPSE可以降解胎盤基質(zhì)，使胎盤更好的發(fā)育形成，為胎兒的發(fā)育創(chuàng)造了良好的條件，進而影響胎兒的初生重，最終影響胎兒出生后的成活和生長速度。因此推測HPSE可能與胎兒的初生重具有重要的關(guān)系。
與本發(fā)明密切相關(guān)的研究成果是本申請人(專利權(quán)人)前期工作的基礎(chǔ)，在申請人華中農(nóng)業(yè)大學2010年公開的專利文獻中(公開號:CN101892225A，
公開日:
2010.11.24)，涉及到一種發(fā)明名稱為HPSE基因作為豬免疫性狀相關(guān)的分子標記及其應(yīng)用(專利號:ZL 201010223062.0)該專利文獻報道了利用HPSE基因的特異片段檢測豬免疫性狀的關(guān)聯(lián)分析和應(yīng)用。但該分子標記并未涉及與豬繁殖性狀特別是與豬初生重相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用(用途)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明的目的在于尋找HPSE基因的片段作為一個分子標記在豬初生重性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
一種分子標記Alu 1-RFLP在豬初生重性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用，其步驟如下所述:
I)用人HPSE基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性80%以上的表達序列標簽(EST)，然后對EST進行拼接；提取豬肺臟組織總RNA并做cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄；設(shè)計引物對，該引物對的正向引物為5 ’ -AGCCAGGTGAGCCCGAGATG-3 ’，反向引物為5’ -GCATCTGCTCGTGTTCCTAC-3’ (見序列表 SEQ ID NO:9，10)，用 RT-PCR 方法擴增豬 HPSE基因的cDNA片段，PCR產(chǎn)物純化克隆和測序，通過序列分析獲得如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
2)根據(jù)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列設(shè)計引物對，該引物對的核苷酸序列如下所示:正向引物:5 ' -GGATGAAGGCTGGTATTT-3 '，反向引物:5' -TGGGATAAGGCAATACAG-3'(見序列表 SEQ ID NO:3，4)，擴增豬基因組 DNA，將 PCR 產(chǎn)物純化克隆和測序，通過序列分析獲得如下所述的核苷酸序列:
GGATGAAGGCTGGTATTTACATTGATGGATTTCAGTTAGGAGAAGATTTTATTGACTTGCACAAACTTCTAAGAAAATCRGCTTTCAAAAATGCAAAACTCTATGGTCCTGATATTAGCCAGCCTCGACGAAAGAATGCTGAGATGCTGAAGAGGTAAGAGTGAGAGGAAGCAGA ACCACTTTTCTTAAAAATAATATTTTCCTGTGGTGGAGACTCCTCAACAAACCACCTAATATTAAACGATTTGCTGCCTGACTTGAAGGTTTACCAAAAGAGGAAACAGTGATTGGCTCAGAAGACCAAAGATTTTGTGACAAATGGCACCATGATAAAATTTGTTTCAGAATTAGGAAGTCTGTATTGCCTTATCCCA
上述序列中的R是A或G，導(dǎo)致Alu 1-RFLP多態(tài)性；
3)檢測目的基因HPSE mRNA在豬胎盤的絨毛膜組織樣中轉(zhuǎn)錄水平的表達，設(shè)計用于檢測目的基因HPSE mRNA表達水平的引物對以及作為內(nèi)參基因GAPDH的引物對，其核苷酸序列分別如下所示:
目的基因HPSE的引物對:
正向引物:5'GTTTGTCTCCCGCATACCTGA 3'，
反向引物:5'CAAGTCCAGTCCTGAGCAAT 3'，(見序列表 SEQ ID NO:5,6)
內(nèi)參基因GAPDH的弓丨物對:
正向引物:5'ATCCCGCCAACATCAAAT 3'，
反向引物:5'CACGCCCATCACAAACAT 3';(見序列表 SEQ ID NO:7，8)
4)定位HPSE基因的mRNA在豬胎盤組織的表達位置；
5)應(yīng)用PCR-RFLP方法對序列表SEQ ID NO:1的第80位堿基進行檢測，然后進行基因型與豬初生重性狀的關(guān)聯(lián)分析。
在本申請人的公開號:CN101892225A，
公開日:2010.11.24，發(fā)明名稱:HPSE基因作為豬免疫性狀相關(guān)的分子標記及其應(yīng)用，專利號:ZL 201010223062.0文獻中，報道了從豬HPSE基因片段中克隆得到一種與免疫性狀相關(guān)的分子標記，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述，獲得HPSE基因第五外顯子上g.80A > G突變位點，該突變位點是同義突變。針對該突變位點所設(shè)計HPSE-SNP-(正向引物和反向引物)引物擴增出完整的第五外顯子和部分內(nèi)含子，該片段上第80bp處的A/G突變可被限制性內(nèi)切酶Alu KAG CT)所識別。即在序列表SEQ ID NO:1(見圖1)所示序列的第80位堿基處有一個R(A/G)的堿基突變，該突變位于第5外顯子內(nèi)，導(dǎo)致 Alu 1-RFLP多態(tài)性。
同時通過熒光定量PCR檢測了 HPSE基因在大白豬和梅山豬兩個品種妊娠的第26天、50天、95天和114天的絨毛膜組織樣中轉(zhuǎn)錄水平的表達水平，結(jié)果(如圖2所述)表明，HPSE基因在妊娠50天大白豬絨毛膜組織中的表達顯著高于梅山豬；在妊娠50天大白豬和梅山豬豬絨毛膜組織中的表達都顯著性低于26天、95天和114天?？赡馨凳局谌焉?0天時，胎盤發(fā)育達到一個“相對靜止”狀態(tài)。同時妊娠50天正處于豬妊娠的中期，申請人通過原位雜交技術(shù)確定了 HPSE基因在大白豬和梅山豬兩個品種妊娠的第26天、50天、95天在胎盤中的表達位置，結(jié)果表明在妊娠25天和95天豬絨毛膜滋養(yǎng)層上皮細胞檢測到了HPSEmRNA的表達，妊娠50天的胎盤組織中沒有檢測到陽性信號(如圖3所示)，HPSE基因在豬胎盤組織中的時期特異性表達說明其在胎盤發(fā)育及功能中有重要作用，因而可能對豬的初生重具有重要影響。


序列表SEQ ID NO:1是本發(fā)明制備的分子標記的核苷酸序列，序列全長為374bp，在該序列的第80bp處有一個A/G突變，導(dǎo)致Alu 1-RFLP多態(tài)性。
序列表SEQ ID NO:2是擴增的HPSE基因的cDNA序列，序列全長為1735bp。
序列表SEQ ID NO:3_10是設(shè)計的引物序列(這些引物序列與說明書正文中的序
列一致)。
圖1:是本發(fā)明HPSE基因制備的流程圖。
圖2:本發(fā)明中豬HPSE基因用于PCR-RFLP檢測的DNA片段(下劃線部分為引物，英文字母R代表突變位點，(A/G)為等位基因突變)。[0030]圖3:豬胎盤組織中肝素蛋白酶mRNA表達量qPCR檢測結(jié)果(縱坐標表示目的基因HPSE mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相對表達量，橫坐標表示梅山豬和大白豬的不同妊娠時間:Y26d，大白豬妊娠26天；M26d，梅山豬妊娠26天；Y50d，大白豬妊娠50天；M50d，梅山豬妊娠50天；M95d，梅山豬妊娠95天；Y95d，大白豬妊娠95天；M114d，梅山豬妊娠114天；Y114d，大白豬妊娠114天)。
圖4:豬胎盤組織中肝素蛋白酶(HPSE)mRNA定位結(jié)果，陽性信號如圖中箭頭所示，(左圖中的陽性對照和陰性對照是通過普通光學顯微鏡(奧林巴斯DH-2，日本)拍攝，可以清楚定位陽性信號的具體所在位置；右圖中的熒光圖和白光圖是通過熒光顯微鏡(尼康ECLIPSE TE2000-S,日本)拍攝，可以明確陽性信號的強弱)。
圖5:本發(fā)明中豬HPSE基因 Alu 1-RFLP的三種基因型(AA AG GG)電泳結(jié)果。圖中M:DNA分子量標準(marker I,購自普博欣公司)。
具體實施方式
實施例1HPSE基因的克隆
(I)引物設(shè)計
引物設(shè)計工作參照申請人前期工作的基礎(chǔ)(專利文獻公開號:CN101892225A，
公開日:2010.11.24，發(fā)明名稱:HPSE基因作為豬免疫性狀相關(guān)的分子標記及其應(yīng)用，專利號:ZL 201010223062.0)，用人 HPSE 基因 cDNA(GenBank 收錄號:NM_006665.3)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為80%以上的ESTs (片段長度大于IOObp)，將這些ESTs的收錄號在NCBI中用ENTREZ (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/ffeb/Search/index, html)查詢相應(yīng)序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序構(gòu)建豬EST-重疊群。根據(jù)EST拼接序列設(shè)計一對引物，其核苷酸序列如下所述:
HPSE:正向引物:5' -AGCCAGGTGAGCCCGAGATG-3'，
反向引物:5'-GCATCTGCTCGTGTTCCTAC-3'。
(2) PCR產(chǎn)物的克隆和測序
將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體，購自寶生物工程(大連)有限公司，在4°C水浴過夜連接；無菌狀態(tài)下取100-120 μ I感受態(tài)細胞于1.5ml Ependorff管中，將5 μ I的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42°C熱激90s，后冰浴3_4min，加入400ul無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于37°C振蕩培養(yǎng)45min。取100 μ I上述LB涂布于異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG) X-gal的瓊脂平板上，于37°C平放Ih后倒置培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落，接種于2-3ml LB中，于37°C，300r/min培養(yǎng)過夜。用1.5ml EP管12000r/min離心30秒收集菌體制備少量質(zhì)粒。將驗證后的重組質(zhì)粒采用雙脫氧末端終止法在DNA自動測序儀上進行測序，序列測定由委托北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。用GeneTooll.0軟件中的ASSEMBLY程序進行拼接，得到一條長度為如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，其長度為1735bp。
DNA序列同源性檢索鑒定:
通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI, National Center for BiotechnologyInformation, http://www.ncb1.nlm.nih.gov)網(wǎng)站 StJ BLAST (Basic Local AlignmentSearch Tool)軟件,將測序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的已知生理功能基因進行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。檢索結(jié)果表明所測序列與人HPSE基因DNA (GenBank收錄號:NM_006665.3)的部分序列同源性達83%。
實施例2.HPSE基因在胎盤組織中mRNA表達量的熒光定量檢測
(I)豬絨毛膜組織樣品采集
選取純種的梅山豬和大白青年母豬(來自華中農(nóng)業(yè)大學精品豬場)為研究對象，通過人工受精，用一頭純種梅山公豬(來自華中農(nóng)業(yè)大學精品豬場)與梅山母豬配種，用一頭純種大白公豬與大白母豬(來自自華中農(nóng)業(yè)大學精品豬場)配種，連續(xù)兩天進行配種。在妊娠的第26天、50天、95天和114天(每個時期每個品種(梅山豬和大白青年母豬)的妊娠母豬各2頭)分別進行屠宰采集豬胎盤的絨毛膜組織樣品。
(2)組織總RNA的提取
梅山和大白豬子宮內(nèi)膜組織樣品的總RNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的動物組織總RNA提取試劑盒(貨號:DP431)，具體操作步驟詳見該試劑盒說明書。提取的RNA用Thermo scientific公司的NanoDrop 2000核酸蛋白測定儀測定總RNA濃度。
(3)第一鏈cDNA的合成
在DEPC處理過的無RNase污染的的0.2mL的離心管中加入2 μ g的總RNA與
0.4μ g的oligo (dT)引物和0.1yg的隨機引物，70°C溫育5min以解開總RNA的二級結(jié)構(gòu)，迅速置于冰上以防二級結(jié)構(gòu)復(fù)性。然后一次加入:10yL 5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液，2.5yLIOmmoI/L dNTP mix, I μ L RNase inhibitor, 1.5 μ L M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(200U/ μ L)，用無核酸酶水(萬分之一的DEPC水，通過高溫高壓滅菌)將終體積補至50 μ L，混勻離心后于37°C溫育IOmin, 42°C溫育 50min,在85°C溫育5min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA (GenBank收錄號:NM_001146130.2)可于_20°C保存3個月。
(4)用于熒光定量PCR檢測的引物設(shè)計
從NCBI 的 Genebank 下載目的基因 HPSE (GenBank 收錄號:NM_001146130.2)和內(nèi)參基因GAPDH(GenBank收錄號:NM_001206359.1)的mRNA序列，采用primer5.0設(shè)計引物，其核苷酸序列分別如下所述:
目的基因HPSE的引物對:
正向引物:5'GTTTGTCTCCCGCATACCTGA 3'，
反向引物:5'CAAGTCCAGTCCTGAGCAAT 3'，
內(nèi)參基因GAPDH的引物對:
正向引物:5'ATCCCGCCAACATCAAAT 3'，
反向引物:5'CACGCCCATCACAAACAT 3'；
利用Mfold 網(wǎng)站驗證引物的特異性 9http://mfold.rna.albany.edu/ q =mfold/DNA-Foldin g-Form)。
(5)熒光定量檢測
反應(yīng)體系(總體積)為20 μ 1，其中 cDNA 各 0.5 μ 1，SYBR green I Mix 10 μ I,正、反向引物各0.3 μ Μ，余下體積用滅菌純凈水補足。樣品在96孔板混合均勻后直接放入Roche實時定量PCR儀(型號Roche 410)上進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)程序為95°C 3min, 40個循環(huán)，94°C 20s, 60°C 30s, 72°C 20s，最后做融解曲線從55°C _90°C每分鐘上升0.5°C。
(6)定量PCR數(shù)據(jù)分析[0061]目的基因HPSE的各個樣品都與內(nèi)參基因GAPDH的引物同時擴增，反應(yīng)的相對量以目標基因HPSE與內(nèi)參基因GAPDH的Ct值(取三個重復(fù)的平均值)的差值Λ Ct計算，再選取Λ Ct最大作為參照，用其它樣品的Λ Ct減去參照Λ Ct得到Λ Λ Ct，Ct值大于35的視為無效數(shù)據(jù)。最后各基因的相對表達水平用PfaffI (Michael ff.Pfaffl, A new mathematicalmodel for relative quantification inreal-time RT-PCR, 2001)方法計算，具體公式如下:
權(quán)利要求
1. 一種分子標記Alu I-RFLP在豬初生重性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用，其特征在于下列步驟 1)用人HPSE基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性80%以上的表達序列標簽(EST)，然后對EST進行拼接；提取豬肺臟組織總RNA并做cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄；設(shè)計引物對，該引物對的正向引物為5 ’ -AGCCAGGTGAGCCCGAGATG-3 ’，反向引物為5’ -GCATCTGCTCGTGTTCCTAC-3’，用 RT-PCR 方法擴增豬 HPSE 基因的 cDNA 片段，PCR 產(chǎn)物純化克隆和測序,通過序列分析獲得如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列； 2)根據(jù)SEQID NO :2所示的核苷酸序列設(shè)計引物對，該引物對的核苷酸序列如下所示 正向引物5' -GGATGAAGGCTGGTATTT-3'，反向引物5' -TGGGATAAGGCAATACAG-3'，擴增豬基因組DNA，將PCR產(chǎn)物純化克隆和測序，通過序列分析獲得如下所述的核苷酸序列
專利摘要
本發(fā)明屬于豬的分子標記制備與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種與繁殖性狀中特別是與豬初生重性狀相關(guān)的分子標記的新用途。該分子標記是從HPSE基因中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，在該序列的80bp處有一個A/G等位基因突變，導(dǎo)致Alu I-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明公開了該分子標記的具體新用途的步驟。
文檔編號C12Q1/68GKCN103255203SQ201210039581
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月21日
發(fā)明者余梅, 侯春艷, 劉榜, 趙書紅, 王維民, 李小平, 李新云, 曹建華, 李長春, 朱猛進, 洪林君 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan