專利名稱：:α-淀粉酶的截斷體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體是一種α-淀粉酶的截斷體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：淀粉是由D-葡萄糖單體組成的同聚物，為植物中糖類的主要貯存形式。作為最為豐富和重要的生物質(zhì)資源之一，淀粉除用于食品外，在工業(yè)上被廣泛地應(yīng)用于紡織、造紙、制藥等領(lǐng)域，特別被用作發(fā)酵工業(yè)的碳源生產(chǎn)燃料乙醇、淀粉酶糖類等。淀粉質(zhì)生物質(zhì)資源開發(fā)利用的關(guān)鍵，在于將其降解成諸如葡萄糖、麥芽糖等可發(fā)酵性糖類，其可被用于微生物發(fā)酵生成包括有機醇、氨基酸等高附加值化工產(chǎn)品，包括生物乙醇、生物丁醇等在內(nèi)的生物質(zhì)能源、以及包括L乳酸等在內(nèi)的生物基材料等。α-淀粉酶是一類隨機作用于淀粉、糖原及相關(guān)的聚糖和寡糖中D葡萄糖單元間的ct-1,4糖苷鍵，生成α-構(gòu)型的還原糖的酶類(FischerEH,SteinEA.TheEnzymes[Μ].NewYork:AcademicPress,1960.313-343.SchwimmerS,BallsAK.1solationandPropertiesofCrystallineAlpha-AmylasefromGerminatedBarley[J],JBiolChem.1949,179(3):1063-74)0a-淀粉酶屬于糖苷水解酶類，在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(CarbohydrateActiveenZymedatabase,CAZy數(shù)據(jù)庫)(http://www.cazy.0rg/)中,a-淀粉酶分布在CAZy中糖苷水解酶家族(GlycosideHydrolase,GH)GH-13、GH57和GH119三個亞家族中(WithersS,WilliamsS.2012."GlycosideHydrolases^inCazypedia.)?？傮w而言，α_淀粉酶的來源宿主囊括了從動物、植物、真菌、病毒、古菌等在內(nèi)所有原核、真核和古菌三界內(nèi)的生物，然而，每種α-淀粉酶應(yīng)用的性能、經(jīng)濟性和可行性受到，包括特異性、穩(wěn)定性、最適溫度和PH性能(GuptaR,GigrasP,MohapatraH,etal.MicrobialAlpha-Amylases:ABiotechnologicalPerspective[J].ProcessBiochemistry.2003,38(11):1599-1616.)在內(nèi)的重要的酶學(xué)性質(zhì)的影響。作為自然界長期進化的結(jié)果，這些天然的α-淀粉酶往往不能滿足淀粉工業(yè)所需求的諸如高溫、極端pH、不依賴鈣離子、抗金屬螯合性、高催化活性的條件。目前，淀粉工業(yè)中將淀粉質(zhì)原料降解為葡萄糖等發(fā)酵性糖源的過程，主要包括調(diào)漿、糊化、液化和糖化過程。以諾維信公司提供的適用于淀粉質(zhì)原料燃料乙醇生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)工藝為例，其包括如下幾部分(圖4-1):1)調(diào)漿工藝，在室溫下調(diào)整淀粉乳濃度為30-40%底物干重，通常玉米淀粉、木薯淀粉等的天然pH值為4.5左右；2)糊化工藝，105°C-110。C維持5min;3)液化工藝,加入耐高溫α淀粉酶如Liquozyme等在98°C和ρΗ5.3-ρΗ5.7條件下液化處理l_2h，待糖度達(dá)到DE值為12-18;4)糖化工藝，調(diào)整液化醪pH值為4.1-4.5、溫度為60°C，加入DextrozymeGA等糖化酶，糖化處理40-70h，糖化值DE為97-98%為止。以上工藝的設(shè)計建立在耐高溫ct淀粉酶Liquozyme和糖化酶DextrozymeGA的運用基礎(chǔ)之上，Liquozyme最適pH為pH5.5_pH6.0,可以耐受110°C高溫,但是酶活與穩(wěn)定性必須隹丐離子(不少于5ppm)的添加，而DextrozymeGA的最適pH為ρΗ4.5左右,最適溫度60°C,這種前后工序的PH值和溫度的不一致，就造成了pH調(diào)整和溫度的調(diào)整，增加了因化學(xué)試劑和“過度”的能耗帶來的成本。通常，淀粉質(zhì)原料的糊化溫度在70°C左右即可，例如玉米糊化溫度為玉米淀粉糊化溫度68-72°C，木薯淀粉該在60-80°C間。因此，開發(fā)出新的操作溫度在70°C左右、耐受pH4.5、并且不添加鈣離子的液化工藝，就可以實現(xiàn)糊化、液化和糖化的同步發(fā)酵，省卻PH調(diào)整、鈣離子添加、減少升溫和制冷帶來的能耗問題。對耐酸性α-淀粉酶的需求的另一個原因是，在于酸性操作條件下，可以充分的減少淀粉降解過程中的副產(chǎn)物，如麥芽酮糖和潘糖等，降低色素物質(zhì)的生成。研究表明在pH4.5時，酸-、堿和水催化葡萄糖重排的總速率最小，造成的副產(chǎn)物生成是最少的，而目前工業(yè)上應(yīng)用的淀粉酶的活性和熱穩(wěn)定性在PH6-7之間最高，所以必須平衡這兩種PH值，以最小化結(jié)構(gòu)重排和酶的失活，同時最大化酶活力，減少后續(xù)工藝的葡萄糖和果糖的產(chǎn)量的損失(AntrimRL:1ndustrialenzymes.1n:Enzymesinindustry:Productionandapplication.EditedbyAehleWj3rdedn.Weinheim:WILEY-VCHVerlagGmbHandC0.KGaA:2007:193-263.)。對a-淀粉酶的不依賴鈣離子性的需求原因還在于，雖然鈣離子對淀粉水解的a-淀粉酶的穩(wěn)定性和/或活性非常必要，但是鈣離子能夠抑制葡萄糖異構(gòu)酶的活性，因此在將進入產(chǎn)品工藝前葡萄糖異構(gòu)化為果糖的葡萄糖異構(gòu)酶步驟前，添加的鈣離子必須通過離子交換樹脂進行取出。圍繞著耐酸、耐溫、不依賴鈣離子的a-淀粉酶的開發(fā)，人們已經(jīng)從來源菌株的篩選和借助于蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造a-淀粉酶的特性方面開展了工作。例如，目前篩選到的產(chǎn)耐酸a-淀粉酶的菌種主要包括來源于Bacillussp.YX-1(LiuXDjXuY:Anovelrawstarchdigestingalpha-amylasefromanewlyisolatedBaciIIussp.YX-1:purificationandcharacterization.BioresourTechnol2008，99(10):4315-4320.)，BacillussubtilisX-23(OhdanKjKurikiT，KanekoHjShimadaJ，TakadaTjFujimotoZjMizunoH，OkadaS!Characteristicsoftwoformsofalpha-amylasesandstructuralimplication.ApplEnvironMicrobiol1999,65(10):4652-4658.)，LactobaciIIusmanihotivoransLMG18010(AguilarGjMorlon-GuyotJ，Trejo-AguiIarBjGuyotJP:Purificationandcharacterizationofanextracellularalpha-amylaseproducedbyLactobacillusmanihotivoransLMG18010(T)，anamylolyticlacticacidbacterium.EnzymeMicrobTechnol2000，27(6):406-413.)，Alicyclobacillusacidocaldarius(MatzkeJ，SchwermannB，BakkerEP:Acidostableandacidophilicproteins:theexampleofthealpha-amylasefromAlicyclobacillusacidocaldarius.CompBiochemPhysiolAPhysiol1997，118(3):475-479.)和Pyrococusfurious(DongGjVieilleC，SavchenkoA，ZeikusJG:Cloning,sequencing,andexpressionofthegeneencodingextracellularalpha-amylasefromPyrococcusfuriosusandbiochemicalcharacterizationoftherecombinantenzyme.ApplEnvironMicrobioll997,63(9):3569-3576.)D篩選到的不依賴鈣離子α-淀粉酶產(chǎn)生菌株主要有Bacillussp.KR-8104(SajediRH，Nader1-ManeshH，KhajehK,AhmadvandRjRanjbarB，AsoodehA，MoradianF:ACa—independenta-amylasethatisactiveandstableatlowpHfromtheBacillussp.KR-8104.EnzymeMicrobTechnol2005，36:666-671.)和AlkaliphilicBacillusKSM-K38(HagiharaH,IgarashiK,HayashiY,EndoK,Ikawa-KitayamaK,OzakiK,KawaiS，ItoS:Novelalpha-amylasethatishighlyresistanttochelatingreagentsandchemicaloxidantsfromthealkaliphilicBacillusisolateKSM-K38.ApplEnvironMicrobiol2001,67(4):1744-1750.)。借助于定向進化技術(shù)提高現(xiàn)有商品化α-淀粉酶的耐酸性、降低鈣離子依賴性方面也取得了一些進展。Show和Day通過易錯PCR和DNAshuffling相結(jié)合的方法提高了地衣芽胞桿菌α-淀粉酶在酸性條件下的活性(ShawA,BottR,DayAG:Proteinengineeringofalpha-amylaseforlowpHperformance.CurrOpinBiotechnoll999,10(4):349-352.)。Nielsen等探討了BLA活性隨pH變化的決定因素(NielsenJE,BorchertTV,VriendG:Thedeterminantsofalpha-amylasepH-activityprofiles.ProteinEng2001,14(7):505-512.)。Liu等通過引入兩個突變L134R/S320A將BLA在pH4.5條件下的催化效率提高14倍，同時大大提高了較低pH值下的耐受性。耐酸性實驗和結(jié)構(gòu)特征研究表明，靜電效應(yīng)在BLA在134和320位點發(fā)揮了中至關(guān)重要的作用(LiuYH,LuFP,LiY,WangJL,GaoC:AcidstabilizationofBacilluslicheniformisalphaamylasethroughintroductionofmutations.ApplMicrobiolBiotechnol2008,80(5):795-803.)。然而，同時滿足適合于工業(yè)用途的不依賴鈣離子、耐酸、耐溫的耐酸α-淀粉酶是仍需要解決的問題。本申請人(廣西科學(xué)院)篩選得到一株產(chǎn)耐酸、不依賴鈣離子α-淀粉酶的中溫枯草芽孢桿菌BacillussubtilisCN7,該菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏號為CCTCCM2012061，其所產(chǎn)α-淀粉酶粗酶液最適PH4.6，最適溫度53°C，pH3.010.0可以保持良好的活性，該結(jié)果發(fā)表在《中國釀造》2009年第12卷上(秦艷，王青艷，陸雁，楊建，黃日波:酸性α-淀粉酶生產(chǎn)菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究.釀酒科技2009，12:17-19.)，同時克隆并異源表達(dá)了該酶的預(yù)測的成熟肽α-淀粉酶基因(刪除了N-端33氨基酸)，重組成熟肽表現(xiàn)的最適溫度為65°C,最適pH在pH6.06.5之間，結(jié)果發(fā)表在《微生物學(xué)通報》2010年37卷10期上(楊鍵，王青艷，金輝，秦艷，王成華，黃日波:一種不依賴鈣離子的酸性alpha-淀粉酶基因的克隆表達(dá).微生物學(xué)通報2010，7(10):1427-1431.)，相關(guān)的序列及基因已提交GenBank，登陸號分別`為JN980090和JQ045771。BacillussubtilisCN7所產(chǎn)耐酸、不依賴鈣離子的中溫α-淀粉酶表現(xiàn)出的耐受ΡΗ4.5，不依賴鈣離子特性以及最適溫度65°C，對于上文提及的糊化、液化和糖化的同步發(fā)酵，及省卻pH調(diào)整、鈣離子添加、減少升溫和制冷帶來的能耗問題，展示了良好的應(yīng)用前景。但是，需要進一步提高α-淀粉酶的耐溫性和催化效率、降低最適ΡΗ，對于提高α-淀粉酶的利用率，提高淀粉水解效率，進而縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種α-淀粉酶的截斷體及其應(yīng)用，該變體酶可用高效降解淀粉，并可用于構(gòu)建高效降解淀粉的宿主菌，所述變體酶的比活力最高提高2.2倍，轉(zhuǎn)化數(shù)最高提高1.20倍，催化效率最高提高42%，半衰期溫度提高2.VC，最適pH降低一個單位。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達(dá)到上述目的:一種α-淀粉酶的截斷體及其應(yīng)用，通過對親本α-淀粉酶的截斷和融合額外的多肽，獲得催化活性提高、耐溫性提高、最適pH降低的變體酶。所述的親本α-淀粉酶來源于中溫枯草芽孢桿菌BacillussubtilisCN7,保藏號為CCTCCM2012061，保藏日期為2012年3月7日，氨基酸序列如SEQIDN0:1所示，其編碼基因為SEQIDN0:2所示，其在GenBank的登錄號為JQ045771。從BacillussubtilisCN7中分離純化出的親本α-淀粉酶具有如下的特征:1、分子量約為67kDa;2、等電點PI值約為5.30;3、酶的最適反應(yīng)溫度為65°C，在60°C-70°C范圍內(nèi)均可保持90%以上的活力；4、酶的半衰期溫度為59.6°C;5、酶的最適PH值為6.06.5，在pH4.57.0兩者均可保持80%以上的活力；6、酶的反應(yīng)活性不受包括Ca2+(10mol/L)和EDTA(I100mmol/L)影響；7、在最適ρΗ6.5和最適溫度65°C條件下，對可溶性淀粉的Km值為3.44+0.42g/L，轉(zhuǎn)化數(shù)為1024.05±48.5s—1，比活力為905.99±96.52U/mg;8、酶對可溶性淀粉的完全降解產(chǎn)物主要為葡萄糖和麥芽糖，含有少量的麥芽四糖，基本不含麥芽三糖和麥芽五糖。本發(fā)明所述構(gòu)建α-淀粉酶的截斷體的方法，包括如下步驟:I)建立目的酶的理論模型，限于解析蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的困難，本發(fā)明立足于建立計算機理論模型的方法，對目的酶進行結(jié)構(gòu)的研究；目前，有大量的免費網(wǎng)站及商品化軟件可以用來對目的氨基酸序列進行理論模型的建立，例如基于同源建模的SwissModel服務(wù)器(http://swissmodel.expasy.0rg/),如M4T月艮務(wù)器(http://manaslu.aecom.yu.edu/M4T/),1-TASSER月艮務(wù)器(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I~TASSER/)等；因為本發(fā)明中α-淀粉酶基因與GenBank中已公布的α-淀粉酶基因具有很高的同源性，而且其氨基酸序列與晶體結(jié)構(gòu)IBAG中氨基酸序列同源性約為90%，所以本發(fā)明選用SwissModel服務(wù)器，建立同源理論模型；2)基于結(jié)構(gòu)的序列比對，選擇具有代表性的α-淀粉酶的晶體結(jié)構(gòu)，與I)中建立的理論結(jié)構(gòu)進行結(jié)構(gòu)比對(Superimpose),確定對底物結(jié)合、穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和催化活性相關(guān)的氨基酸殘基，及功能保守區(qū)域，選擇可以截斷的部位；本發(fā)明以IBAG(模板晶體結(jié)構(gòu))和IBLI(商業(yè)上廣泛采用的地衣芽胞桿菌的α-淀粉酶的結(jié)構(gòu))為參照酶，借助于Mammoth月艮務(wù)器(http://Dhysbi0.mssm.edu/ortizg/)、和/或MOE(MolecularOperatingEnvironment,ChemicalComputingGroup公司)和/或Swiss-PdbViewer軟件，進行結(jié)構(gòu)疊合，尋找對結(jié)構(gòu)和功能重要的結(jié)構(gòu)區(qū)域及選擇可以截斷的位置；3)對截斷及引入融合多肽造成的α-淀粉酶結(jié)構(gòu)的擾動進行評估，對截斷體或者引入如何多肽后的氨基酸序列重新建立理論模型，并借助于上面的MOE工具進行能量最小化，同時借助于分子動力學(xué)軟件如Amber等對所實施改造對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響進行評估。本發(fā)明所述構(gòu)建α-淀粉酶的截斷體的另一技術(shù)方案是刪除親本α-淀粉酶N端44個信號肽的成熟α-淀粉酶(Amy7Μ)，通過亞克隆其編碼基因，以pSE380質(zhì)粒為表達(dá)載體構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒PSA7M，然后轉(zhuǎn)化進大腸桿菌JM109構(gòu)建了工程菌JA7M，JA7M在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)重組酶，而后通過酶的純化表征和酶解產(chǎn)物分析等復(fù)雜的實驗步驟，鑒定獲得了酶學(xué)性質(zhì)改善的截斷體酶。以稀碘法測定的酶學(xué)性質(zhì)除保留了與親本α-淀粉酶相同的最適ρΗ、ρΗ耐受性和最適溫度65°C及溫度耐受性，保留了不依賴鈣離子特性和基本相同的底物親和力和酶解產(chǎn)物，但是比活力為1694.70U/mg，轉(zhuǎn)化數(shù)為1.97g.μmoF1.s_/催化效率為0.52L/μmol/s。以下α-淀粉酶的變體的酶學(xué)性質(zhì)表征均以Amy7Μ的酶學(xué)參數(shù)為參考，并以該稀碘法測定的該成熟肽的酶學(xué)性質(zhì)為親本α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明所述構(gòu)建α-淀粉酶的截斷體的再一技術(shù)方案是同時刪除N端44個氨基酸殘基和C端194個氨基酸殘基的截短體Amy7D，采用與Amy7Μ相同的構(gòu)建步驟，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSA7D和含有pSA7D的工程大腸桿菌JA7D，并采用同樣的表征方法，鑒定出的Amy7D的酶學(xué)性質(zhì)與Amy7M基本相同，即具有相同的最適溫度65°C、最適pH6.5和耐酸特性、酶解產(chǎn)物譜基本相同，但是表征溫度耐受性的半數(shù)期溫度提高2.7°C，同時Amy7D的比活力、轉(zhuǎn)換數(shù)和催化效率，分別為3524.97U.mg'2.74g.μmoF1.s_1和0.74L/μmol/s,分別為Amy7M的2.08倍和1.39倍和1.42倍。本發(fā)明所述構(gòu)建α-淀粉酶的截斷體的另一技術(shù)方案是在Amy7D截斷體的N端融合了由“His-tag-連接肽-腸激酶位點”組成的小肽，其氨基酸組成為HHHHHHGSGS⑶DDDKA，所形成的變體α-淀粉酶Amy7E，與Amy7D相比，最適pH值酸移一個單位，從pH6.5降低為ρΗ5.5，同樣pH耐受范圍從ρΗ4.5_ρΗ7.5變窄為ρΗ4.5_ρΗ6.5。本發(fā)明的另一個α-淀粉酶變體,其在截斷體Amy7D的N端融合一個6xHis純化標(biāo)簽得到Amy7N，保留了與Amy7D同樣的最適溫度、最適pH和底物代謝譜，但是獲得了更加優(yōu)良的酶催化特性，其比活力為4714.67U/mg、轉(zhuǎn)化數(shù)為3.73g/μmol/s、催化效率為0.60L/411101/8，分別為親本411^7]/1的2.78倍、1.89倍和1.15倍。本發(fā)明的另一個α-淀粉酶變體是采用與Amy7N相同的截斷與融合策略，將組氨酸標(biāo)簽融合在Amy7D的C端，得到的變體α-淀粉酶Amy7C，表征結(jié)果表明Amy7C與Amy7N相似，保留了與Amy7D同樣的最適溫度、最適pH和底物代謝譜，但是獲得了更加優(yōu)良的酶催化特性，其比活力為5472.12U/mg、轉(zhuǎn)化數(shù)為4.33g/μmol/s、催化效率為0.65L/ymol/s,分別為親本Amy7M的3.23倍、2.20倍和1.25倍。所獲得變體α-淀`粉酶在淀粉降解和含淀粉材料處理中的應(yīng)用，主要包括淀粉液化、液化淀粉的糖化、紡織品脫漿、造紙和紙漿工業(yè)中的淀粉修飾、釀造、乙醇生產(chǎn)和烘焙，尤其是用于淀粉工業(yè)中新型同步糊化、糖化和液化新工藝的開發(fā)中的應(yīng)用。另外，還包括用于生產(chǎn)麥芽糊精的方法，其通過將變體α-淀粉酶與淀粉或淀粉水解物一起溫浴，從而水解淀粉或淀粉水解物中的α-1，4糖苷鍵。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有以下實質(zhì)性特點和顯著的進步:1.本專利公開的截斷體在保留親本α-淀粉酶的不依賴鈣離子特性、最適反應(yīng)溫度和最適PH的同時，獲得了更大的催化效率和熱穩(wěn)定性，與親本α-淀粉酶(Amy7M)相比，半衰期溫度提高2.7°C、比活力提高了2.23倍(Amy7C)、轉(zhuǎn)化數(shù)提高了1.20倍(Amy7C)，催化效率最高提`高42%(Amy7D)。需要指出的是，Ohdan等(OhdanK,KurikiT,KanekoH,ShimadaJ,TakadaT,FujimotoZ,MizunoH,OkadaS:Characteristicsoftwoformsofalpha-amylasesandstructuralimplication.ApplEnvironMicrobioll999,65(10):4652-4658.)通過對BacillussubtilisX-23中不同形態(tài)α-淀粉酶的研究，指出截斷體形式的α-淀粉酶具有改善的熱穩(wěn)定性和比活力，但是轉(zhuǎn)化數(shù)和催化效率基本不變。本發(fā)明采取不同的、更短的截取方法，同時通過融合小肽，在提高熱穩(wěn)定性和比活力的同時，大大提高了比活力、轉(zhuǎn)化數(shù)和催化效率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越了Ohdan等的報道。這種增加的耐溫性和催化效率，將更加有利于工業(yè)生產(chǎn)。2.本發(fā)明提出基于α-淀粉酶結(jié)構(gòu)比對，結(jié)合功能分析與分子動力學(xué)模擬設(shè)計截斷體位點，并通過添加人工合成肽提高截斷體的穩(wěn)定性、催化活性、耐酸性等酶學(xué)性質(zhì)，分別得到了耐溫性提高2.7°C、催化活性提高2.23倍、最適pH降低一個單位的α_淀粉酶變體。作為一種常用技術(shù)，本專利所提出并采用的多肽融合及酶的截斷技術(shù)，與已有技術(shù)間存在著明顯的不同之處。公開號CN1233286A(申請?zhí)?7198640.1，國際申請PCT/DK97/00448，國際公布W098/16633，諾沃挪第克公司)構(gòu)建了α-淀粉酶與纖維素結(jié)合域等糖類結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)融合(共價連接)以用于淀粉降解，提高生淀粉的降解活性；專利要求所融合CBD的氨基酸分子量位于4kD到約40kDa之間，通過2-100個氨基酸殘基的接頭，連接于目的酶的N端或C端或內(nèi)部。實施例中報道了內(nèi)切葡聚糖酶的45個氨基酸組成的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD^ia)和糞肥纖維單孢菌內(nèi)切葡聚糖酶A(CenA)的103個殘基CBDemA與Termamyl的連接,其中酶活提高最多的是，帶CBDCenA-Termamyl比Termamyl的液化效果(以75gNU酶/克DS，液化90分鐘計)的提高了49.5%(DE值從10.3提高到15.4)。公開號CN102016044A(申請?zhí)?00980115639.1，PCT/US2009/041498，W02009/134670，丹尼斯科美國公司)描述了將AmyL淀粉酶N端部分約180個或更多連續(xù)的氨基酸殘基的氨基端結(jié)構(gòu)域與AmyS淀粉酶的羧基端結(jié)構(gòu)域融合、形成長度為480-515個氨基酸的嵌合多肽，獲得了高穩(wěn)定性和良好淀粉降解性能的嵌合α_淀粉酶。同樣，W096/23874A1公開了地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis),解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和液化淀粉芽抱桿菌(B.stearothermophiIus)α-淀粉酶的嵌合體(hybrid),W003/014358A2公開了B.licheniformis和B.amyloliquefaciens特殊的α-淀粉酶雜合體。公開號CN1329665A(申請?zhí)?9814205.0，國際申請PCT/DK99/00686，國際公布W000/34452)通過N末端肽延伸區(qū)(包括1-100氨基酸殘基，優(yōu)選1_50氨基酸殘基，更優(yōu)選1-20ΑΑ，甚至更優(yōu)選1-10ΑΑ)改良具有葡糖淀粉酶活性的酶的特性，尤其是通過將一個或更多的保守氨基酸殘基加到所述親本(成熟)葡糖淀粉酶的N末端改良了所述酶的熱穩(wěn)定性。公開號CN1560242A(申請?zhí)?00410049560.2，優(yōu)先權(quán)JP163569/1999，花王株式會社)氨基端起11-110氨基酸序列置換為另一種液化α-淀粉酶對應(yīng)于該氨基酸殘基序列的氨基酸序列。并沒有具體的實施例數(shù)據(jù)。公布號CN102112621A(申請?zhí)?00980130315.5，PCT/US2009/046279，W02009/149271，丹尼斯科美國公司)描述了枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶(AmyE)全長及成熟肽形式的N端/C端添加便于表達(dá)、檢測和/或純化的序列如信號序列或His標(biāo)簽。但并未見通過融合標(biāo)簽對活力的影響報道。文中還提及全部或部分C端淀粉酶結(jié)合域序列缺失的“截短”AmyE(“AmyE-tr”)，但同樣沒有給出明確的儀器測量數(shù)據(jù)?？梢钥闯?，公開號CN1233286A、CN102016044A、TO03/014358A2和TO96/23874A1通過完整結(jié)構(gòu)域的融合，通常是比較大的肽段，達(dá)到提高酶的催化活力和/或熱穩(wěn)定性的效果。公開號CN1329665A提出通過N末端肽延伸區(qū)添加一個或更多的保守氨基酸殘基來提高熱穩(wěn)定性。公開號CN1560242A提出置換氨基末端11-110氨基酸為另外一種液化α-淀粉酶對應(yīng)氨基酸殘基的思想，但沒有具體實施例數(shù)據(jù)。與以上這6個專利均通過引入額外的肽段，以達(dá)到提高熱穩(wěn)定性或/和催化活性的目的不同，本專利通過截斷提高了比活性、催化活性和熱穩(wěn)定性。而公布號CN102112621A提出在成熟肽或者全長淀粉酶N端和/或C端引入便于表達(dá)、檢測和/或純化的序列如信號序列或His標(biāo)簽，并及全部或部分C端淀粉酶結(jié)合域序列缺失的“截短”AmyE(“AmyE-tr”)，但是均有給出明確的儀器測量數(shù)據(jù)，也并未將所提出的截斷和添加組氨酸標(biāo)簽用于提高酶活或者催化活力目的。本專利提出并用實驗證實了截斷和添加組氨酸標(biāo)簽及其他短肽標(biāo)簽用于提高α-淀粉酶的催化活力、熱穩(wěn)定性和最適PH值等酶學(xué)性質(zhì)，并且這些酶學(xué)性質(zhì)的改善遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越了已有的報道。圖1是重組截斷體α-淀粉酶的SDS-PAG電泳圖。圖中標(biāo)記為:Α、1-純化的截斷體Amy7M;2-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品；3_純化的截斷體Amy7D;4-純化的截斷體Amy7C;5-純化的截斷體Amy7N;B、1-誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌JA7E；2-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品；3_誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌JA7E；4-含空質(zhì)粒PSE380的JM109;5_純化的截斷體Amy7E；6-純化的截斷體Amy7E。圖2是重組截斷體α-淀粉酶酶活隨溫度變化圖。其中代表Amy7Μ，■代表Amy7D，▲代表Amy7C，▼代表Amy7N，代表Amy7E。圖3是重組截斷體α-淀粉酶酶活隨pH變化圖。其中代表Amy7M，■代表Amy7D，▲代表Amy7C，▼代表Amy7N，代表Amy7E。圖4是重組截斷體α-淀粉酶Amy7C酶解可溶性淀粉漿的HPLC檢測圖。圖中標(biāo)記為:A、可溶性淀粉漿在pH4.5和65°C糊化圖；B、Amy7C同步糊化液化圖；C、Amy7C同步糊化液化糖化圖；D、Amy7C同步糊化糖化圖。其中，1_糊精；2_麥芽四糖；3-麥芽三糖；4_麥芽糖；5_葡萄糖。具體實施方式以下通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步描述。實施例1本實施例說明親本酶的純化、純化酶的表征及酶解產(chǎn)物分析方法1、枯草芽抱桿菌BacillussubtilisCN7的培養(yǎng)枯草芽孢桿菌BacillussubtilisCN7分離自廣西大學(xué)農(nóng)場土樣,菌種保藏于本實驗室，同時提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCM2012061。培養(yǎng)基為液體LB加1%可溶性淀粉，每升培養(yǎng)基中含蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，可溶性淀粉IOgo固體培養(yǎng)基為上述液體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂。取保存于-80°C的凍存管原始菌種一管，用接種環(huán)取菌體在固體培養(yǎng)基平板上劃線，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，置于37°C和220r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)10小時,而后按照1%接種量再轉(zhuǎn)接一次，于同樣的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12小時，所得菌體用于提取總DNA，上清液用于純化原始酶液。2、親本α-淀粉酶的純化發(fā)酵液中α-淀粉酶的回收純化按照“加熱除雜-超濾濃縮-硫酸銨沉淀-透析除鹽-層析分離-超濾濃縮并換緩沖液”五步操作流程進行:第一步，將IL發(fā)酵培養(yǎng)液于4°C、9000r/min轉(zhuǎn)速下離心IOmin除去菌體，上清液于50°C水浴中溫浴30min后，于4°C、9000r/min轉(zhuǎn)速下離心30min除去變性的雜蛋白；第二步，借助于Pall公司MinimateTFF系統(tǒng)，采用截留量為IOkDa的超濾膜(0megaTM10K)，將IL上清液濃縮至50mL，操作按照操作說明書進行；第三步，將濃縮液進行硫酸銨分級沉淀，將飽和度為40%和80%間的沉淀物，用30mL0.05mol/L磷酸-檸檬酸緩沖液(pH6.5)重新溶解，裝載于截留量為IOkDa的透析袋中，于同樣的緩沖液中透析24h，中間更換緩沖液兩次，然后用PEG20000濃縮至4mL，整個透析操作在4°C下完成；第四步,借助于AKTA蛋白純化系統(tǒng),將4mL濃縮樣品,通過SephacrylS300分子篩層析分離，其中柱子規(guī)格為2.5cmx80cm,操作流速為lmL/min,流動相采用0.05mol/L磷酸-檸檬酸緩沖液(PH6.5)加入0.2mol/LNaCl，按4.5mL體積分段收集洗脫液；第五步，將各具有α-淀粉酶的分段收集液，分別置于分子截留量為IOkDa的Millipore超濾管中，于4°C、3500r/min轉(zhuǎn)速下離心濃縮，獲得溶解于ImL0.05mol/L磷酸-檸檬酸緩沖液(PH6.5)的純化酶液。純化蛋白的純度和均一性通過SDS-PAGE進行檢驗，蛋白的含量通過Bradford法，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白進行檢測。3、淀粉酶酶活的測定本專利采用兩種方法檢測α-淀粉酶的酶活。第一種檢測方法是稀碘法，又稱碘-淀粉法。該檢測方法基于淀粉遇碘變藍(lán)的反應(yīng)原理，通過檢測淀粉底物的吸光度值的變化，來測定α-淀粉酶代謝淀粉的能力。參照《中國食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)匯編-發(fā)酵制品卷(上)》(第二版)(QB/T2306-1997，耐高溫α-淀粉酶制劑)檢測方法。500μI反應(yīng)體系中含0.5%可溶性淀粉，0.05mol/L磷酸-檸檬酸緩沖液(pH6.5)及50μI適當(dāng)稀釋的α-淀粉酶酶液(約lμg/mL)。反應(yīng)液于65°C水浴中，反應(yīng)5min，加入250μI稀鹽酸(0.lmol/L)和2.5ml稀碘液，于600nm處檢測吸光值。酶活定義為，在65°C、pH6.5(0.05mol/L磷酸-檸檬酸緩沖液)條件下，Imin液化Img可溶性淀粉成為糊精所需要的酶量，即為I個酶活力單位，以U表示。第二種檢測方法采用3，5一二硝基水楊酸(DNS)法。在堿性條件下，還原糖和3，5-二硝基水楊酸共熱后，產(chǎn)生一種棕紅色氨基化合物。在一定濃度范圍內(nèi)，該棕紅色物質(zhì)在540nm波長處吸光度與還原糖的量成線性關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。500ul反應(yīng)體系中含1%可溶性淀粉，0.05M磷酸-檸檬酸緩沖液(pH6.5)及50μI適當(dāng)稀釋的α-淀粉酶酶液。反應(yīng)液于65°C水浴中，反應(yīng)5min，加入375ulDNS反應(yīng)液，于沸水浴中反應(yīng)5min后，于540nm處檢測生成的還原糖量。一個酶活力單位(U)定義為，在65°C、pH6.5(0.05mol/L磷酸-檸檬酸緩沖液)條件下，Imin液化可溶性淀粉生成IμmoI還原糖所需要的酶量。4、酶學(xué)參數(shù)的測定最適pH測定:參照3中淀粉酶酶活測定方法，分別用ρΗ2.5到ρΗ8.5的0.05mol/L磷酸-檸檬酸緩沖液構(gòu)建1.2.3中所述500μL反應(yīng)體系，相對活力最高的緩沖體系pH值即為最適pH。最適溫度Tm:參照3中方法，分別將標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系置于5095°C反應(yīng)，最高反應(yīng)活力所對應(yīng)的溫度值即為Tm。[0061]Km和keat值:采用雙倒數(shù)法，測定底物濃度分別為0.49g/L條件下的最初反應(yīng)速度，推導(dǎo)出米氏常數(shù)Km(單位為g/L)，催化數(shù)kMt(單位為s—1)和催化效率值kMt/Km(單位為L/g/s)。半衰期溫度7=:分別將純化酶液于5080°C條件下熱處理30min，于4°C放置2h后檢測殘余酶活，相對酶活喪失50%時所對應(yīng)的處理溫度即為值。5、金屬離子和EDTA的影響純化酶液分別與金屬離子(lmmol/L和5mmol/L)或者EDTA(lmmol/L-100mmol/L)于4°C放置2h后，按照3中方法檢測殘余酶活。6、酶解產(chǎn)物的HPLC分析2mL酶解·反應(yīng)體系中含有1%可溶性淀粉，0.05mol/L磷酸-檸檬酸緩沖液(pH6.5)，2U純化酶液(約1μg/mL)。反應(yīng)體系于50°C水浴中，反應(yīng)24h。于沸水浴中IOmin終止反應(yīng)后，于4°C,12000r/min離心5min,上清液通過0.22μm濾膜過濾,過濾液通過酸柱AminexHPX-87H(Bio-Rad，USA)進行HPLC檢測。檢測條件為，RI溫度50°C，流速0.5mL/min,流動相為5mmol/L硫酸。實施例2本實施例說明全長α-淀粉酶基因的克隆與分析、重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)、重組酶的純化1、全長α-淀粉酶基因的克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建參照《分子克隆實驗指南》(薩姆布魯克，拉塞爾.分子克隆實驗指南[Μ].北京:科學(xué)出版社，2002.)，提取BacillussubtilisCN7總DNA，以此總DNA為模板，以引物Amy7-S和Amy7_A，PCR擴增全長為1980bp的完整α-淀粉酶基因amy7，引物序列如下:[0071]Amy7-S:5’-GTATCATGATGTTTGAAAAACGATTCAAAAC-3’Amy7-A:5’-GCGAAGCTTAATCAATGCGGAAGATAACCATTC-3’為操作方便分別在上游引物Amy7-S中引入PagI酶切位點(下劃線部分)，在下游引物Amy7-A中引入HindIII酶切位點(下劃線部分)。25μLPCR反應(yīng)體系的構(gòu)建如下:1μL總DNA，0.5μL上游引物Amy7_S(濃度為10mmol/L),0.5μL下游引物Amy7_A(濃度為10mmol/L),2μLdNTPs(每樣dNTP2.5mmol/L)，5μL5xPriraerSTARwbuffer,0.25μL(2.5U/μL)PrimerSTAR*DNA聚合酶，力口入16.75μLddH2O補足至25μL。體系混勻后置于PCR以上執(zhí)行擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序如下:第一步:95°C3分鐘；第二步:98°ClO秒，68°C2分鐘，如此循環(huán)30次；第三步:72°ClO分鐘。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)過紫外檢測目的產(chǎn)物后，經(jīng)過PagI和HindIII雙酶切后膠回收，回收片段與經(jīng)過NcoI和HindIII雙酶切回收的pSE380質(zhì)粒載體片段，進行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布與含有氨芐青霉素(IOOng/μL)的LB固體培養(yǎng)平板上進行篩選，陽性克隆委托上海生工進行DNA測序驗證，分析克隆到的基因及讀碼框情況。驗證正確的基因即為BacillussubtilisCN7a-淀粉酶基因，記為amy7，將驗證正確的重組子命名為pSA7，重組質(zhì)粒pSA7轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109，記為JA7[0076]2、α-淀粉酶基因的分析基因amy7的序列分析通過VectorNTI10.0程序完成，序列相似件分析通過BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)(http://blast,ncb1.nlm.nih.gov/)完成。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析借助于PFAMtools(http://pfam.sanRer.ac.uk/)信號肽的預(yù)測借助于SignalP3.0月艮務(wù)器[8](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。Amy7白侖晶體結(jié)構(gòu)通過SwissModel服務(wù)器完成(http://swissmodel.expasy.0rg/),并通過Pymol程序展不(ThePyMOLMolecularGraphicsSystem,Version0.99rc6,DeLanoScientificLLC.)結(jié)構(gòu)比對借助于Mammothserver完成。3、含重組質(zhì)粒工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)與純化挑取JA7單菌落，接種于5ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液(酵母膏IOg/L，蛋白胨5g/L，氯化鈉10g/L，自然pH)，于37°C、220r/min條件下培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)之菌液，按照1%的接種量轉(zhuǎn)接于IOOml含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中。待菌液培養(yǎng)至0D_為0.6左右，加入終濃度為lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，同樣條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)16h0于9000r/min、4°C離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌,沉淀用0.05mol/L磷酸-朽1檬酸緩沖液(pH6.5)洗漆一次后,重懸于同樣的緩沖液中，菌懸液于超聲波400W、工作/間歇時間8s/8s下超聲破胞25min,破胞液于12000r/min4°C下離心30min,上清液為粗酶液,接下來采用與實施例1中2、親本α-淀粉酶的純化相同的純化方法純化重組酶Amy7。實施例3本實施例說明截斷體α-淀粉酶的構(gòu)建與純化1、截斷體α-淀粉酶的構(gòu)建以Amy7M-S和Amy7M_A為引物，以BacillussubtilisCN7總DNA為模板，采用與實施例1中1、全長α-淀粉酶基因的克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建相同的方法，構(gòu)建含有截斷Amy7Μ編碼基因的重組質(zhì)粒pSA7M，引物序列如下:Amy7M-S5'~GACTCATGAGCTCGGTCAAAAACGGGACCATC~3'Amy7M-A5'~GTACAAGCTTATGCGGAAGATAACCATTCAAA~3'上游引物Amy7M_S中引入PagI酶切位點(下劃線部分)，在下游引物Amy7M_A中引入HindIII酶切位點(下劃線部分)。以引物么11^70-5和411^70-4為引物，以83(^11118subtilisCN7總DNA為模板，采用與實施例1中1、全長α-淀粉酶基因的克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建相同的方法，構(gòu)建含有截斷Amy7D編碼基因的重組質(zhì)粒pSA7D，引物序列如下:Amy7D-S5'~GTATCATGAGCTCGGTCAAAAACGGGACCATC~3'Amy7D-A5'~GCGAAGCTTAATCATCAGGATAAAGAACAGCCGC~3'上游引物Amy7D_S中引入PagI酶切位點(下劃線部分)，在下游引物Amy7D_A中引入HindIII酶切位點(下劃線部分)。采用一步快速PCR方法，以質(zhì)粒pSA7D為模板，構(gòu)建含截短體Amy7E、Amy7C和Amy7N基因的重組質(zhì)粒pSA7E、pSA7C和pSA7N。構(gòu)建pSA7E的引物為:Amv7E-S5'~TATCATGAGCCACCATCATCATCATCATGGTTCTGGTTCTGGTGACGACGACGACAAGGCCATGGGATCCTCGGTCAAAAA[0095]CGGGACCATC-3'(下劃線部分為His-tag-連接肽-腸激酶位點)Amy7E-A5'-GCGGAATTCTTAATCATCAGGATAAAGAACAGCCGC-3'；構(gòu)建pSA7C的引物為:Amy7C-S:5'~CACCACCACCACCACCACTAAGCTTGGCTGTTTTGGCGG~3'Amy7C-A:5'~GCCAAGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCATCAGGATAAAGAACAG~3'構(gòu)建pSA7N的引物為:Amy7N-S:5'~ACCATGCACCATCATCATCATCATAGCTCGGTCAAAAACGGGAC~3'Amy7N-A:5'~ATGATGATGGTGCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG~3'以上劃線部分為編碼互補且編碼組氨酸的密碼子。25μLPCR反應(yīng)體系的構(gòu)建如下:1μLpSA7D質(zhì)粒DNA，0.5μL上游引物Amy7_S(濃度為IOmmol/L),0.5μL下游引物Amy7_A(濃度為IOmmol/L),2μLdNTPs(每樣dNTP2.5mmol/L),5μL5xPnmerSTAR^buffer,0.25μL(2.5U/μL)PrimerSTAR*DNA聚合酶，加入16.75μLddH20補足至25μL。體系混勻后置于PCR以上執(zhí)行擴增反應(yīng)。PCR擴增條件均為:第一步:95°C3min;第二步:98°ClOs,68°C5min40s，如此循環(huán)30次；第三步:72°ClOmin0各PCR產(chǎn)物分別經(jīng)DpnI(購自加拿大Fermentas公司)37°C消化2h，消化產(chǎn)物于80°C失活20min后，直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種于含100μg/mL氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒委托上海生工測序驗證。驗證所得截斷體質(zhì)粒均正確。將含有PSA7E、pSA7C和pSA7N的工程大腸桿菌分別命名為JA7E、JA7C和JA7N。2、截斷體α-淀粉酶的表達(dá)與純化采用與實施例2中3、含重組質(zhì)粒工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)與純化相同的誘導(dǎo)表達(dá)方法，經(jīng)過超聲離心后，分別得到了含Amy7E、Amy7C和Amy7N的粗酶液。上清液加入終濃度為300mmol/L的NaCl和5mmol/L的咪唑，用0.22μm濾膜過濾所得透過液直接用N1-NTA柱純化重組淀粉酶。純化所得酶液，通過分子截留量為IOKDa的Millipore超濾管，反復(fù)換洗緩沖液兩次，以除去鹽分及咪唑成份。鎳柱純化操作過程參照操作手冊進行。純化蛋白的純度和均一性通過SDS-PAGE進行檢驗，蛋白的含量通過Bradford法，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白進行檢測。各截斷體純化結(jié)果如圖1所示。實施例4本實施例說明α-淀粉酶變體的純化及酶活分析采用實施例2和實施例3中方法，對親本α-淀粉酶、各截斷體α-淀粉酶Amy7M、Amy7C、Amy7D、Amy7N和Amy7E進行純化，所得各純化酶液經(jīng)SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖1所示，可見均得到了電泳純的條帶。采用實施例1中酶活測定方法，對各純化酶液的酶學(xué)性質(zhì)進行表征，其最適pH如圖2所示，最適溫度如圖3所示，各酶學(xué)參數(shù)如表I所示?？梢姼鹘囟腆w保留了親本酶的最適PH和最適溫度，但是分別得到了耐溫性提高2.7°C、催化活性提高2.23倍、最適pH降低一個單位的ct-淀粉酶截斷變體。表I純化的截短體α-淀粉酶酶催動力學(xué)參數(shù)卿分i'V:1iiJiSpH*βΙ*農(nóng)氏常數(shù)比沽力+化數(shù):V催化效申.//0C/g,L4/U.Big4g.pmol'.s1L.pmol'.s1Amy7M676206,5653.781694.701,970.52AmyTD466216.5653.693524.972.740.74Aniy7C474446.5656.645472.124.330.65Amy7N474406.5656.584714.673,730.60Amy7E489375,5654,28676.170.550.13a轉(zhuǎn)化數(shù)用在測定條件下每μmolα-淀粉酶在每秒鐘內(nèi)催化降解可溶性淀粉的質(zhì)量表示，單位為g.μπιοΓ1.s—1。實施例5本實施例說明金屬離子和EDTA對各截斷體α-淀粉酶的影響采用實施例1中5、金屬離子和EDTA的影響測定方法，測定的各截斷體α_淀粉酶受金屬離子和EDTA的影響結(jié)果如表2所示。從表2可見，各截斷體α-淀粉酶變體對包括鈣離子在內(nèi)的各金屬離子和EDTA的反應(yīng)基本一致，各α-淀粉酶酶活均不受鈣離子和EDTA的影響。表2金屬離子和EDTA對截短體α-淀粉酶酶活影響Mclalions/EDTAAmyMAmy7DAmyTCAmy7NAmy7EA12(S04)^IOI96106101100MtiCl28886948489SrCl2IDO99101100105CuCl2112111113109IOIMgCl3113114111113108NaCl1001019798106CaCl297959698101FeCi39899IOI9793ΓnKCl10110110199105NiCl2989699100102CoCl2119116124119120FcCI2m80929085ZnSO4961008410198ImMEDTA100.599.299.699,590.710mMEDTA98298.19L1105.993,350mMEDTA98.410097.898,593.1100mMEDTA96J98.297J96.5103JF(twotailed)30.210.090J60,960.1Pvalue(One-wayANOVA)h_0.3626_實施例6本實施例說明截斷體α-淀粉酶在水解淀粉上的應(yīng)用及產(chǎn)物譜的HPLC檢測[0124]對制備于50mmol/L磷酸-檸檬酸緩沖液中的(pH6.5)中的1%可溶性馬鈴薯淀粉(質(zhì)量百分比)進行酶解產(chǎn)物譜分析。取IOg可溶性馬鈴薯淀粉加入少量水調(diào)漿后，加入60mL磷酸-朽1檬酸緩沖液(pH6.5,50mmol/L)中，繼續(xù)煮沸3min,加同樣的緩沖液定容至IOOmL,配制成2%底物溶液。按0.1mg酶/干物質(zhì)的量，向ImL底物溶液中加入實施例3和實施例4所制備的純化的酶液，構(gòu)建含1%淀粉和2U純化酶液(約Iμg/mL)的2mL酶解反應(yīng)體系。反應(yīng)體系于50°C水浴中，溫浴24h。將樣品置于沸水浴中IOmin以終止酶反應(yīng)，于4°C，12000r/min離心5min,上清液通過0.22μm濾膜過濾,過濾液通過酸柱AminexHPX-87H(Bio-Rad,USA)進行HPLC檢測。檢測條件為，RI溫度50°C，流速0.5mL/min,流動相為5mmol/L硫酸。檢測結(jié)果表明:截斷體α_淀粉酶水解可溶性淀粉的終產(chǎn)物最大部分主要有葡萄糖(DPI)和麥芽糖(DP2)組成，除Amy7E的最大組份為麥芽糖，且兩者所占比例約為60%外，其他變體α-淀粉酶的最大組份均為葡萄糖，且DPl和DP2占到所有組成的80%左右；除具體組份存在一定的差異外，其余包括麥芽三糖(DP3)、麥芽四糖(DP4)和麥芽五糖(DP5)及更高的寡糖含量均很少。具體結(jié)果可見下表3。各變體α-淀粉酶水解淀粉生成包括DPl和DP2在內(nèi)的高比例的低分子量多糖的特性，在生產(chǎn)淀粉糖類及麥芽糊精的應(yīng)用中具有優(yōu)勢。表3純化的截短體α-淀粉酶降解可溶性淀粉產(chǎn)物短鏈終產(chǎn)物組份實施例7本實施例說明截斷體α-淀粉酶在新型糊化、液化和糖化工藝上的應(yīng)用對制備于天然水溶液中的1%可溶性淀粉(質(zhì)量百分比)在65°C條件下進行同步糊化和液化的酶解產(chǎn)物進行分析。取30g馬鈴薯可溶性淀粉加入蒸餾水調(diào)制為質(zhì)量百分比為3%的淀粉漿，按照0.03mg酶/g干物質(zhì)的量，向淀粉漿中加入實施例3和實施例4所制備的純化的酶液，進行同步糊化液化實驗。在與上述相同的3%可溶性淀粉中、同時加入0.03mg酶/g干物質(zhì)的量的截斷體α-淀粉酶酶液和0.02mg酶/g干物質(zhì)的量的糖化酶AMG(諾維信公司)，構(gòu)建同步糊化液化糖化實驗體系。同時設(shè)置一個僅含有3%可溶性淀粉漿的糊化對照實驗，和一個在3%可溶性淀粉漿按照0.5mg糖化酶AMG/g干物質(zhì)的量添加過量糖化酶進行對照試驗。將所構(gòu)建反應(yīng)體系置于65°C水浴搖床中溫浴3h，攪拌速度為150r/min。分別于0h、0.5h、lh、2h和3h時取2mL反應(yīng)液樣品，于4°C，12000r/min離心5min，上清液通過0.22μm濾膜過濾，取20μL過濾液通過酸柱AminexΗΡΧ-87Η(Bio-Rad，USA)進行HPLC檢測。檢測條件為，RI溫度50°C，流速0.5mL/min，流動相為5mmol/L硫酸。實驗結(jié)果如下圖4所示，其中圖4A為糊化實驗、圖4B為同步糊化液化實驗、圖4C為同步糊化液化糖化實驗、圖4D為同步糊化糖化對照試驗。可見，可溶性淀粉在65°C可以實現(xiàn)逐步的糊化，如圖4A所示；截斷體α-淀粉酶在65°C左右，可以將pH4.5左右的天然淀粉漿實現(xiàn)同步糊化和液化，生成主要組成為糊精和低分子量的聚麥芽糖，如圖4B所示；與糖化酶AMG結(jié)合使用，在pH4.5、65°C可以實現(xiàn)同步糊化液化糖化發(fā)酵，如圖4C所示。權(quán)利要求1.一種α-淀粉酶截斷體，其特征在于:截取了枯草芽孢桿菌CN7α-淀粉酶45_467位氨基酸組成的肽段，并在C端融合一個人工合成肽，該α-淀粉酶截斷體的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示。2.一種編碼權(quán)利要求1所述的α-淀粉酶截斷體的基因，其核苷酸序列組成如SEQIDNO:18所示。3.—種表達(dá)載體,其特征在于:包含權(quán)利要求2中所述的基因。4.一種宿主細(xì)胞，其特征在于:包含權(quán)利要求3中所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。5.權(quán)利要求1所述的α-淀粉酶截斷體在淀粉降解和含淀粉材料的處理中的應(yīng)用。6.權(quán)利要求1所述的α-淀粉酶截斷體在淀粉工業(yè)中新型糊化、液化和糖化新工藝的開發(fā)中的應(yīng)用?！＠?淀粉酶截斷體及其應(yīng)用，涉及一種耐溫性和催化活性同時改善的有意義α-淀粉酶變體，其特征在于截取枯草芽孢桿菌CN7α-淀粉酶的45-467氨基酸肽段，并在C端融合一段人工合成肽，該變體α-淀粉酶相對于親本α-淀粉酶分別將耐溫性提高2.7°C、催化活性提高2.23倍，變體α-淀粉酶比親本α-淀粉酶更有利于淀粉工業(yè)的工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號C12R1/125GKCN102719418B發(fā)布類型授權(quán)專利申請?zhí)朇N201210079326公開日2013年9月11日申請日期2012年3月23日發(fā)明者王成華,黃日波,王青艷,申乃坤,陳東,黎貞崇,黃志民申請人:廣西科學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan專利引用(1),非專利引用(4),